In vitro Test de thrombose pour les dispositifs d’assistance ventriculaire

Nous présentons un protocole de paillasse pour induire une thrombose dans des dispositifs d’assistance ventriculaire (DAV) au sein d’une plate-forme de test en recirculation. Cette méthode sert à identifier les points chauds thrombogènes dans le flux sanguin et peut aider à améliorer la thromborésistance avant les tests précliniques sur des modèles animaux.

Le risque de thrombose reste une préoccupation importante dans le développement et l’utilisation clinique des dispositifs d’assistance ventriculaire (DAV). Les évaluations traditionnelles de la thrombogénicité de la DAV, principalement par le biais d’études animales, sont coûteuses et prennent du temps, soulèvent des préoccupations éthiques et, en fin de compte, peuvent ne pas refléter avec précision les résultats humains. Pour remédier à ces limites, nous avons développé un protocole de test in vitro agressif conçu pour provoquer une thrombose et identifier les zones potentiellement à haut risque dans la voie du flux sanguin. Ce protocole, motivé par les travaux de Maruyama et al., utilise une stratégie d’anticoagulation modifiée et utilise des composants facilement disponibles, ce qui le rend accessible à la plupart des laboratoires effectuant des tests sanguins in vitro des DAV. Nous avons démontré l’utilité de cette méthode par des tests itératifs et le perfectionnement d’un DAV pédiatrique miniature à lévitation magnétique (PediaFlow PF5). La méthode s’est avérée efficace pour identifier les points chauds thrombogènes causés par des défauts de conception et de fabrication dans les premiers prototypes de DAV, ce qui a permis d’apporter des améliorations ciblées avant de passer à des études animales. Malgré ses limites, notamment l’absence de flux pulsatile et l’influence des caractéristiques du sang du donneur, ce protocole sert d’outil pratique pour le développement précoce de la DAV et l’atténuation des risques.

Les dispositifs d’assistance ventriculaire (DAV) sont devenus une norme de soins dans la prise en charge des patients atteints d’insuffisance cardiaque avancée, mais le risque de thrombose et d’accident vasculaire cérébral reste un défi important ^1,2. La thrombose au sein des DAV est généralement évaluée au cours d’études précliniques sur des animaux, qui, bien que précieuses, présentent des coûts et des défis logistiques substantiels. Ces études sont gourmandes en ressources, prennent du temps et sont susceptibles d’être défectueuses d’un seul défaut, ce qui compromet l’ensemble de l’essai et nécessite des essais supplémentaires. Cela augmente non seulement le fardeau financier, mais soulève également des préoccupations éthiques en raison de la nécessité de tests répétés sur les animaux.

Bien qu’il existe de nombreux modèles numériques pour prédire le dépôt de plaquettes et la thrombose 3,4,5,6, seuls quelques-uns conviennent pour simuler la formation de thrombus dans des dispositifs à grande échelle tels que les DAV ^7,8,9. De plus, les modèles existants supposent inévitablement des surfaces idéalisées et des géométries « étanches » simplifiées, qui ne reflètent pas avec précision les complexités et les imperfections des assemblages de pompes du monde réel. Lorsque les interactions plaquettes-surface sont prises en compte, ces modèles à macro-échelle utilisent généralement des propriétés de matériau uniformément prescrites (généralement modélisées sous la forme d’un coefficient dans les conditions limites de flux de surface)10,11,12. Par conséquent, les modèles numériques ne peuvent pas remplacer complètement les tests expérimentaux avec du sang.

Le choix du matériau et la finition de surface jouent tous deux un rôle essentiel dans l’adhérence plaquettaire sur les surfaces VAD 13,14,15,16,17. Des imperfections telles que des rugosités ou des irrégularités peuvent favoriser l’adhésion des plaquettes et la formation de thrombus. De plus, les crevasses entre les composants de la voie d’écoulement peuvent servir de nidus pour la thrombose, fournissant des environnements protégés où des caillots peuvent se former et se développer^18,19. L’utilisation de graisse, de lubrifiants ou de produits d’étanchéité lors de l’assemblage peut également présenter un risque, car ces substances peuvent s’infiltrer dans la voie d’écoulement et interagir avec le sang, ce qui augmente encore le risque de complications.

Il est donc nécessaire de disposer d’un protocole de test in vitro bien défini capable d’évaluer de manière fiable la thromborésistance des DAV avant qu’ils ne soient soumis à des tests sur des animaux ou à une utilisation clinique. Bien qu’il existe une norme ASTM largement adoptée pour l’évaluation de l’hémolyse²⁰, il n’existe aucune norme de ce type pour les tests de thrombogénicité des DAV dans des conditions de fonctionnement cliniquement pertinentes²¹. Malgré des études fondamentales datant de trois décennies démontrant la faisabilité des tests de thrombose in vitro pour les pompes à sang 22,23,24,25, l’expérimentation animale a persisté comme pratique de facto pour évaluer la thrombose à ce jour ²⁶. L’obstacle à l’adoption plus large des méthodes in vitro a probablement été la nature complexe de la coagulation, avec la multitude de facteurs confondants qui peuvent influencer les résultats des tests, ce qui rend difficile la différenciation de la thrombogénicité intrinsèque de la pompe des artefacts résultant de limitations méthodologiques et d’erreurs de procédure.

Cela nous a motivés à partager un protocole détaillé comme guide pour les expérimentateurs afin d’éviter les pièges, favorisant ainsi l’utilisation des tests in vitro et atténuant la dépendance aux études animales. Le protocole décrit ici, dérivé de Maruyama et ^al.27, a été affiné et validé lors de la conception de la 5^e génération de PediaFlow (PF5) VAD^{pédiatrique 28,29}. Cette méthode d’essai s’est avérée déterminante pour identifier et traiter systématiquement les risques thrombogènes potentiels dans les prototypes de DAV avant les tests sur les animaux.

Le sang total ovin utilisé dans cette étude a été obtenu auprès d’un vendeur commercial et, par conséquent, n’a pas nécessité d’examen par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Cornell.

1. Construction de la boucle d’écoulement d’essai

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour une liste détaillée des composants de boucle et de tous les autres matériaux utilisés dans ce protocole.

1. Modifiez le sac intraveineux (IV).
   1. Utilisez une thermosoudeuse en plastique pour modifier un sac IV afin d’ajuster son volume et sa forme, comme illustré à la figure 1.
      REMARQUE : La forme du sac facilite la désaération et permet de serrer le sac avec un hémostat sur la ligne de fluide ^30,31. L’emplacement de la ligne d’étanchéité est choisi en fonction du volume d’amorçage du DAV et du tube pour atteindre un volume total d’amorçage de 150 ml.
   2. Introduisez une bouche d’aération en faisant une incision de 4 mm en haut du sac. Insérez un verrou Luer femelle barbelé dans l’incision et scellez le site avec un adhésif en caoutchouc de silicone RTV. Fixez un robinet d’arrêt unidirectionnel à la serrure Luer.
2. Assemblez la boucle d’essai à l’aide du sac IV modifié, du tube en polychlorure de vinyle (PVC), des connecteurs cannelés en polycarbonate et des robinets d’arrêt à 3 voies et à 1 voie, comme illustré à la figure 1.
3. Connectez le manomètre de pression.
   1. Fixez des lignes d’extension de 6 pouces aux orifices de pression d’entrée et de sortie. Fixez un robinet d’arrêt unidirectionnel à l’autre extrémité de la ligne d’extension.
      REMARQUE : Le robinet d’arrêt permet de déconnecter le tube du manomètre pour amorcer la ligne d’extension avec du liquide avant de démarrer la pompe, comme décrit à l’étape 4.3.
   2. Connectez une extrémité de chaque tube de 1/8" de diamètre intérieur (ID) à une barbillon de manomètre et insérez un raccord Luer mâle à l’autre extrémité.
   3. Connectez les raccords Luer mâles aux robinets d’arrêt unidirectionnels. Ouvrez les robinets d’arrêt pour activer les lectures de pression.
4. Appliquez une sonde de débit à ultrasons pour mesurer le débit.
5. Placez une pince Hoffman distale à l’orifice de pression de sortie pour réguler la résistance à l’écoulement.

2. Préparation de la solution de chlorure de calcium (CaCl₂)

1. Dissoudre le CaCl₂ en poudre dans 1 solution saline tamponnée TRIS (pH 7,4) pour préparer une solution à 1 M. Évitez les tampons contenant du phosphate (par exemple, PBS ou DPBS), car le calcium et le phosphate réagissent pour former un précipité insoluble.
2. Si vous préparez du CaCl₂ en grande quantité, ajoutez la poudre de CaCl₂ progressivement en plusieurs étapes, car sa dissolution est un processus exothermique.
3. Ajustez le pH de la solution à 6-8 en utilisant de l’acide chlorhydrique (HCl) ou de l’hydroxyde de sodium (NaOH) si nécessaire.

3. Préparation du sang

REMARQUE : Le sang d’ovin utilisé dans cette étude a été obtenu auprès d’un fournisseur commercial dont le nom figure dans la table des matières. Le sang a été prélevé à l’aide d’une aiguille 14-G, l’animal étant immobilisé dans une position debout agricole standard. Le processus de collecte a pris 10 à 12 minutes entre l’insertion de l’aiguille et la fin. Le sang a été anticoagulé avec 14 parties de CPD pour 86 parties de sang (formulation CPD : 26,3 g/L de Na-citrate, 25,2 g de dextrose, 3 g/L d’acide citrique et 2,2 g/L de Na phosphate dans de l’eau désionisée). La poche de sang a été expédiée pendant la nuit dans un conteneur isotherme avec des blocs réfrigérants et a été utilisée pour l’expérience dans les 24 heures suivant la collecte.

1. Préparez le sang du donneur pour l’utilisation.
   1. Placez la poche de sang sur une plate-forme basculante pendant 15 à 30 minutes pour mélanger doucement le sang et lui permettre d’atteindre la température ambiante (RT).
   2. Placez une barre d’agitation magnétique dans un bécher en polycarbonate ou un récipient conçu pour le transfert de sang.
   3. Transférez le sang dans le bécher à travers un filtre de transfusion pour éliminer les macroagrégats. Manipulez le sang avec précaution pour éviter d’endommager les composants cellulaires. Versez le sang le long des parois du récipient pour éviter la chute libre et minimiser les traumatismes cellulaires.
      REMARQUE : Jetez le sang si de gros thrombus sont présents ou si le filtre se bouche.
   4. Placez le bécher ou le récipient sur un agitateur magnétique et ajustez la vitesse jusqu’à ce que la surface du sang commence à tourner doucement sans former un gros vortex. Remuez continuellement pendant au moins 5 min.
   5. Mesurez l’hématocrite et le nombre de plaquettes pour vous assurer que les valeurs se situent dans la plage normale pour l’espèce.
2. Effectuer des titrages pour déterminer la concentration cible de CaCl₂ .
   REMARQUE : Le sang citraté est recalcifié pour permettre les tests de coagulation et de thrombose, avec de l’héparine ajoutée pour éviter l’emballement de la coagulation. Le temps de coagulation activé cible (ACT) pour le début de l’essai est de 300 s. Veuillez noter que les valeurs ACT de référence fournies dans cette section ont été obtenues à partir de sang de mouton de donneur et peuvent varier en fonction de l’espèce et du niveau d’anticoagulation utilisé lors du prélèvement. De plus, les mesures de l’ACT peuvent varier entre les instruments^{32, 33 et 34}. Il peut être nécessaire de faire quelques essais et erreurs pour établir la plage ACT optimale pour une configuration de laboratoire spécifique.
   1. Transvaser 2 mL de la solution préparée de 1 M CaCl₂ et 0,5 mL d’héparine sodique (1000 U/mL) de l’emballage du fabricant dans des tubes de microcentrifugation pour éviter la contamination des solutions mères.
   2. Transvasez 10 ml de sang dans des tubes à essai en polypropylène de 14 ml. Préparez quatre tubes de ce type.
   3. Pour atteindre une concentration d’héparine de 0,5 U/mL dans le sang, ajoutez 5 μL d’héparine sodique à l’échantillon de sang de 10 mL.
   4. Pour obtenir une concentration de calcium de 5 mM dans le sang, ajoutez 50 μL de solution de 1 M de CaCl₂ à l’échantillon de sang de 10 mL. Pendant la distribution, faites tourner la pointe de la pipette pour répartir le CaCl₂ sur une zone plus large.
   5. Immédiatement, retournez le tube 10 fois, roulez-le horizontalement (sur une surface plane ou entre les paumes), puis retournez-le 10 fois de plus pour assurer un mélange complet.
   6. Mesurez l’ACT à l’aide d’un système de coagulation du sang total au point de service en suivant les instructions du fabricant. L’ACT initial se situe généralement entre 400 et 500 s.
   7. Tout en maintenant la concentration d’héparine constante, augmentez la concentration de CaCl₂ (à environ 7-8 mM) pour obtenir un ACT de 300 s.
   8. Vérifiez la concentration finale et l’ACT résultant dans un tube de sang séparé.

4. Procédures de pré-test

REMARQUE : Toutes les étapes décrites dans cette section s’appliquent aux sections 5 et 6. Effectuez ces étapes avant d’actionner la pompe avec de l’albumine sérique bovine (BSA) ou du sang dans la boucle. Transférez le sang entre les vaisseaux en utilisant l’alimentation par gravité pour minimiser les contraintes mécaniques. Évitez d’utiliser le piston de la seringue pour faire circuler le sang, car cela peut créer une pression excessive. De plus, évitez d’étrangler le sang à travers des ouvertures étroites pour éviter d’endommager les composants cellulaires.

1. Remplissage et vidange de la boucle d’essai
   1. Fixez une rallonge de 30 pouces à l’orifice d’injection et connectez un corps de seringue de 60 ml comme un entonnoir. Ouvrez le robinet d’arrêt du réservoir pour qu’il fasse office de bouche d’aération.
   2. Versez le liquide dans l’entonnoir, en le soulevant au besoin pour accélérer le limage. Remplissez la boucle jusqu’à 1 à 2 cm sous la bouche d’aération en haut du sac. Fermez les robinets de la bouche d’aération et de l’orifice d’injection.
   3. Pour vidanger, ouvrez les robinets de la bouche d’aération et de l’orifice d’injection et abaissez l’entonnoir sous le niveau de la paillasse. Soulevez la pompe au-dessus de l’orifice de drainage pour évacuer le liquide restant.
2. Désaération de la boucle d’essai
   REMARQUE : Effectuez cette procédure lors du remplissage de la boucle avec du BSA ou du sang avant de démarrer la pompe.
   1. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’air emprisonné dans la boucle. Délogez les bulles d’air sur les surfaces en tapotant et en pressant doucement le tube et le réservoir.
   2. Si vous évaluez une pompe sanguine à flux axial, faites-la pivoter en position verticale pour libérer l’air par flottabilité. Si vous utilisez une pompe centrifuge, retournez-la et faites-la pivoter pour vous assurer qu’aucun air n’est emprisonné dans les voies d’écoulement secondaires.
   3. Inspectez de près les sections horizontales des tubes et les jonctions entre les tubes et les connecteurs pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air.
   4. Pressez le sac IV pour rapprocher le niveau de liquide de la partie étroite supérieure et fixez le sac avec un hémostat sur la conduite de fluide pour éliminer l’interface fluide-air. Fermez le robinet d’arrêt de la bouche d’aération.
3. Amorçage des conduites de pression et de l’orifice d’échantillonnage
   1. Fermez le robinet d’arrêt à l’extrémité des conduites de pression, retirez le tube du manomètre et fixez une seringue de 3 ml. Ouvrez le robinet d’arrêt et aspirez 1 à 2 ml de liquide dans la ligne d’extension (environ 4 cm).
   2. Fermez le robinet d’arrêt, détachez la seringue et reconnectez le tube du manomètre. Ouvrez le robinet d’arrêt pour activer les lectures de pression.
   3. Amorcez l’orifice d’échantillonnage à l’aide d’une seringue.
4. Nettoyage des orifices d’injection et de prélèvement
   1. Coupez ou déchirez une lingette non pelucheuse en trois fragments égaux. Tournez le coin d’un fragment pour former une pointe et insérez-le dans le port pour absorber tout sang résiduel.
   2. Tournez le deuxième fragment, humidifiez-le avec une solution saline et insérez la pointe humide dans le port. Tournez-le autour du port pour éliminer tout le sang restant.
   3. Utilisez le troisième fragment pour absorber toute solution saline résiduelle dans le port.
      REMARQUE : Effectuez cette procédure de nettoyage immédiatement après avoir prélevé un échantillon de sang ou chaque fois que du sang résiduel est présent dans les ports.

5. Passivation des surfaces en contact avec le sang

1. Remplissez la boucle avec une solution BSA à 1 % et actionnez le VAD pour la faire circuler pendant au moins 30 min.
2. Inspectez la boucle pour détecter les fuites et remontez-la si nécessaire.
3. Égouttez complètement la solution BSA pour éviter l’hémodilution.

6. Test de thrombose

1. Préparez la boucle de test.
   1. Remplissez la boucle avec 150 ml de sang.
   2. Désaérez la boucle et amorcez les conduites de pression et l’orifice d’échantillonnage comme décrit aux étapes 4.2 à 4.4.
   3. Démarrez la pompe à basse vitesse et faites-la fonctionner pendant environ 5 secondes pour déloger les bulles d’air emprisonnées à l’intérieur de la pompe, puis arrêtez la pompe.
   4. Si des bulles apparaissent dans le sac, répétez l’étape 4.2 pour effectuer à nouveau le désaération.
   5. Redémarrez la pompe à basse vitesse pour faire circuler le sang dans la boucle.
2. Ajoutez de l’héparine au sang dans la boucle.
   1. Transvaser 1 mL d’héparine sodique (1000 U/mL) et 1,5 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA ; 0,5 M) de l’emballage du fabricant dans des tubes séparés pour faciliter la manipulation pendant l’essai.
   2. Utilisez l’orifice transversal du robinet d’arrêt à 3 voies pour administrer des substances dans la boucle à l’aide d’une seringue. Tournez le luer lock mâle sur le robinet d’arrêt de sorte que l’orifice d’injection soit orienté vers le haut pour piéger les bulles d’air en haut.
   3. Atteignez une concentration d’héparine de 0,5 U/mL dans la boucle en ajoutant 75 U d’héparine sodique à 150 mL de sang. Aspirez 75 U d’héparine (75 μL si vous utilisez une concentration de 1000 U/mL) dans une micropipette et distribuez-le dans une seringue de 3 ml en distribuant simultanément la pipette et en tirant le piston de la seringue. Assurez-vous que tout le liquide est transféré sans renversement.
   4. Fixez la seringue à l’orifice d’injection à l’aide du verrou Luer, l’orifice vers le haut et l’embout de la seringue pointant verticalement vers le bas. Tirez le piston de la seringue pour le remplir de sang et mélangez l’héparine avec le sang tout en aspirant de l’air dans la seringue. Laissez la bulle d’air remonter vers le haut de la seringue. Injectez le mélange dans la boucle en veillant à ce qu’aucun air n’y pénètre.
   5. Faites entrer et sortir le sang de la seringue 4 à 5 fois pour vous assurer que le sang hépariné ne reste pas confiné à l’espace dans le port. Assurez-vous qu’aucun air ne pénètre dans la boucle.
3. Titrez l’ACT du sang dans l’anse.
   1. Atteindre une concentration initiale de calcium de 5 mM dans l’anse en ajoutant 750 μL de solution de 1 M de CaCl₂ à 150 mL de sang en utilisant la même procédure que l’héparine.
      1. Le sang exposé à des concentrations élevées de calcium peut commencer à coaguler dans la seringue. Injectez rapidement le liquide après avoir éliminé l’air résiduel. En option, diluez le CaCl₂ dans la seringue avec 1 ml de solution saline tamponnée TRIS pour réduire le risque de coagulation prématurée.
   2. Laissez le CaCl₂ injecté circuler dans la boucle pendant au moins 2 minutes avant de prélever un échantillon de sang pour mesurer l’ACT initial.
   3. Fixez une seringue de 1 mL à l’orifice d’échantillonnage. Prélevez et jetez 0,5 mL de sang perdu pour éliminer le sang stagnant de l’orifice.
   4. Fixez une nouvelle seringue de 1 ml, prélevez 0,5 ml de sang pour l’analyse et mesurez l’ACT. Nettoyez l’orifice d’échantillonnage en suivant la procédure décrite à l’étape 4.4.
   5. Reportez-vous aux valeurs de titrage de l’étape 3.2 pour informer la concentration cible de CaCl₂ . Augmentez progressivement la concentration de calcium pour obtenir un ACT de 300 s. Évitez d’ajouter la quantité totale de CaCl₂ en une seule fois pour éviter une coagulation rapide.
      REMARQUE : Dans les essais utilisés dans cette étude, la concentration initiale de calcium de 5 mM a donné un ACT de 450 ± 50 s, et la concentration finale de 7-8 mM a donné un ACT de 300 ± 20 s. Bien que cette réponse puisse varier, essayez de ramener l’ACT à 300 s ou moins pour le début du test.
4. Commencez le test.
   1. Une fois que l’ACT de 300 s est atteint dans la boucle, commencez le test de 1 h. Ajustez la pompe au débit et à la pression souhaités en modifiant la vitesse du rotor et en régulant la résistance à l’aide de la pince Hoffman.
   2. Mesurez l’ACT toutes les 15 minutes en suivant les étapes 6.3.3-6.3.4.
   3. Si l’ACT descend en dessous de 200 s, injectez 25 U supplémentaires d’héparine sodique dans la boucle.
5. Terminez le test.
   1. Au bout de 1 h, injecter de l’EDTA dans l’anse pour inhiber la coagulation, en ciblant une concentration finale de 5 mM dans le sang. (Injecter 1,5 mL si vous utilisez une solution d’EDTA 0,5 M.)
   2. Laissez l’EDTA circuler et mélanger pendant 2 min, puis arrêtez la pompe.
6. Débranchez et rincez la pompe.
   1. Clampez le tube relié à l’entrée et à la sortie de la pompe à l’aide d’hémostats, en positionnant les pinces à 3-4 cm des ardillons d’entrée et de sortie.
   2. Débranchez soigneusement le tube pour libérer la pompe.
   3. Videz le sang de la pompe et de la boucle d’écoulement dans un récipient.
   4. Lavez tout sang résiduel de la pompe par alimentation par gravité ou par pipetage de solution saline à l’entrée et à la sortie de la pompe.
      REMARQUE : Les étapes 6.7 et 6.8 sont exécutées simultanément.
7. Inspectez le chemin d’écoulement de la pompe.
   1. Capturez des images de l’entrée et de la sortie de la pompe à l’aide d’un endoscope/caméra endoscopique.
   2. Démontez la pompe (le cas échéant). Lavez les composants dans un bain salin et inspectez les thrombus à l’aide d’une lunette de dissection ou d’une lentille macro.
   3. Photographier les surfaces en contact avec le sang pour la documentation.
      REMARQUE : Une inspection cohérente et une documentation complète sont essentielles pour les essais comparatifs.
8. Filtrez le sang utilisé.
   1. Coupez un morceau de tissu en maille de nylon de 100 μm assez grand pour couvrir l’ouverture d’un récipient de capture.
   2. Placez le filet sur le récipient avec un léger drapé pour permettre au sang de circuler efficacement. Fixez les bords de la maille pour éviter qu’elle ne glisse lors de la filtration.
   3. Faites passer le sang utilisé à travers une maille en nylon. Éliminer le sang conformément aux directives de l’établissement en matière de gestion des déchets biologiques.
   4. Examinez le treillis à la recherche de thrombus capturés et documentez les résultats.
9. Préparez-vous à l’analyse histologique.
   1. Si une analyse histologique est prévue, corrigez tout thrombus trouvé dans la solution de formol en suivant les procédures de sécurité appropriées.
      ATTENTION : Utilisez toujours une hotte lorsque vous manipulez du formaldéhyde.

7. Procédure de nettoyage

1. Démontez la boucle d’écoulement. Jetez la poche de sang et la tubulure en PVC.
2. Faites tremper tous les autres composants en contact avec le sang (connecteurs, robinets, luer locks, etc.) dans une solution détergente en poudre à 1 % d’enzymes pendant la nuit. Rincer à l’eau tiède du robinet, puis à l’eau DI, et sécher à l’air.
   1. S’il reste des caillots, sonicer les composants dans la solution détergente. Rincez abondamment et séchez à l’air.
3. Nettoyez la pompe.
   1. Si la pompe peut être démontée, trempez et sonicez les composants en contact avec le sang avec une solution nettoyante/dégraissante tout usage à 1 %, suivie d’une solution détergente en poudre active à 1 %.
   2. Si la pompe ne peut pas être démontée, connectez-la à une nouvelle boucle d’écoulement remplie de solutions de nettoyage et faites-la fonctionner à grande vitesse pendant au moins 30 min. Répétez l’opération si nécessaire.
4. Rincez abondamment la pompe avec de l’eau tiède du robinet, puis de l’eau DI, et séchez-la à l’air.

L’exécution réussie de ce protocole permet d’identifier des zones localisées de dépôt plaquettaire, révélant des points problématiques dans le chemin d’écoulement de la pompe. L’application uniforme de ce protocole permet d’apporter des améliorations progressives en s’attaquant à ces « points chauds » identifiés.

Par exemple, lors du développement du VAD PediaFlow PF5, nous avons rencontré des difficultés pour polir manuellement le côté pression des aubes du stator en raison de la taille miniature des composants. Les tests de thrombose in vitro ont mis en évidence ce problème, car le dépôt de plaquettes a été observé de manière constante le long des racines des lames, comme le montre la figure 2A. Un schéma de dépôt similaire a été confirmé plus tard dans une étude animale aiguë, où la pompe a été connectée extracorporellement à la circulation d’un mouton et a fonctionné pendant 3 heures (non détaillé dans cet article). Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé une technique d’électropolissage pour obtenir une finition miroir sur ces composants en titane, ce qui a permis d’éliminer la formation de thrombus dans ces zones (Figure 2B). Cette pompe a ensuite été utilisée dans une étude in vivo de 7 jours chez le mouton, qui a également démontré l’absence de thrombose.

Une autre caractéristique problématique identifiée dans nos prototypes de pompes était la jonction entre les composants du boîtier avant et arrière. Une coaptation imparfaite à cette jonction pourrait créer une crevasse où le sang pourrait s’infiltrer et coaguler, comme le montre la figure 3A. Nous avons testé plusieurs méthodes de rodage et de polissage pour améliorer l’ajustement de ces composants et avons utilisé la méthode de test de thrombose in vitro pour évaluer les résultats. Les améliorations ont été évaluées en réappliquant le protocole, ce qui a confirmé la réduction de la formation de thrombus à la jonction, comme le montre la figure 3B.

Il est crucial de distinguer la thrombose causée par une erreur expérimentale ou un artefact de la formation réelle de caillots dans le dispositif. Plusieurs facteurs peuvent déclencher une coagulation excessive. Lors de l’administration de la solution de CaCl₂ , un petit volume de sang est aspiré dans la seringue pour aspirer l’air emprisonné dans l’orifice, comme décrit à l’étape 6.3.1. Si ce sang reste exposé trop longtemps à une concentration élevée de CaCl₂ , il peut commencer à coaguler prématurément. Lorsqu’il est ensuite injecté dans l’anse, ce sang coagulé peut agir comme un nidus pour la croissance ultérieure du caillot, potentiellement ingéré dans le DAV. La figure 4 montre un gros thrombus qui a probablement été ingéré dans une pompe centrifuge à suscept magnétique, obstruant la voie d’écoulement.

L’injection d’un grand volume de CaCl₂ à la fois peut déclencher une coagulation incontrôlée. Pour éviter cela, il est recommandé d’augmenter d’abord la concentration de CaCl₂ dans la boucle à 5 mM, de vérifier l’ACT, puis de procéder à une deuxième dose pour atteindre l’ACT cible.

Les caillots sphériques et faiblement adhérents observés sur les surfaces sont souvent le résultat de bulles d’air encapsulées dans des caillots, dont des exemples sont illustrés aux figures 5A, B. Ces caillots en circulation peuvent empiéter sur les bords d’attaque des pales de la roue et du stator, créant des dépôts qui ressemblent à des taches d’insectes sur le pare-brise d’une voiture. Cela souligne l’importance de la désaération complète de la boucle en tant qu’étape critique du protocole. De même, tout corps étranger et débris circulant dans la boucle peuvent être encapsulés dans des thrombus et adhérer aux surfaces de la pompe, comme le montrent les figures 5C et D.

À l’inverse, la présence de thrombus en anneau aux jonctions tubulaire-connecteur, comme le montre la figure 6, indique généralement que l’ACT se situait dans une plage optimale qui favorisait la coagulation localisée sans dégénérer en coagulation incontrôlée. Les jonctions tubulures-connecteurs sont connues pour être la région la plus thrombogène des circuits ECMO³⁵. D’après notre expérience, cette plage ACT optimale est comprise entre 200 s et 300 s. Si l’ACT pendant les expériences tombe en dessous de 200 s, un bolus d’héparine supplémentaire de 25 U peut être injecté dans la boucle.

En évitant les pièges décrits ci-dessus et en assurant une exécution cohérente du protocole, on maximisera son utilité dans l’identification des risques thrombogènes potentiels dès le début du processus de développement de la DAV, ce qui permettra d’apporter des améliorations ciblées avant de passer aux études animales.

Figure 1 : Schéma de la boucle d’écoulement d’essai. (A) Boucle d’écoulement d’essai pour une pompe avec des barbes d’entrée et de sortie de 1/4 » et (B) pour une pompe avec des barbes d’entrée et de sortie de 3/8 ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Amélioration itérative et évaluation des prototypes de DAV à l’aide du protocole de thrombose in vitro. (A) Le dépôt de plaquettes a été observé de manière cohérente le long des racines des aubes du stator dans la version polie manuellement de la pompe. (B) Ce problème a été résolu dans la version électropolie. Dans les deux essais, l’ACT a été maintenu entre 250 s et 300 s, et la pompe a fonctionné à 2,5 L/min pendant 1 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Le protocole de thrombose in vitro a été utilisé pour résoudre le problème de l’ajustement imparfait entre les composants d’accouplement du corps de pompe. (A) La conception de base souffrait d’une coaptation imparfaite à cette jonction, entraînant une accumulation de sang et une coagulation dans cet espace. Encadré : le caillot résultant, extrait et étiré entre deux cotons-tiges. (B) Une conception révisée avec un montage amélioré a éliminé ce problème. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Un grand thrombus obstruant le chemin d’écoulement d’une pompe maglev centrifuge, résultant probablement d’une erreur expérimentale lors de l’injection de CaCl₂ dans la boucle d’écoulement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Caillots faiblement adhérents, corps étrangers et débris. (A,B) Les caillots sphériques et faiblement adhérents observés sur les surfaces sont souvent le résultat de bulles d’air encapsulées dans des caillots. (C, D) Tout corps étranger et débris circulant dans la boucle peut être encapsulé dans des thrombus qui adhèrent aux surfaces de la pompe ou empiètent sur les bords d’attaque (LE) des pales de la roue et du stator. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Thrombus annulaire. (A) Un thrombus annulaire formé à la jonction tubulaire-connecteur. (B) Le thrombus annulaire disposé à côté d’une lame de rasoir en acier inoxydable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le premier essai chez l’homme d’une nouvelle pompe est toujours une entreprise précaire, car les études précliniques ne peuvent pas prédire de manière fiable la thrombogénicité des DAV chez l’homme²⁶. Notamment, certains DAV qui ont démontré l’absence de thrombose dans les essais sur les animaux ont par la suite montré une thrombogénicité significative lors d’une utilisation clinique³⁶. Un régime de test in vitro agressif spécialement conçu pour provoquer une thrombose offre une occasion précieuse d’identifier les défauts potentiels de conception ou de fabrication dès le début du processus de développement. Bien que ce protocole ne puisse pas offrir une prédiction définitive des performances futures in vivo d’un DAV, cette approche proactive peut révéler des points chauds potentiels de thrombose qui peuvent émerger dans des conditions de procoagulation.

Les méthodes in vitro existantes pour la thrombose de la DAV varient considérablement en termes de durée d’examen et de stratégies d’anticoagulation. Hastings et al. ont effectué des tests avec du sang porcin hautement hépariné sur une période de 48 heures, reproduisant avec succès les schémas de thrombose observés cliniquement dans les pompes ECMO³⁷. En revanche, des études pionnières menées par Schima et al. ont utilisé la protamine pour abaisser l’ACT du sang hépariné à 3 fois sa valeur de base au début du test, mettant fin à l’expérience lorsque l’ACT est tombé à 1,5 fois la valeur de base²³. Cette approche novatrice a condensé des études in vivo typiques de 2 à 3 jours en seulement 1 h à 3 h de tests in vitro .

Maruyama et al. ont systématiquement comparé l’utilisation des complexes citrate-calcium et héparine-protamine pour les tests de thrombose, où du chlorure de calcium est ajouté pour inverser l’action du citrate, et du sulfate de protamine est utilisé pour neutraliser l’héparine²⁷. Ils ont conclu que la recalcification du sang citrated procurait une réponse ACT plus progressive et monotone. En utilisant le complexe citrate-calcium, Maruyama et ses collègues ont obtenu un contrôle précis de l’ACT, le maintenant à 200 s tout au long d’un test de 2 heures. Leur étude in vitro comparant plusieurs prototypes de pompes a reproduit efficacement les schémas de thrombose observés dans les études animales.

Bien que le protocole décrit ici soit largement basé sur la méthode de Maruyama, nous avons cherché à éliminer deux obstacles clés à son accessibilité plus large. Tout d’abord, l’étude de Maruyama a utilisé des composants de boucle d’écoulement bioactifs enrobés d’héparine, qui peuvent être coûteux et difficiles à obtenir. Nous avons simplifié l’approche en ajoutant directement une quantité fixe d’héparine dans le sang et en utilisant des composants de boucle de test facilement disponibles auprès de fournisseurs courants. Deuxièmement, leur méthode nécessitait de multiples injections de chlorure de calcium et de citrate trisodique tout au long du test pour maintenir un ACT constant. En revanche, ce protocole lance les tests à un ACT plus élevé et évite d’avoir à procéder à des ajustements continus, réduisant ainsi la complexité et le risque d’erreurs de procédure. Ces adaptations rendent le protocole de cette étude plus accessible à la plupart des laboratoires effectuant des tests sanguins in vitro de DAV.

Bien que ce protocole s’attaque à des obstacles techniques clés, son succès et son utilité finale dépendent toujours de l’exécution minutieuse et cohérente de chaque étape expérimentale. Un aspect essentiel de ce protocole est la désaération complète de la boucle et la méthode minutieuse d’injection de substances dans le circuit sans générer d’embolie d’air. L’échec dans l’un ou l’autre de ces domaines pourrait introduire des artefacts qui pourraient fausser les résultats en induisant une thrombose excessive.

Il est essentiel qu’aucune bulle d’air et interface air-sang ne soit présente dans la boucle avant de commencer le test. Toutes les bulles d’air circulant dans la boucle peuvent s’encapsuler dans des caillots et se déposer très probablement sur les bords d’attaque des pales de la roue et du stator. La conduite de pression côté entrée présente le plus grand risque d’introduction d’air en raison de la faible pression créée en amont de l’entrée de la pompe. Lors du démarrage de la pompe et de l’augmentation de sa vitesse, la colonne d’air dans la conduite de pression sera aspirée dans le flux. Pour éviter cela, les conduites de pression sont pré-amorcées avec de la BSA ou du sang, comme indiqué à l’étape 4.3. Bien que la désaération soit particulièrement importante lorsque vous travaillez avec du sang, nous recommandons également de la désaérer avant de faire circuler la BSA. Cette précaution est nécessaire car l’ingestion et la désintégration d’embolies gazeuses importantes peuvent produire de la mousse qui peut persister après la vidange de la solution BSA et potentiellement interférer avec les tests ultérieurs.

La méthode d’injection des solutions d’héparine et de CaCl₂ exige une technique précise et une exécution soignée, car les rinçages répétés de la seringue augmentent le risque d’introduction d’emboles d’air. L’incorporation d’une seringue motorisée programmée pour distribuer des volumes précis de substances pourrait être envisagée pour atténuer ce risque. Un tel appareil permettrait également une injection continue d’héparine pendant le test, calibrée pour maintenir l’ACT à un niveau constant, réduisant ainsi la variabilité causée par les changements de la dynamique de la coagulation au fil du temps.

Cette méthode comporte des limites, en particulier les conditions d’équilibre in vitro, qui diffèrent des conditions d’écoulement pulsatile in vivo. Bien qu’il existe des boucles in vitro pulsatiles, elles nécessitent un plus grand nombre de composants, ce qui ajoute de la complexité et peut potentiellement introduire des artefacts.

Un autre aspect notable de ce protocole est que les tests ont été effectués à température ambiante plutôt qu’à la température physiologique de 37 °C. Alors que la température physiologique imiterait mieux les conditions in vivo , il était difficile de placer la boucle d’écoulement dans une chambre chauffée et de maintenir 37 °C de manière constante en raison de la nécessité d’accéder fréquemment à la boucle d’écoulement pendant les expériences. L’immersion du réservoir de sang dans un bain d’eau chauffée a également été envisagée ; Cependant, cette approche était incompatible avec la configuration actuelle de la boucle verticale, qui minimise les artefacts expérimentaux en facilitant le transport des bulles d’air vers le haut du réservoir de sang.

De plus, l’étude de Patel et al. a évalué l’impact de la température sur les tests de thrombose in vitro avec du sang d’ovins et de bovins³⁸. Leurs résultats suggèrent que les tests à température ambiante offrent une meilleure sensibilité par rapport aux tests à 37 °C et permettent des durées de test plus courtes (1 h contre 2 h). Compte tenu de l’avantage supplémentaire de l’élimination des équipements de chauffage encombrants, ils proposent que les tests à température ambiante soient une option viable et pratique pour l’évaluation in vitro de la thrombogénicité des biomatériaux.

Ce protocole repose sur la détection visuelle de la formation de thrombus, ce qui le rend particulièrement adapté aux DAV à boîtier transparent ou amovible. Pour les dispositifs dotés de boîtiers permanents et opaques, l’inspection directe du dépôt de thrombus est plus difficile sans compromettre l’intégrité structurelle du dispositif. Dans de tels cas, l’utilisation de caméras à fibre optique flexibles peut fournir une solution partielle, permettant une inspection interne limitée.

Enfin, des facteurs tels que le choix de l’espèce de donneur, la méthode de prélèvement, le type d’anticoagulant utilisé et l’âge du sang peuvent tous influencer la réponse thrombogénique. Les concentrations d’héparine et de calcium fournies dans ce protocole sont des valeurs de référence spécifiques au dispositif utilisé dans cette étude. De plus, les mesures de l’ACT peuvent varier entre différents instruments 32,33,34. En tant que tel, ce protocole peut nécessiter des ajustements précis par essais et erreurs pour déterminer la plage ACT optimale pour une configuration de laboratoire donnée.

Afin d’améliorer encore la cohérence entre les expériences, les études futures pourraient intégrer des éléments du test ASTM F2888-19 comme mesure de contrôle, en utilisant le sang recalcifié de l’étape de titrage pour l’évaluation simultanée de la thrombogénicité dans les matériaux de référence^39,40. Cette approche réduirait la dépendance à l’égard de l’obtention d’un ACT normalisé, car cette mesure peut ne pas tenir pleinement compte des variations de coagulabilité résultant de différences dans les propriétés sanguines telles que l’hématocrite, la numération plaquettaire et la concentration totale en protéines.

Malgré ces limites, cette méthode de test reste un outil précieux pour l’identification précoce des risques thrombogènes lors du développement de DAV et offre une approche pratique et accessible pour améliorer de manière itérative la sécurité des dispositifs avant de passer aux études animales.

S.E.O. est actuellement consultant pour Magenta Medical et était auparavant consultant chez Boston Scientific. Aucun autre auteur n’a de divulgation financière pertinente ou de conflit d’intérêts à signaler.

Ce travail a été soutenu par la subvention des National Institutes of Health R01HL089456 et le projet d’activité d’acquisition de recherche médicale de l’armée américaine numéro W81XWH2010387.