In vitro Thrombosetest für Herzunterstützungssysteme

Wir stellen ein Tischprotokoll zur Induktion von Thrombosen in ventrikulären Unterstützungssystemen (VAD) innerhalb einer rezirkulierenden Testplattform vor. Diese Methode dient der Identifizierung thrombogener Hotspots im Blutflussweg und kann dazu beitragen, die Thromboresistenz im Vorfeld präklinischer Tests im Tiermodell zu verbessern.

Das Thromboserisiko ist nach wie vor ein großes Problem bei der Entwicklung und dem klinischen Einsatz von ventrikulären Unterstützungssystemen (VADs). Traditionelle Bewertungen der VAD-Thrombogenität, hauptsächlich durch Tierversuche, sind kostspielig und zeitaufwändig, werfen ethische Bedenken auf und spiegeln letztendlich möglicherweise die Ergebnisse beim Menschen nicht genau wider. Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein aggressives In-vitro-Testprotokoll entwickelt, das darauf ausgelegt ist, Thrombosen zu provozieren und potenzielle Hochrisikobereiche innerhalb des Blutflusses zu identifizieren. Dieses Protokoll, das durch die Arbeit von Maruyama et al. motiviert wurde, verwendet eine modifizierte Antikoagulationsstrategie und verwendet leicht verfügbare Komponenten, wodurch es für die meisten Laboratorien zugänglich ist, die In-vitro-Bluttests von VADs durchführen. Wir haben die Nützlichkeit dieser Methode durch iteratives Testen und Verfeinern eines magnetisch schwebenden pädiatrischen Miniatur-VAD (PediaFlow PF5) demonstriert. Die Methode hat sich als wirksam bei der Identifizierung thrombogener Hotspots erwiesen, die durch Design- und Herstellungsfehler in frühen VAD-Prototypen verursacht wurden, und ermöglichte gezielte Verbesserungen, bevor sie in Tierversuche übergingen. Trotz seiner Einschränkungen, einschließlich des Fehlens eines pulsierenden Flusses und des Einflusses der Eigenschaften des Spenderblutes, dient dieses Protokoll als praktisches Instrument für die Entwicklung von VAD in der Frühphase und die Risikominderung.

Ventrikuläre Unterstützungssysteme (VADs) sind zu einem Standard bei der Behandlung von Patienten mit fortgeschrittener Herzinsuffizienz geworden, doch das Risiko von Thrombosen und Schlaganfällen bleibt eine große Herausforderung ^1,2. Thrombosen bei VADs werden in der Regel im Rahmen präklinischer Tierversuche untersucht, die zwar wertvoll sind, aber erhebliche Kosten und logistische Herausforderungen mit sich bringen. Diese Studien sind ressourcenintensiv, zeitaufwändig und anfällig für einen einzigen Fehler, der den gesamten Test beeinträchtigt und zusätzliche Versuche erforderlich macht. Dies erhöht nicht nur die finanzielle Belastung, sondern wirft auch ethische Bedenken auf, da wiederholte Tierversuche erforderlich sind.

Obwohl es viele numerische Modelle zur Vorhersage von Thrombozytenablagerungen und Thrombosen gibt 3,4,5,6, eignen sich nur wenige für die Simulation der Thrombusbildung in makroskaligen Geräten wie VADs ^7,8,9. Darüber hinaus gehen bestehende Modelle unweigerlich von idealisierten Oberflächen und vereinfachten "wasserdichten" Geometrien aus, die die Komplexität und Unvollkommenheit realer Pumpenbaugruppen nicht genau widerspiegeln. Wenn Thrombozyten-Oberflächen-Wechselwirkungen berücksichtigt werden, verwenden diese Makroskalenmodelle im Allgemeinen einheitlich vorgeschriebene Materialeigenschaften (typischerweise als Koeffizient in den Randbedingungen des Oberflächenflusses modelliert)10,11,12. Numerische Modelle können daher die experimentelle Untersuchung mit Blut nicht vollständig ersetzen.

Sowohl die Materialwahl als auch die Oberflächenbeschaffenheit spielen eine entscheidende Rolle bei der Thrombozytenadhäsion auf VAD-Oberflächen 13,14,15,16,17. Unvollkommenheiten wie raue Stellen oder Unregelmäßigkeiten können die Blutplättchenadhäsion und die Thrombusbildung begünstigen. Darüber hinaus können Spalten zwischen Komponenten im Fließweg als Nidus für Thrombosen dienen und eine geschützte Umgebung bieten, in der sich Gerinnsel bilden und wachsen können^18,19. Auch die Verwendung von Fetten, Schmier- oder Dichtstoffen während der Montage kann ein Risiko darstellen, da diese Substanzen in den Fließweg sickern und mit dem Blut interagieren können, was das Risiko von Komplikationen weiter erhöht.

Daher besteht ein Bedarf an einem klar definierten In-vitro-Testprotokoll, mit dem die Thromboresistenz von VADs zuverlässig beurteilt werden kann, bevor sie Tierversuchen oder klinischer Anwendung unterzogen werden. Während es einen weit verbreiteten ASTM-Standard für die Beurteilung der Hämolyse^{gibt 20}, gibt es keinen solchen Standard für Thrombogenitätstests von VADs unter klinisch relevanten Betriebsbedingungen²¹. Trotz bahnbrechender Studien, die drei Jahrzehnte zurückreichen und die Durchführbarkeit von In-vitro-Thrombosetests für Blutpumpen belegen 22,23,24,25, haben sich Tierversuche bis heute als De-facto-Praxis zur Bewertung von Thrombosen gehalten²⁶. Das Hindernis für eine breitere Einführung von In-vitro-Methoden war wahrscheinlich die komplexe Natur der Gerinnung mit der Vielzahl von Störfaktoren, die die Testergebnisse beeinflussen können, was es schwierig macht, die Thrombogenität der intrinsischen Pumpe von Artefakten zu unterscheiden, die aufgrund methodischer Einschränkungen und Verfahrensfehler entstehen.

Dies motivierte uns, ein detailliertes Protokoll als Leitfaden für Experimentatoren zu veröffentlichen, um Fallstricke zu vermeiden und so den Einsatz von In-vitro-Tests zu fördern und die Abhängigkeit von Tierversuchen zu verringern. Das hierin beschriebene Protokoll, abgeleitet von Maruyama et ^al.27, wurde während des Designs des pädiatrischen VAD^28,29 von PediaFlow (PF5) der 5^. Generation verfeinert und validiert. Diese Testmethode erwies sich als hilfreich, um potenzielle thrombogene Risiken in den VAD-Prototypen vor Tierversuchen systematisch zu identifizieren und zu adressieren.

Das in dieser Studie verwendete Schafvollblut wurde von einem kommerziellen Anbieter bezogen und erforderte daher keine Überprüfung durch das Institutional Animal Care and Use Committee der Cornell University.

1. Aufbau des Testflow-Loops

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie eine detaillierte Liste der Schleifenkomponenten und aller anderen Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Modifizieren Sie den intravenösen (IV) Beutel.
   1. Verwenden Sie ein Heißsiegelgerät aus Kunststoff, um einen Infusionsbeutel so zu modifizieren, dass er sein Volumen und seine Form anpasst, wie in Abbildung 1 dargestellt.
      HINWEIS: Die Form des Beutels erleichtert die Entlüftung und ermöglicht es, den Beutel mit einem Blutstiller über die Flüssigkeitsleitung^30,31 zu klemmen. Die Position der Dichtungsleitung wird basierend auf dem Ansaugvolumen des VAD und des Schlauchs gewählt, um ein Gesamtansaugvolumen von 150 mL zu erreichen.
   2. Führen Sie einen Belüftungsschlitz ein, indem Sie oben am Beutel einen 4-mm-Schnitt machen. Setzen Sie einen weiblichen Luer-Lock mit Widerhaken in den Schnitt ein und versiegeln Sie die Stelle mit RTV-Silikonkautschukkleber. Befestigen Sie einen Einweg-Absperrhahn am Luer-Lock.
2. Montieren Sie die Testschleife mit dem modifizierten Infusionsbeutel, einem Schlauch aus Polyvinylchlorid (PVC), Polycarbonat-Widerhaken und 3-Wege- und 1-Wege-Absperrhähnen, wie in Abbildung 1 gezeigt.
3. Schließen Sie das Druckmanometer an.
   1. Befestigen Sie 6-Zoll-Verlängerungsleitungen an den einlass- und auslassseitigen Druckanschlüssen. Befestigen Sie einen Einweghahn am anderen Ende der Verlängerungslinie.
      HINWEIS: Der Absperrhahn ermöglicht das Trennen des Manometerschlauchs, um die Verlängerungsleitung vor dem Starten der Pumpe mit Flüssigkeit zu grundieren, wie in Schritt 4.3 beschrieben.
   2. Verbinden Sie ein Ende jedes Schlauchs mit einem Innendurchmesser (ID) von 1/8" mit einem Manometer-Widerhaken und setzen Sie einen männlichen Luer-Anschluss an das andere Ende ein.
   3. Verbinden Sie die männlichen Luer-Anschlüsse mit den Einweg-Absperrhähnen. Öffnen Sie die Absperrhähne, um die Druckmessung zu aktivieren.
4. Wenden Sie eine Clamp-On-Ultraschall-Durchflusssonde an, um die Durchflussrate zu messen.
5. Platzieren Sie eine Hoffman-Klemme distal am Auslassdruckanschluss, um den Strömungswiderstand zu regulieren.

2. Herstellung der Calciumchlorid (CaCl₂)-Lösung

1. Lösen Sie pulverförmiges CaCl₂ in 1x TRIS-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4), um eine 1 M Lösung herzustellen. Vermeiden Sie phosphathaltige Puffer (z. B. PBS oder DPBS), da Calcium und Phosphat zu einem unlöslichen Niederschlag reagieren.
2. Bei der Aufbereitung von CaCl₂ in großen Mengen ist die schrittweise Zugabe des CaCl₂ Pulvers in mehreren Schritten zu erreichen, da es sich bei der Auflösung um einen exothermen Prozess handelt.
3. Titrieren Sie den pH-Wert der Lösung bei Bedarf mit Salzsäure (HCl) oder Natriumhydroxid (NaOH) auf 6-8.

3. Aufbereitung von Blut

HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Schafblut wurde von einem kommerziellen Anbieter gewonnen, der in der Materialtabelle aufgeführt ist. Das Blut wurde mit einer 14-G-Nadel entnommen, wobei das Tier in einer landwirtschaftlichen Standardhaltung festgehalten wurde. Der Entnahmeprozess dauerte 10-12 Minuten vom Einführen der Nadel bis zum Abschluss. Das Blut wurde mit 14 Teilen CPD auf 86 Teile Blut antikoaguliert (CPD-Formulierung: 26,3 g/l Na-Citrat, 25,2 g Dextrose, 3 g/l Zitronensäure und 2,2 g/l Na-Phosphat in deionisiertem [DI] Wasser). Der Blutbeutel wurde über Nacht in einem isolierten Behälter mit Eisbeuteln verschickt und innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme für das Experiment verwendet.

1. Bereiten Sie das Spenderblut für die Verwendung vor.
   1. Legen Sie den Blutbeutel für 15-30 Minuten auf eine kippbare Plattform, um das Blut vorsichtig zu mischen und auf Raumtemperatur (RT) zu bringen.
   2. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in ein Polycarbonat-Becherglas oder einen Behälter, der für den Bluttransfer vorgesehen ist.
   3. Übertragen Sie das Blut durch einen Transfusionsfilter in das Becherglas, um Makroaggregate zu entfernen. Gehen Sie vorsichtig mit dem Blut um, um Schäden an den Zellbestandteilen zu vermeiden. Gießen Sie das Blut entlang der Behälterwände, um einen freien Fall zu vermeiden und zelluläre Traumata zu minimieren.
      HINWEIS: Entsorgen Sie das Blut, wenn große Thromben vorhanden sind oder der Filter verstopft.
   4. Stellen Sie das Becherglas oder den Behälter auf einen Magnetrührer und stellen Sie die Geschwindigkeit ein, bis sich die Oberfläche des Blutes leicht zu drehen beginnt, ohne einen großen Wirbel zu bilden. Mindestens 5 Min. kontinuierlich rühren.
   5. Messen Sie den Hämatokrit und die Thrombozytenzahl, um sicherzustellen, dass die Werte im normalen Bereich für die Spezies liegen.
2. Führen Sie Titrationen durch, um die CaCl_{2-Zielkonzentration} zu bestimmen.
   HINWEIS: Citriertes Blut wird rekalzifiziert, um Gerinnungs- und Thrombosetests zu ermöglichen, wobei Heparin hinzugefügt wird, um eine unkontrollierte Gerinnung zu verhindern. Die angestrebte aktivierte Gerinnungszeit (ACT) für den Start des Tests beträgt 300 s. Bitte beachten Sie, dass die in diesem Abschnitt angegebenen ACT-Referenzwerte mit Spenderschafblut ermittelt wurden und je nach Tierart und dem bei der Entnahme verwendeten Antikoagulationsgrad variieren können. Darüber hinaus können die ACT-Messungen zwischen den Instrumenten^{32, 33 und 34} variieren. Möglicherweise sind einige Versuche und Irrtümer erforderlich, um den optimalen ACT-Bereich für eine bestimmte Laboreinrichtung zu ermitteln.
   1. 2 mL der vorbereiteten 1 M CaCl_2-Lösung und 0,5 mL Heparinnatrium (1000 U/mL) aus der Herstellerverpackung in Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen, um eine Kontamination der Stammlösungen zu vermeiden.
   2. Übertragen Sie 10 ml Blut in 14-ml-Polypropylen-Reagenzgläser. Bereiten Sie vier solcher Röhrchen vor.
   3. Um eine Heparinkonzentration von 0,5 U/ml im Blut zu erreichen, fügen Sie der 10 ml Blutprobe 5 μl Heparinnatrium hinzu.
   4. Um eine Kalziumkonzentration von 5 mM im Blut zu erreichen, geben Sie 50 μl 1 M CaCl_2-Lösung zu der 10 ml-Blutprobe. Drehen Sie während der Abgabe die Pipettenspitze, um das CaCl₂ über eine größere Fläche zu verteilen.
   5. Drehen Sie das Rohr sofort 10 Mal um, rollen Sie es horizontal (auf einer ebenen Fläche oder zwischen den Handflächen) und drehen Sie es dann weitere 10 Mal um, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
   6. Messen Sie die ACT mit einem Point-of-Care-Vollblutgerinnungssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die anfängliche ACT liegt in der Regel zwischen 400 und 500 s.
   7. Unter Beibehaltung der Heparinkonzentration ist die CaCl_{2-Konzentration} (auf ca. 7-8 mM) zu erhöhen, um einen ACT von 300 s zu erreichen.
   8. Überprüfen Sie die Endkonzentration und die resultierende ACT in einem separaten Blutröhrchen.

4. Verfahren vor dem Test

HINWEIS: Alle in diesem Abschnitt beschriebenen Schritte gelten für die Abschnitte 5 und 6. Führen Sie diese Schritte durch, bevor Sie die Pumpe mit Rinderserumalbumin (BSA) oder Blut in der Schleife betreiben. Übertragen Sie Blut zwischen den Gefäßen durch Schwerkraft, um die mechanische Belastung zu minimieren. Vermeiden Sie es, den Spritzenkolben zum Treiben von Blut zu verwenden, da dies zu übermäßigem Druck führen kann. Vermeiden Sie außerdem das Drosseln des Blutes durch enge Öffnungen, um Schäden an zellulären Komponenten zu vermeiden.

1. Befüllen und Entleeren der Testschleife
   1. Befestigen Sie eine 30-Zoll-Verlängerungsleitung an der Injektionsöffnung und schließen Sie einen 60-ml-Spritzenzylinder als Trichter an. Öffnen Sie den Absperrhahn des Ausgleichsbehälters, um als Entlüftungsöffnung zu fungieren.
   2. Gießen Sie Flüssigkeit in den Trichter und heben Sie sie nach Bedarf an, um das Feilen zu beschleunigen. Füllen Sie die Schlaufe bis zu 1-2 cm unter dem Lüftungsschlitz an der Oberseite des Beutels. Schließen Sie die Absperrhähne für den Entlüftungs- und Einspritzanschluss.
   3. Zum Entleeren öffnen Sie die Absperrhähne der Entlüftungsöffnung und der Einspritzöffnung und senken Sie den Trichter unter die Tischhöhe. Heben Sie die Pumpe über den Ablassanschluss, um die restliche Flüssigkeit abzuleiten.
2. Entlüften der Testschleife
   HINWEIS: Führen Sie diesen Vorgang durch, wenn Sie die Schlaufe vor dem Starten der Pumpe mit BSA oder Blut füllen.
   1. Stellen Sie sicher, dass nirgendwo in der Schleife Luft eingeschlossen ist. Entfernen Sie Luftblasen auf Oberflächen, indem Sie vorsichtig auf den Schlauch und den Behälter klopfen und ihn zusammendrücken.
   2. Wenn Sie eine Blutpumpe mit axialer Strömung untersuchen, drehen Sie sie in eine vertikale Position, um Luft durch Auftrieb abzulassen. Wenn Sie eine Kreiselpumpe verwenden, drehen Sie sie auf den Kopf und drehen Sie sie, um sicherzustellen, dass keine Luft in den sekundären Strömungswegen eingeschlossen wird.
   3. Überprüfen Sie horizontale Abschnitte von Schläuchen und die Verbindungsstellen zwischen Schläuchen und Anschlüssen genau, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
   4. Drücken Sie den Infusionsbeutel zusammen, um den Flüssigkeitsstand in die Nähe des oberen schmalen Teils zu bringen, und klemmen Sie den Beutel mit einem Blutstiller über die Flüssigkeitsleitung, um die Flüssigkeits-Luft-Grenzfläche zu beseitigen. Schließen Sie den Absperrhahn der Entlüftungsöffnung.
3. Ansaugen der Druckleitungen und des Probenahmeanschlusses
   1. Schließen Sie den Absperrhahn am Ende der Druckleitungen, entfernen Sie den Manometerschlauch und bringen Sie eine 3-ml-Spritze an. Öffnen Sie den Absperrhahn und ziehen Sie 1-2 ml Flüssigkeit in die Verlängerungsleitung (ca. 4 cm).
   2. Schließen Sie den Absperrhahn, nehmen Sie die Spritze ab und schließen Sie den Manometerschlauch wieder an. Öffnen Sie den Absperrhahn, um die Druckmessung zu aktivieren.
   3. Entlüften Sie die Probenahmeöffnung mit einer Spritze.
4. Reinigung der Injektions- und Probenahmeanschlüsse
   1. Schneiden oder reißen Sie ein fusselfreies Tuch in drei gleich große Fragmente. Drehen Sie die Ecke eines Fragments zu einer Spitze und führen Sie sie in den Port ein, um das restliche Blut aufzusaugen.
   2. Drehen Sie das zweite Fragment, befeuchten Sie es mit Kochsalzlösung und führen Sie die feuchte Spitze in den Port ein. Drehen Sie es um den Port, um das restliche Blut zu entfernen.
   3. Verwenden Sie das dritte Fragment, um die im Port befindliche Kochsalzlösung zu absorbieren.
      HINWEIS: Führen Sie diesen Reinigungsvorgang unmittelbar nach der Entnahme einer Blutprobe oder immer dann durch, wenn sich Blutreste in den Anschlüssen befinden.

5. Passivierung der blutberührenden Oberflächen

1. Füllen Sie die Schlaufe mit 1%iger BSA-Lösung und betreiben Sie den VAD, um ihn mindestens 30 Minuten lang zirkulieren zu lassen.
2. Überprüfen Sie die Schlaufe auf Undichtigkeiten und bauen Sie sie bei Bedarf wieder zusammen.
3. Lassen Sie die BSA-Lösung vollständig ab, um eine Blutverdünnung zu vermeiden.

6. Thrombose-Tests

1. Bereiten Sie die Testschleife vor.
   1. Füllen Sie die Schlaufe mit 150 ml Blut.
   2. Entlüften Sie den Kreislauf und entlüften Sie die Druckleitungen und den Probenahmeanschluss, wie in den Schritten 4.2 bis 4.4 beschrieben.
   3. Starten Sie die Pumpe mit niedriger Drehzahl und betreiben Sie sie ca. 5 s lang, um alle eingeschlossenen Luftblasen in der Pumpe zu entfernen, und stoppen Sie dann die Pumpe.
   4. Wenn Blasen im Beutel auftreten, wiederholen Sie Schritt 4.2, um die Entlüftung erneut durchzuführen.
   5. Starten Sie die Pumpe mit niedriger Geschwindigkeit neu, um das Blut in der Schleife zirkulieren zu lassen.
2. Fügen Sie Heparin zum Blut in der Schleife hinzu.
   1. Übertragen Sie 1 ml Heparin-Natrium (1000 U/ml) und 1,5 mL Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; 0,5 M) aus der Herstellerverpackung in separate Röhrchen, um die Handhabung während des Tests zu erleichtern.
   2. Verwenden Sie den Queranschluss des 3-Wege-Absperrhahns, um mit einer Spritze Substanzen in die Schlaufe zu verabreichen. Drehen Sie den männlichen Luer-Lock am Absperrhahn so, dass die Injektionsöffnung nach oben zeigt, um Luftblasen oben einzuschließen.
   3. Erreichen Sie eine Heparinkonzentration von 0,5 U/ml in der Schleife, indem Sie 75 U Heparinnatrium zu 150 mL Blut hinzufügen. Aspirieren Sie 75 μl Heparin (75 μl bei einer Konzentration von 1000 μl) in eine Mikropipette und geben Sie es in eine 3-ml-Spritze ab, indem Sie gleichzeitig die Pipette abgeben und den Spritzenkolben ziehen. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Flüssigkeit ohne Verschütten umgefüllt wird.
   4. Befestigen Sie die Spritze über den Luer-Lock an der Injektionsöffnung, wobei der Anschluss nach oben zeigt und die Spritzenspitze senkrecht nach unten zeigt. Ziehen Sie den Spritzenkolben, um ihn mit Blut zu füllen, und mischen Sie das Heparin mit dem Blut, während Sie Luft in die Spritze einsaugen. Lassen Sie die Luftblase an die Oberseite der Spritze aufsteigen. Injizieren Sie die Mischung in den Kreislauf und stellen Sie sicher, dass keine Luft eindringt.
   5. Schieben Sie das Blut 4-5 Mal in die Spritze hinein und wieder heraus, um sicherzustellen, dass das heparinisierte Blut nicht in den Raum im Port eingeschlossen bleibt. Stellen Sie sicher, dass keine Luft in den Kreislauf gelangt.
3. Titrieren Sie den AKT des Blutes in der Schleife.
   1. Erreichen Sie eine anfängliche Kalziumkonzentration von 5 mM in der Schleife, indem Sie 750 μl 1 M CaCl_2-Lösung zu 150 ml Blut hinzufügen, wobei das gleiche Verfahren wie bei Heparin verwendet wird.
      1. Blut, das hohen Kalziumkonzentrationen ausgesetzt ist, kann in der Spritze zu gerinnen beginnen. Spritzen Sie die Flüssigkeit schnell ein, nachdem Sie die Restluft entfernt haben. Optional verdünnen Sie das CaCl₂ in der Spritze mit 1 ml TRIS-gepufferter Kochsalzlösung, um das Risiko einer vorzeitigen Gerinnung zu verringern.
   2. Lassen Sie das injizierte CaCl₂ mindestens 2 Minuten lang in der Schleife zirkulieren, bevor Sie eine Blutprobe zur Messung der anfänglichen ACT entnehmen.
   3. Befestigen Sie eine 1-ml-Spritze an der Probenahmeöffnung. Entnehmen und entsorgen Sie 0,5 ml Abfallblut, um stagnierendes Blut aus dem Port zu entfernen.
   4. Setzen Sie eine neue 1-ml-Spritze auf, entnehmen Sie 0,5 ml Blut für die Analyse und messen Sie die ACT. Reinigen Sie den Probenahmeanschluss mit dem Verfahren in Schritt 4.4.
   5. Beziehen Sie sich auf die Titrationswerte in Schritt 3.2, um die CaCl_{2-Zielkonzentration} zu ermitteln. Erhöhen Sie schrittweise die Calciumkonzentration, um einen ACT von 300 s zu erreichen. Vermeiden Sie es, die volle Menge CaCl₂ auf einmal hinzuzufügen, um eine schnelle Gerinnung zu verhindern.
      HINWEIS: In den in dieser Studie verwendeten Tests führte die anfängliche Calciumkonzentration von 5 mM zu einer ACT von 450 ± 50 s, und die endgültige Konzentration von 7-8 mM ergab eine ACT von 300 ± 20 s. Auch wenn diese Reaktion variieren kann, versuchen Sie, den ACT zu Beginn des Tests auf oder unter 300 s zu bringen.
4. Starten Sie den Test.
   1. Sobald der ACT von 300 s in der Schleife erreicht ist, beginnen Sie mit dem 1-stündigen Test. Stellen Sie die Pumpe auf die gewünschte Fördermenge und den gewünschten Druck ein, indem Sie die Rotordrehzahl ändern und den Widerstand mit der Hoffman-Klemme regulieren.
   2. Messen Sie den ACT alle 15 Minuten, indem Sie die Schritte 6.3.3-6.3.4 befolgen.
   3. Wenn der ACT unter 200 s fällt, injizieren Sie zusätzlich 25 U Heparin-Natrium in die Schleife.
5. Beenden Sie den Test.
   1. Am Ende von 1 h injizieren Sie EDTA in die Schleife, um die weitere Gerinnung zu hemmen, mit dem Ziel einer Endkonzentration von 5 mM im Blut. (Injizieren Sie 1,5 ml, wenn Sie eine 0,5 M EDTA-Lösung verwenden.)
   2. Lassen Sie das EDTA 2 Minuten lang zirkulieren und mischen und stoppen Sie dann die Pumpe.
6. Trennen Sie die Pumpe und spülen Sie sie.
   1. Klemmen Sie die mit dem Pumpeneinlass und -auslass verbundenen Schläuche mit Hämostaten fest und positionieren Sie die Klemmen 3-4 cm von den Einlass- und Auslasswiderhaken entfernt.
   2. Trennen Sie vorsichtig den Schlauch, um die Pumpe zu lösen.
   3. Lassen Sie das Blut aus der Pumpe und dem Durchflusskreislauf in einen Behälter ab.
   4. Waschen Sie das restliche Blut aus der Pumpe, indem Sie es der Schwerkraft zuführen oder Kochsalzlösung durch den Pumpeneinlass und -auslass pipettieren.
      HINWEIS: Die Schritte 6.7 und 6.8 werden gleichzeitig ausgeführt.
7. Überprüfen Sie den Strömungsweg der Pumpe.
   1. Nehmen Sie Bilder des Pumpeneinlasses und -auslasses mit einer Endoskop-/Endoskopkamera auf.
   2. Zerlegen Sie die Pumpe (falls zutreffend). Waschen Sie die Komponenten in einem Salzbad und untersuchen Sie sie mit einem Präparierfernrohr oder einer Makrolinse auf Thromben.
   3. Fotografieren Sie blutberührende Oberflächen zur Dokumentation.
      HINWEIS: Eine konsequente Inspektion und eine gründliche Dokumentation sind für Vergleichstests von entscheidender Bedeutung.
8. Filtern Sie das verbrauchte Blut.
   1. Schneiden Sie ein Stück 100 μm langes Nylongewebe ab, das groß genug ist, um die Öffnung eines Auffangbehälters zu bedecken.
   2. Positionieren Sie das Netz mit einem leichten Tuch über dem Behälter, damit das Blut effektiv hindurchfließen kann. Sichern Sie die Kanten des Netzes, um ein Verrutschen während der Filtration zu verhindern.
   3. Das verbrauchte Blut wird durch das Nylonnetz geleitet. Entsorgen Sie das Blut gemäß den Richtlinien der Einrichtung für den Umgang mit biologischen Abfällen.
   4. Untersuchen Sie das Netz auf gefangene Thromben und dokumentieren Sie die Ergebnisse.
9. Bereiten Sie sich auf die histologische Analyse vor.
   1. Wenn eine histologische Analyse geplant ist, beheben Sie alle in der Formalinlösung gefundenen Thromben gemäß den entsprechenden Sicherheitsverfahren.
      ACHTUNG: Verwenden Sie beim Umgang mit Formaldehyd immer einen Abzug.

7. Ablauf der Reinigung

1. Demontieren Sie die Durchflussschleife. Entsorgen Sie den PVC-Blutbeutel und den Schlauch.
2. Alle anderen blutberührenden Bestandteile (Konnektoren, Absperrhähne, Luer-Locks, etc.) über Nacht in einer 1%igen enzymaktiven Waschmittelpulverlösung einweichen. Mit warmem Leitungswasser, gefolgt von DI-Wasser abspülen und an der Luft trocknen lassen.
   1. Wenn Gerinnsel verbleiben, beschallen Sie die Bestandteile in der Waschmittellösung. Gründlich ausspülen und an der Luft trocknen lassen.
3. Reinigen Sie die Pumpe.
   1. Wenn die Pumpe zerlegt werden kann, tränken und beschallen Sie die blutberührenden Komponenten mit einer 1%igen Allzweckreiniger-/Entfettungslösung, gefolgt von einer 1%igen enzymaktiven Reinigungspulverlösung.
   2. Wenn die Pumpe nicht demontiert werden kann, schließen Sie sie an einen neuen Durchflusskreislauf an, der mit Reinigungslösungen gefüllt ist, und betreiben Sie ihn mindestens 30 Minuten lang mit hoher Drehzahl. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf.
4. Spülen Sie die Pumpe gründlich mit warmem Leitungswasser, gefolgt von DI-Wasser und trocknen Sie sie an der Luft.

Die erfolgreiche Ausführung dieses Protokolls ermöglicht die Identifizierung lokalisierter Bereiche der Thrombozytenablagerung und die Aufdeckung problematischer Stellen im Strömungsweg der Pumpe. Die konsequente Anwendung dieses Protokolls ermöglicht inkrementelle Verbesserungen, indem diese identifizierten "Hotspots" angesprochen werden.

Bei der Entwicklung des PediaFlow PF5 VAD stießen wir beispielsweise aufgrund der Miniaturgröße der Komponenten auf Herausforderungen beim manuellen Polieren der Druckseite der Statorschaufeln. In-vitro-Thrombosetests zeigten dieses Problem, da die Thrombozytenablagerung entlang der Klingenwurzeln durchweg beobachtet wurde, wie in Abbildung 2A zu sehen ist. Ein ähnliches Ablagerungsmuster wurde später in einer akuten Tierstudie bestätigt, bei der die Pumpe extrakorporal an den Kreislauf eines Schafes angeschlossen und 3 h lang betrieben wurde (nicht näher erläutert in dieser Arbeit). Um dies zu beheben, setzten wir eine Elektropoliertechnik ein, um einen Hochglanz auf diesen Titankomponenten zu erzielen, der die Thrombusbildung in diesen Bereichen erfolgreich eliminierte (Abbildung 2B). Diese Pumpe wurde später in einer 7-tägigen In-vivo-Studie an Schafen eingesetzt, die ebenfalls eine Thrombosefreiheit zeigte.

Ein weiteres problematisches Merkmal, das bei unseren Pumpenprototypen festgestellt wurde, war die Verbindung zwischen den vorderen und hinteren Gehäusekomponenten. Eine unvollkommene Koaptation an dieser Schnittstelle könnte einen Spalt erzeugen, in den Blut eindringen und gerinnen könnte, wie in Abbildung 3A zu sehen ist. Wir testeten mehrere Läpp- und Poliermethoden, um die Passform dieser Komponenten zu verbessern, und verwendeten die In-vitro-Thrombosetestmethode, um die Ergebnisse zu bewerten. Die Verbesserungen wurden durch erneute Anwendung des Protokolls bewertet, das die Verringerung der Thrombusbildung an der Verbindungsstelle bestätigte, wie in Abbildung 3B gezeigt.

Es ist wichtig, Thrombosen, die durch experimentelle Fehler oder Artefakte verursacht werden, von der tatsächlichen Gerinnselbildung im Gerät zu unterscheiden. Mehrere Faktoren können eine übermäßige Gerinnung auslösen. Bei der Verabreichung der CaCl_2-Lösung wird eine kleine Menge Blut in die Spritze gesaugt, um die im Anschluss eingeschlossene Luft abzusaugen, wie in Schritt 6.3.1 beschrieben. Wenn dieses Blut zu lange einer hohen Konzentration von CaCl₂ ausgesetzt bleibt, kann es vorzeitig zu gerinnen beginnen. Wenn es anschließend in die Schleife injiziert wird, kann dieses geronnene Blut als Nidus für weiteres Gerinnselwachstum fungieren und möglicherweise in den VAD aufgenommen werden. Abbildung 4 zeigt einen großen Thrombus, der vermutlich in eine Magnetschwebebahn-Kreiselbahn aufgenommen wurde und den Strömungsweg verschließt.

Die Injektion einer großen Menge CaCl₂ auf einmal kann eine außer Kontrolle geratene Gerinnung auslösen. Um dies zu vermeiden, wird empfohlen, zuerst die CaCl_{2-Konzentration} in der Schleife auf 5 mM zu erhöhen, den ACT zu überprüfen und dann mit einer zweiten Dosis fortzufahren, um den Ziel-ACT zu erreichen.

Kugelförmige, locker anhaftende Klumpen, die auf Oberflächen beobachtet werden, sind oft das Ergebnis von Luftblasen, die in Gerinnseln eingekapselt sind, Beispiele dafür sind in Abbildung 5A,B dargestellt. Diese zirkulierenden Klumpen können auf die Vorderkanten von Laufrad- und Statorschaufeln aufprallen und Ablagerungen erzeugen, die an Insektenflecken auf der Windschutzscheibe eines Autos erinnern. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, den Loop als kritischen Schritt im Protokoll gründlich zu entlüften. In ähnlicher Weise können Fremdkörper und Ablagerungen, die in der Schleife zirkulieren, in Thromben eingekapselt sein und an Pumpenoberflächen haften, wie in Abbildung 5C, D gezeigt.

Umgekehrt deutet das Vorhandensein von Ringthrombi an den Schlauch-Stecker-Verbindungen, wie in Abbildung 6 gezeigt, typischerweise darauf hin, dass sich die ACT in einem optimalen Bereich befand, der eine lokalisierte Gerinnung unterstützte, ohne in eine unkontrollierte Gerinnung zu eskalieren. Es ist bekannt, dass die Schlauch-Verbinder-Verbindungen die thrombogenste Region in den ECMO-Schaltkreisen³⁵ sind. Unserer Erfahrung nach liegt dieser optimale ACT-Bereich zwischen 200 s und 300 s. Sinkt der ACT während der Experimente unter 200 s, kann ein zusätzlicher Heparinbolus von 25 u in die Schleife injiziert werden.

Die Vermeidung der oben beschriebenen Fallstricke und die Sicherstellung einer konsistenten Ausführung des Protokolls maximieren seinen Nutzen bei der Identifizierung potenzieller thrombogener Risiken in einem frühen Stadium des VAD-Entwicklungsprozesses und ermöglichen gezielte Verbesserungen, bevor zu Tierversuchen übergegangen wird.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Prüfdurchlaufs. (A) Prüfströmungsschleife für eine Pumpe mit 1/4" Zu- und Abflussstutzen und (B) für eine Pumpe mit 3/8" Zu- und Abflusstümpfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Iterative Verbesserung und Bewertung von VAD-Prototypen unter Verwendung des in vitro Thromboseprotokolls. (A) Die Thrombozytenablagerung wurde in der manuell polierten Version der Pumpe konsistent entlang der Wurzeln der Statorschaufeln beobachtet. (B) Dieses Problem wurde in der elektropolierten Version behoben. In beiden Tests wurde die ACT zwischen 250 s und 300 s gehalten, und die Pumpe wurde 1 h lang mit 2,5 l/min betrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Das In-vitro-Thromboseprotokoll wurde verwendet, um das Problem der unvollkommenen Passung zwischen den zusammenpassenden Komponenten des Pumpengehäuses zu beheben. (A) Das Basisdesign litt unter einer unvollkommenen Koaptation an dieser Verbindungsstelle, was zu Blutansammlungen und Gerinnungen in diesem Raum führte. Einsatz: das resultierende Gerinnsel, extrahiert und zwischen zwei Wattestäbchen gedehnt. (B) Ein überarbeitetes Design mit verbesserter Passform beseitigte dieses Problem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ein großer Thrombus, der den Strömungsweg einer Magnetschwebebahn-Kreiselbahn verschließt, vermutlich resultierend aus einem experimentellen Fehler bei der Injektion von CaCl₂ in den Strömungskreislauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Lose anhaftende Gerinnsel, Fremdkörper und Ablagerungen. (A,B) Kugelförmige, lose anhaftende Klumpen, die auf Oberflächen beobachtet werden, sind oft das Ergebnis von Luftblasen, die in Gerinnseln eingeschlossen sind. (C,D) Fremdkörper und Ablagerungen, die in der Schleife zirkulieren, können in Thromben eingekapselt werden, die an Pumpenoberflächen haften, oder auf die Vorderkanten (LE) von Laufrad- und Statorschaufeln auftreffen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Ringthrombus. (A) Ein Ringthrombus, der an der Verbindung zwischen Schlauch und Verbinder gebildet wird. (B) Der Ringthrombus, der neben einer Rasierklinge aus rostfreiem Stahl ausgelegt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Ersterprobung einer neuen Pumpe am Menschen ist immer ein heikles Unterfangen, da präklinische Studien die Thrombogenität von VADs beim Menschen nicht zuverlässig vorhersagen können²⁶. Bemerkenswert ist, dass einige VADs, die in Tierversuchen eine Thrombosefreiheit zeigten, später eine signifikante Thrombogenität in der klinischen Anwendung zeigten³⁶. Ein aggressives In-vitro-Testschema , das speziell darauf ausgelegt ist, Thrombosen zu provozieren, bietet eine wertvolle Gelegenheit, potenzielle Design- oder Herstellungsfehler frühzeitig im Entwicklungsprozess zu identifizieren. Obwohl dieses Protokoll keine endgültige Vorhersage der zukünftigen In-vivo-Leistung eines VAD bieten kann, kann dieser proaktive Ansatz potenzielle Thrombose-Hotspots aufdecken, die unter prokoagulanzien Bedingungen auftreten können.

Bestehende in vitro Methoden zur Behandlung von VAD-Thrombosen variieren stark in der Testdauer und den Antikoagulationsstrategien. Hastings et al. führten über einen Zeitraum von 48 Stunden Tests mit stark heparinisiertem Schweineblut durch und replizierten erfolgreich Thrombosemuster, die klinisch bei ECMO-Pumpen beobachtet wurden³⁷. Im Gegensatz dazu verwendeten bahnbrechende Studien von Schima et al. Protamin, um die ACT von heparinisiertem Blut zu Beginn des Tests auf das 3-fache ihres Ausgangswerts zu senken, und beendeten das Experiment, als die ACT auf das 1,5-fache des Ausgangswerts sank²³. Dieser innovative Ansatz komprimierte typische 2- bis 3-tägige In-vivo-Studien auf nur 1 bis 3 Stunden In-vitro-Tests .

Maruyama et al. verglichen systematisch die Verwendung von Citrat-Calcium- und Heparin-Protamin-Komplexen für Thrombosetests, bei denen Calciumchlorid zugesetzt wird, um die Wirkung von Citrat umzukehren, und Protaminsulfat verwendet wird, um das Heparin zu neutralisieren²⁷. Sie kamen zu dem Schluss, dass die Rekalzifizierung von citriertem Blut zu einer allmählicheren und monotonen ACT-Reaktion führte. Durch den Einsatz des Citrat-Calcium-Komplexes erreichten Maruyama und Kollegen eine präzise ACT-Kontrolle, die während eines 2-stündigen Tests bei 200 s gehalten wurde. Ihre In-vitro-Studie , in der mehrere Pumpenprototypen verglichen wurden, replizierte effektiv die in Tierversuchen beobachteten Thrombosemuster.

Während das hier beschriebene Protokoll weitgehend auf Maruyamas Methode basiert, haben wir versucht, zwei Haupthindernisse für seine breitere Zugänglichkeit zu beseitigen. Zunächst wurden in Maruyamas Studie bioaktive, mit Heparin beschichtete Flow-Loop-Komponenten verwendet, die teuer und schwierig zu beschaffen sein können. Wir vereinfachten den Ansatz, indem wir dem Blut direkt eine feste Menge Heparin zusetzten und leicht verfügbare Testschleifenkomponenten von gängigen Anbietern verwendeten. Zweitens erforderte ihre Methode mehrere Injektionen von Calciumchlorid und Trinatriumcitrat während des gesamten Tests, um eine konstante ACT aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz dazu initiiert dieses Protokoll Tests mit einem höheren ACT und vermeidet die Notwendigkeit kontinuierlicher Anpassungen, wodurch die Komplexität und das Potenzial für Verfahrensfehler reduziert werden. Diese Anpassungen machen das Protokoll in dieser Studie für die meisten Laboratorien, die In-vitro-Bluttests von VADs durchführen, zugänglicher.

Obwohl dieses Protokoll die wichtigsten technischen Hindernisse überwindet, hängen sein Erfolg und sein letztendlicher Nutzen immer noch von der sorgfältigen und konsistenten Ausführung jedes experimentellen Schritts ab. Ein kritischer Aspekt dieses Protokolls ist die gründliche Entlüftung des Kreislaufs und die sorgfältige Methode, Substanzen in den Kreislauf zu injizieren, ohne Luftemboli zu erzeugen. Ein Versagen in einem dieser Bereiche könnte Artefakte einführen, die die Ergebnisse verfälschen könnten, indem sie eine übermäßige Thrombose auslösen.

Es ist wichtig, dass vor Beginn des Tests keine Luftblasen und Blut-Luft-Grenzflächen in der Schleife vorhanden sind. Alle Luftblasen, die in der Schleife zirkulieren, können in Klumpen eingekapselt werden und sich höchstwahrscheinlich an den Vorderkanten der Laufrad- und Statorschaufeln ablagern. Die eingangsseitige Druckleitung stellt aufgrund des geringen Drucks, der vor dem Pumpeneingang entsteht, das größte Risiko für das Einbringen von Luft dar. Beim Starten der Pumpe und beim Erhöhen der Drehzahl wird die Luftsäule in der Druckleitung in die Strömung hineingezogen. Um dies zu vermeiden, werden die Druckleitungen mit BSA oder Blut vorgrundiert, wie in Schritt 4.3 beschrieben. Während das Entlüften besonders wichtig ist, wenn mit Blut gearbeitet wird, empfehlen wir auch das Entlüften vor dem Zirkulieren von BSA. Diese Vorsichtsmaßnahme ist notwendig, da das Verschlucken und Aufbrechen großer Luftembolien Schaum erzeugen kann, der nach dem Ablassen der BSA-Lösung bestehen bleiben und möglicherweise nachfolgende Tests beeinträchtigen kann.

Die Methode der Injektion von Heparin- und_{CaCl-2-Lösungen} erfordert eine präzise Technik und eine sorgfältige Ausführung, da wiederholtes Spülen der Spritze das Risiko des Einbringens von Luftembolien erhöht. Der Einbau einer motorisierten Spritze, die so programmiert ist, dass sie präzise Mengen an Substanzen abgibt, könnte in Betracht gezogen werden, um dieses Risiko zu mindern. Eine solche Vorrichtung würde auch eine kontinuierliche Heparininjektion während des Tests ermöglichen, die so kalibriert ist, dass die ACT auf einem konstanten Niveau gehalten wird, wodurch die Variabilität verringert wird, die durch Änderungen der Gerinnungsdynamik im Laufe der Zeit verursacht wird.

Es gibt Einschränkungen bei dieser Methode, insbesondere bei den Steady-State-Bedingungen in vitro, die sich von den pulsierenden Strömungsbedingungen in vivo unterscheiden. Obwohl pulsierende In-vitro-Schleifen verfügbar sind, benötigen sie eine größere Anzahl von Komponenten, was die Komplexität erhöht, die möglicherweise Artefakte einführen kann.

Ein weiterer bemerkenswerter Aspekt dieses Protokolls ist, dass die Tests bei Raumtemperatur und nicht bei der physiologischen Temperatur von 37 °C durchgeführt wurden. Während die physiologische Temperatur die In-vivo-Bedingungen besser nachahmen würde, war es eine Herausforderung, den Strömungskreislauf in einer beheizten Kammer zu platzieren und konstant 37 °C zu halten, da während der Experimente häufiger Zugang zum Strömungskreislauf erforderlich war. Es wurde auch erwogen, das Blutreservoir in ein erhitztes Wasserbad zu tauchen; Dieser Ansatz war jedoch nicht kompatibel mit dem aktuellen Aufbau der vertikalen Schleife, der experimentelle Artefakte minimiert, indem er den Transport von Luftblasen an die Spitze des Blutreservoirs erleichtert.

Darüber hinaus untersuchte die Studie von Patel et al. den Einfluss der Temperatur auf in vitro Thrombosetests mit Schaf- und Rinderblut³⁸. Ihre Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Prüfung bei Raumtemperatur im Vergleich zur 37 °C-Prüfung eine bessere Sensitivität bietet und kürzere Prüfdauern (1 h gegenüber 2 h) ermöglicht. In Anbetracht des zusätzlichen Vorteils des Wegfalls umständlicher Heizgeräte schlagen sie vor, dass Tests bei Raumtemperatur eine praktikable und praktische Option für die In-vitro-Thrombogenitätsbewertung von Biomaterialien sind.

Dieses Protokoll basiert auf der visuellen Erkennung der Thrombusbildung und eignet sich daher besonders für VADs mit transparenten oder abnehmbaren Gehäusen. Bei Geräten mit dauerhaften, undurchsichtigen Gehäusen ist die direkte Inspektion auf Thrombusabscheidung schwieriger, ohne die strukturelle Integrität des Geräts zu beeinträchtigen. In solchen Fällen kann der Einsatz flexibler faseroptischer Kameras eine Teillösung darstellen, die eine begrenzte interne Inspektion ermöglicht.

Schließlich können Faktoren wie die Wahl der Spenderspezies, die Entnahmemethode, die Art des verwendeten Antikoagulans und das Alter des Blutes die thrombogene Reaktion beeinflussen. Die in diesem Protokoll angegebenen Heparin- und Kalziumkonzentrationen sind Referenzwerte, die für den in dieser Studie verwendeten Aufbau spezifisch sind. Darüber hinaus können die ACT-Messungen zwischen verschiedenen Instrumenten variieren 32,33,34. Daher kann dieses Protokoll eine Feinabstimmung durch Versuch und Irrtum erfordern, um den optimalen ACT-Bereich für eine bestimmte Laboreinrichtung zu bestimmen.

Um die Konsistenz zwischen den Experimenten weiter zu verbessern, könnten zukünftige Studien Elemente des ASTM F2888-19-Assays als Kontrollmaßnahme einbeziehen, wobei das rekalzifizierte Blut aus der Titrationsphase für die gleichzeitige Thrombogenitätsbeurteilung in Referenzmaterialien verwendet^{wird 39,40}. Dieser Ansatz würde die Abhängigkeit von der Erreichung einer standardisierten ACT verringern, da diese Metrik möglicherweise nicht vollständig die Schwankungen der Gerinnbarkeit berücksichtigt, die sich aus Unterschieden in den Bluteigenschaften wie Hämatokrit, Thrombozytenzahl und Gesamtproteinkonzentration ergeben.

Trotz dieser Einschränkungen bleibt diese Testmethode ein wertvolles Instrument für die frühzeitige Identifizierung thrombogener Risiken während der VAD-Entwicklung und bietet einen praktischen und zugänglichen Ansatz zur iterativen Verbesserung der Gerätesicherheit, bevor sie zu Tierversuchen übergeht.

S.E.O. ist derzeit als Berater für Magenta Medical tätig und war zuvor Berater bei Boston Scientific. Keine anderen Autoren haben relevante finanzielle Angaben oder Interessenkonflikte zu berichten.

Diese Arbeit wurde durch das National Institutes of Health Grant R01HL089456 und das U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Project Number W81XWH2010387 unterstützt.