In vitro Test della trombosi per dispositivi di assistenza ventricolare

Presentiamo un protocollo da banco per indurre la trombosi nei dispositivi di assistenza ventricolare (VAD) all'interno di una piattaforma di test a ricircolo. Questo metodo serve a identificare i punti caldi trombogenici nel percorso del flusso sanguigno e può aiutare a migliorare la tromboresistenza prima dei test preclinici su modelli animali.

Il rischio di trombosi rimane una preoccupazione significativa nello sviluppo e nell'uso clinico dei dispositivi di assistenza ventricolare (VAD). Le valutazioni tradizionali della trombogenicità del VAD, principalmente attraverso studi sugli animali, sono costose e richiedono tempo, sollevano preoccupazioni etiche e, in ultima analisi, potrebbero non riflettere accuratamente i risultati umani. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un aggressivo protocollo di test in vitro progettato per provocare trombosi e identificare potenziali aree ad alto rischio all'interno del percorso del flusso sanguigno. Questo protocollo, motivato dal lavoro di Maruyama et al., impiega una strategia anticoagulante modificata e utilizza componenti prontamente disponibili, rendendolo accessibile alla maggior parte dei laboratori che conducono test del sangue in vitro dei VAD. Abbiamo dimostrato l'utilità di questo metodo attraverso test iterativi e perfezionamento di un VAD pediatrico miniaturizzato a levitazione magnetica (PediaFlow PF5). Il metodo si è rivelato efficace nell'identificare i punti caldi trombogenici causati da difetti di progettazione e produzione nei primi prototipi di VAD, consentendo miglioramenti mirati prima di passare agli studi sugli animali. Nonostante i suoi limiti, tra cui l'assenza di flusso pulsatile e l'influenza delle caratteristiche del sangue del donatore, questo protocollo funge da strumento pratico per lo sviluppo precoce del VAD e la mitigazione del rischio.

I dispositivi di assistenza ventricolare (VAD) sono diventati uno standard di cura nella gestione dei pazienti con insufficienza cardiaca avanzata, ma il rischio di trombosi e ictus rimane una sfida significativa ^1,2. La trombosi all'interno dei VAD viene in genere valutata durante gli studi preclinici sugli animali che, sebbene preziosi, presentano costi sostanziali e sfide logistiche. Questi studi richiedono molte risorse, richiedono molto tempo e sono suscettibili di un singolo difetto che comprometta l'intero test e richieda ulteriori prove. Ciò non solo aumenta l'onere finanziario, ma solleva anche preoccupazioni etiche dovute alla necessità di ripetere i test sugli animali.

Sebbene esistano molti modelli numerici per prevedere la deposizione piastrinica e la trombosi 3,4,5,6, solo pochi sono adatti per simulare la formazione di trombi in dispositivi su macroscala come i VAD ^7,8,9. Inoltre, i modelli esistenti presuppongono inevitabilmente superfici idealizzate e geometrie semplificate "a tenuta stagna", che non riflettono accuratamente le complessità e le imperfezioni dei gruppi pompa del mondo reale. Quando si considerano le interazioni piastrine-superficie, questi modelli su macroscala generalmente impiegano proprietà del materiale uniformemente prescritte (tipicamente modellate come coefficiente nelle condizioni al contorno superficie-flusso)10,11,12. Di conseguenza, i modelli numerici non possono sostituire completamente i test sperimentali con il sangue.

Sia la scelta del materiale che la finitura superficiale svolgono un ruolo fondamentale nell'adesione piastrinica sulle superfici VAD 13,14,15,16,17. Imperfezioni come macchie ruvide o irregolarità possono favorire l'adesione piastrinica e la formazione di trombi. Inoltre, le fessure tra i componenti nel percorso del flusso possono fungere da nidus per la trombosi, fornendo ambienti protetti in cui i coaguli possono formarsi e crescere^18,19. Anche l'uso di grasso, lubrificanti o sigillanti durante l'assemblaggio può rappresentare un rischio, poiché queste sostanze possono penetrare nel percorso del flusso e interagire con il sangue, aumentando ulteriormente il rischio di complicanze.

C'è, quindi, la necessità di un protocollo di test in vitro ben definito in grado di valutare in modo affidabile la tromboresistenza dei VAD prima che siano sottoposti a test sugli animali o all'uso clinico. Sebbene esista uno standard ASTM ampiamente adottato per la valutazione dell'emolisi²⁰, non esiste uno standard simile per i test di trombogenicità dei VAD in condizioni operative clinicamente rilevanti²¹. Nonostante studi seminali risalenti a tre decenni fa dimostrino la fattibilità del test della trombosi in vitro per le pompe del sangue 22,23,24,25, i test sugli animali hanno persistito come pratica de facto per valutare la trombosi fino ad oggi²⁶. L'ostacolo a una più ampia adozione dei metodi in vitro è stata probabilmente la natura complessa della coagulazione, con la moltitudine di fattori confondenti che possono influenzare i risultati dei test, rendendo difficile differenziare la trombogenicità intrinseca della pompa dagli artefatti derivanti da limitazioni metodologiche ed errori procedurali.

Questo ci ha motivato a condividere un protocollo dettagliato come guida per gli sperimentatori per evitare insidie, promuovendo così l'uso di test in vitro e mitigando la dipendenza dagli studi sugli animali. Il protocollo qui descritto, derivato da Maruyama et ^al.27, è stato perfezionato e convalidato durante la progettazione del VAD^28,29 pediatrico PediaFlow (PF5) di 5a^generazione. Questo metodo di test si è rivelato determinante per identificare e affrontare sistematicamente i potenziali rischi trombogenici nei prototipi VAD prima della sperimentazione animale.

Il sangue intero ovino utilizzato in questo studio è stato ottenuto da un fornitore commerciale e, pertanto, non ha richiesto una revisione da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Cornell University.

1. Costruzione del circuito di flusso di prova

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per un elenco dettagliato dei componenti del loop e di tutti gli altri materiali utilizzati in questo protocollo.

1. Modificare la sacca endovenosa (IV).
   1. Utilizzare una termosigillatrice in plastica per modificare una sacca per flebo per regolarne il volume e la forma, come illustrato nella Figura 1.
      NOTA: La forma della sacca facilita la disaerazione e consente di bloccare la sacca con un emostatico attraverso la linea del fluido^30,31. La posizione della linea di sigillatura viene scelta in base al volume di adescamento del VAD e del tubo per ottenere un volume di adescamento totale di 150 mL.
   2. Introdurre una presa d'aria praticando un'incisione di 4 mm nella parte superiore del sacchetto. Inserire un luer lock femmina spinato nell'incisione e sigillare il sito con adesivo in gomma siliconica RTV. Fissare un rubinetto unidirezionale al luer lock.
2. Assemblare il circuito di prova utilizzando la sacca per flebo modificata, il tubo in cloruro di polivinile (PVC), i connettori spinati in policarbonato e i rubinetti a 3 e 1 via, come mostrato nella Figura 1.
3. Collegare il manometro della pressione.
   1. Collegare le linee di prolunga da 6 pollici alle porte di pressione sul lato di ingresso e di uscita. Fissare un rubinetto unidirezionale all'altra estremità della linea di prolunga.
      NOTA: Il rubinetto consente di scollegare il tubo del manometro per adescare la linea di prolunga con il fluido prima di avviare la pompa, come descritto al punto 4.3.
   2. Collegare un'estremità di ciascun tubo con diametro interno (ID) da 1/8" a una punta del manometro e inserire un raccordo luer maschio all'altra estremità.
   3. Collegare i raccordi luer maschio ai rubinetti unidirezionali. Aprire i rubinetti per abilitare le letture della pressione.
4. Applicare una sonda di flusso a ultrasuoni clamp-on per misurare la portata.
5. Posizionare un morsetto Hoffman distalmente alla porta di pressione di uscita per regolare la resistenza al flusso.

2. Preparazione della soluzione di cloruro di calcio (CaCl₂)

1. Sciogliere il CaCl₂ in polvere in 1x soluzione salina tamponata con TRIS (pH 7,4) per preparare una soluzione 1 M. Evitare tamponi contenenti fosfato (ad es. PBS o DPBS) poiché il calcio e il fosfato reagiscono per formare un precipitato insolubile.
2. Se si prepara CaCl₂ in grandi quantità, aggiungere la polvere di CaCl₂ in modo incrementale in più passaggi, poiché la sua dissoluzione è un processo esotermico.
3. Titolare il pH della soluzione a 6-8 utilizzando acido cloridrico (HCl) o idrossido di sodio (NaOH) se necessario.

3. Preparazione del sangue

NOTA: Il sangue ovino utilizzato in questo studio è stato ottenuto da un fornitore commerciale elencato nella Tabella dei materiali. Il sangue è stato raccolto utilizzando un ago da 14 G, con l'animale trattenuto in una posizione eretta agricola standard. Il processo di raccolta ha richiesto 10-12 minuti dall'inserimento dell'ago al completamento. Il sangue è stato anticoagulato con 14 parti di CPD in 86 parti di sangue (formulazione CPD: 26,3 g/L di Na-citrato, 25,2 g di destrosio, 3 g/L di acido citrico e 2,2 g/L di Na fosfato in acqua deionizzata [DI]). La sacca di sangue è stata spedita durante la notte in un contenitore isolato con impacchi di ghiaccio ed è stata utilizzata per l'esperimento entro 24 ore dalla raccolta.

1. Preparare il sangue del donatore per l'uso.
   1. Posizionare la sacca di sangue su una piattaforma inclinabile per 15-30 minuti per mescolare delicatamente il sangue e lasciarlo raggiungere la temperatura ambiente (RT).
   2. Posizionare un'ancoretta magnetica in un becher o contenitore in policarbonato designato per il trasferimento del sangue.
   3. Trasferire il sangue nel becher attraverso un filtro trasfusionale per rimuovere i macroaggregati. Maneggiare il sangue con delicatezza per evitare danni ai componenti cellulari. Versare il sangue lungo le pareti del contenitore per evitare la caduta libera e ridurre al minimo i traumi cellulari.
      NOTA: Eliminare il sangue se sono presenti trombi di grandi dimensioni o se il filtro si ostruisce.
   4. Posizionare il becher o il contenitore su un agitatore magnetico e regolare la velocità fino a quando la superficie del sangue inizia a girare delicatamente senza formare un grande vortice. Mescolate continuamente per almeno 5 minuti.
   5. Misurare l'ematocrito e la conta piastrinica per assicurarsi che i valori rientrino nell'intervallo normale per la specie.
2. Eseguire le titolazioni per determinare la concentrazione target di CaCl₂ .
   NOTA: Il sangue citrato viene ricalcificato per consentire la coagulazione e i test della trombosi, con l'aggiunta di eparina per prevenire la coagulazione incontrollata. Il tempo di coagulazione attivato (ACT) target per l'inizio del test è di 300 s. Si prega di notare che i valori di ACT di riferimento forniti in questa sezione sono stati ottenuti utilizzando sangue di pecora donata e possono variare a seconda della specie e del livello di anticoagulante utilizzato durante la raccolta. Inoltre, le misure ACT possono variare tra gli strumenti 32,33,34. Potrebbero essere necessari alcuni tentativi ed errori per stabilire l'intervallo ACT ottimale per una specifica configurazione di laboratorio.
   1. Trasferire 2 mL della soluzione preparata di 1 M di CaCl₂ e 0,5 mL di eparina sodica (1000 U/mL) dalla confezione del produttore nelle provette per microcentrifuga per evitare la contaminazione delle soluzioni madre.
   2. Trasferire 10 mL di sangue in provette di polipropilene da 14 mL. Prepara quattro di questi tubi.
   3. Per ottenere una concentrazione di eparina di 0,5 U/mL nel sangue, aggiungere 5 μL di eparina sodica al campione di sangue da 10 mL.
   4. Per ottenere una concentrazione di calcio di 5 mM nel sangue, aggiungere 50 μL di soluzione di CaCl₂ 1 M al campione di sangue da 10 mL. Durante l'erogazione, agitare il puntale della pipetta per distribuire il CaCl₂ su un'area più ampia.
   5. Immediatamente, capovolgere il tubo 10 volte, arrotolarlo orizzontalmente (su una superficie piana o tra i palmi), quindi capovolgerlo altre 10 volte per garantire una miscelazione accurata.
   6. Misurare l'ACT utilizzando un sistema di coagulazione del sangue intero point-of-care seguendo le istruzioni del produttore. L'ACT iniziale varia in genere tra 400 e 500 s.
   7. Mantenendo costante la concentrazione di eparina, aumentare la concentrazione di CaCl₂ (a circa 7-8 mM) per ottenere un ACT di 300 s.
   8. Verificare la concentrazione finale e l'ACT risultante in una provetta di sangue separata.

4. Procedure preliminari al test

NOTA: Tutti i passaggi descritti in questa sezione si applicano alle Sezioni 5 e 6. Eseguire questi passaggi prima di azionare la pompa con albumina sierica bovina (BSA) o sangue nell'ansa. Trasferire il sangue tra i vasi utilizzando l'alimentazione per gravità per ridurre al minimo lo stress meccanico. Evitare di usare lo stantuffo della siringa per guidare il sangue, poiché ciò può creare una pressione eccessiva. Inoltre, evitare di strozzare il sangue attraverso aperture strette per evitare danni ai componenti cellulari.

1. Riempimento e svuotamento del circuito di prova
   1. Collegare una linea di prolunga da 30 pollici alla porta di iniezione e collegare un serbatoio siringa da 60 ml come imbuto. Aprire il rubinetto del serbatoio in modo che funga da presa d'aria.
   2. Versare il liquido nell'imbuto, sollevandolo secondo necessità per velocizzare la limatura. Riempi l'anello fino a 1-2 cm sotto la presa d'aria nella parte superiore della borsa. Chiudere i rubinetti della presa d'aria e della porta di iniezione.
   3. Per drenare, aprire i rubinetti della presa d'aria e della porta di iniezione e abbassare l'imbuto sotto il livello del banco. Sollevare la pompa sopra la porta di scarico per evacuare il fluido rimanente.
2. Disaerazione del ciclo di test
   NOTA: Eseguire questa procedura quando si riempie il circuito con BSA o sangue prima di avviare la pompa.
   1. Assicurarsi che non vi sia aria intrappolata in nessun punto del circuito. Rimuovi le bolle d'aria sulle superfici picchiettando e stringendo delicatamente il tubo e il serbatoio.
   2. Se si valuta una pompa del sangue a flusso assiale, ruotarla in posizione verticale per rilasciare l'aria attraverso la galleggiabilità. Se si utilizza una pompa centrifuga, capovolgerla e ruotarla per assicurarsi che l'aria non rimanga intrappolata nei percorsi del flusso secondario.
   3. Ispezionare attentamente le sezioni orizzontali dei tubi e le giunzioni tra tubi e connettori per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria.
   4. Spremere la sacca per flebo per avvicinare il livello del fluido alla parte stretta superiore e bloccare la sacca con un emostatico attraverso la linea del fluido per eliminare l'interfaccia fluido-aria. Chiudere il rubinetto di arresto della presa d'aria.
3. Adescamento delle linee di pressione e della porta di campionamento
   1. Chiudere il rubinetto all'estremità delle linee di pressione, rimuovere il tubo del manometro e collegare una siringa da 3 ml. Aprire il rubinetto e aspirare 1-2 ml di liquido nella linea di prolunga (circa 4 cm).
   2. Chiudere il rubinetto, staccare la siringa e ricollegare il tubo del manometro. Aprire il rubinetto per abilitare le letture della pressione.
   3. Adescare il sample porta utilizzando una siringa.
4. Pulizia delle porte di iniezione e campionamento
   1. Taglia o strappa una salvietta priva di lanugine in tre frammenti uguali. Ruota l'angolo di un frammento per formare una punta e inseriscilo nella porta per assorbire il sangue residuo.
   2. Attorcigliare il secondo frammento, inumidirlo con soluzione fisiologica e inserire la punta bagnata nella porta. Attorciglialo attorno alla porta per rimuovere tutto il sangue rimasto.
   3. Utilizzare il terzo frammento per assorbire l'eventuale soluzione salina residua nella porta.
      NOTA: Eseguire questa procedura di pulizia immediatamente dopo aver prelevato un campione di sangue o ogni volta che è presente sangue residuo nelle porte.

5. Passivazione delle superfici a contatto con il sangue

1. Riempire l'ansa con una soluzione di BSA all'1% e azionare il VAD per farlo circolare per almeno 30 minuti.
2. Ispezionare l'anello per verificare la presenza di perdite e rimontarlo se necessario.
3. Drenare completamente la soluzione di BSA per evitare l'emodiluizione.

6. Test della trombosi

1. Preparare il ciclo di prova.
   1. Riempire l'ansa con 150 ml di sangue.
   2. Disaerare il circuito e adescare le linee di pressione e la porta di campionamento come descritto nei passaggi 4.2-4.4.
   3. Avviare la pompa a bassa velocità e farla funzionare per circa 5 secondi per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate all'interno della pompa, quindi arrestare la pompa.
   4. Se compaiono delle bolle nel sacchetto, ripetere il passaggio 4.2 per eseguire nuovamente la disaerazione.
   5. Riavviare la pompa a bassa velocità per far circolare il sangue nel circuito.
2. Aggiungi eparina al sangue nell'ansa.
   1. Trasferire 1 mL di eparina sodica (1000 U/mL) e 1,5 mL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; 0,5 M) dalla confezione del produttore in provette separate per facilitarne la manipolazione durante il test.
   2. Utilizzare la porta trasversale del rubinetto a 3 vie per somministrare le sostanze nell'ansa utilizzando una siringa. Ruotare il luer lock maschio sul rubinetto in modo che la porta di iniezione sia rivolta verso l'alto per intrappolare le bolle d'aria nella parte superiore.
   3. Raggiungere una concentrazione di eparina di 0,5 U/mL nell'ansa aggiungendo 75 U di eparina sodica a 150 mL di sangue. Aspirare 75 U di eparina (75 μL se si utilizza una concentrazione di 1000 U/mL) in una micropipetta e dispensarla in una siringa da 3 mL dispensando contemporaneamente la pipetta e tirando lo stantuffo della siringa. Assicurarsi che tutto il liquido venga trasferito senza fuoriuscire.
   4. Collegare la siringa alla porta di iniezione tramite il luer lock, con la porta rivolta verso l'alto e la punta della siringa rivolta verticalmente verso il basso. Aspirare lo stantuffo della siringa per riempirla di sangue e mescolare l'eparina con il sangue aspirando l'aria nella siringa. Lasciare che la bolla d'aria salga verso l'alto della siringa. Iniettare la miscela nel circuito, assicurandosi che non entri aria.
   5. Far entrare e uscire il sangue dalla siringa 4-5 volte per assicurarsi che il sangue eparinizzato non rimanga confinato nello spazio della porta. Assicurarsi che l'aria non entri nel circuito.
3. Titola l'ATTO del sangue nell'ansa.
   1. Raggiungere una concentrazione iniziale di calcio di 5 mM nell'ansa aggiungendo 750 μL di soluzione di CaCl₂ 1 M a 150 mL di sangue utilizzando la stessa procedura dell'eparina.
      1. Il sangue esposto ad alte concentrazioni di calcio può iniziare a coagulare nella siringa. Iniettare rapidamente il fluido dopo aver rimosso l'aria residua. Facoltativamente, diluire il CaCl₂ nella siringa con 1 ml di soluzione salina tamponata con TRIS per ridurre il rischio di coagulazione prematura.
   2. Lasciare che il CaCl₂ iniettato circoli nell'ansa per almeno 2 minuti prima di prelevare un campione di sangue per misurare l'ACT iniziale.
   3. Collegare una siringa da 1 ml alla porta di campionamento. Prelevare ed eliminare 0,5 ml di sangue di scarto per eliminare il sangue stagnante dalla porta.
   4. Collegare una nuova siringa da 1 ml, prelevare 0,5 ml di sangue per l'analisi e misurare l'ACT. Pulire la porta di campionamento utilizzando la procedura descritta al punto 4.4.
   5. Fare riferimento ai valori di titolazione al punto 3.2 per indicare la concentrazione target di CaCl₂ . Aumentare in modo incrementale la concentrazione di calcio per ottenere un ACT di 300 s. Evitare di aggiungere l'intera quantità di CaCl₂ in una sola volta per evitare una rapida coagulazione.
      NOTA: Nei test utilizzati in questo studio, la concentrazione iniziale di calcio di 5 mM ha portato a un ACT di 450 ± 50 s e la concentrazione finale di 7-8 mM ha prodotto un ACT di 300 ± 20 s. Anche se questa risposta può variare, cerca di portare l'ACT a o al di sotto di 300 s per l'inizio del test.
4. Inizia il test.
   1. Una volta raggiunto l'ACT di 300 s nel ciclo, iniziare il test di 1 ora. Regolare la pompa alla portata e alla pressione desiderate modificando la velocità del rotore e regolando la resistenza utilizzando la fascetta Hoffman.
   2. Misurare l'ACT ogni 15 minuti seguendo i passaggi 6.3.3-6.3.4.
   3. Se l'ACT scende al di sotto di 200 s, iniettare altri 25 U di eparina sodica nel circuito.
5. Termina il test.
   1. Al termine di 1 ora, iniettare EDTA nell'ansa per inibire l'ulteriore coagulazione, mirando a una concentrazione finale di 5 mM nel sangue. (Iniettare 1,5 mL se si utilizza una soluzione di EDTA 0,5 M.)
   2. Lasciare circolare l'EDTA e mescolare per 2 minuti, quindi arrestare la pompa.
6. Scollegare e lavare la pompa.
   1. Clamp il tubo collegato all'ingresso e all'uscita della pompa utilizzando emostatici, posizionando i clamps a 3-4 cm di distanza dalle punte di ingresso e uscita.
   2. Scollegare con cautela il tubo per rilasciare la pompa.
   3. Drenare il sangue dalla pompa e defluire in un contenitore.
   4. Lavare il sangue residuo dalla pompa mediante alimentazione per gravità o pipettaggio di soluzione fisiologica attraverso l'ingresso e l'uscita della pompa.
      NOTA: i passaggi 6.7 e 6.8 vengono eseguiti contemporaneamente.
7. Ispezionare il percorso del flusso della pompa.
   1. Acquisisci immagini dell'ingresso e dell'uscita della pompa utilizzando una telecamera per endoscopio/boroscopio.
   2. Smontare la pompa (se applicabile). Lavare i componenti in un bagno salino e ispezionare la presenza di trombi utilizzando un cannocchiale da dissezione o una lente macro.
   3. Fotografare le superfici a contatto con il sangue per la documentazione.
      NOTA: Un'ispezione coerente e una documentazione approfondita sono fondamentali per i test comparativi.
8. Filtra il sangue usato.
   1. Taglia un pezzo di tessuto a rete di nylon da 100 μm abbastanza grande da coprire l'apertura di un contenitore di raccolta.
   2. Posizionare la rete sopra il contenitore con un leggero telo per consentire al sangue di fluire efficacemente attraverso di esso. Fissare i bordi della rete per evitare che scivoli durante la filtrazione.
   3. Passare il sangue usato attraverso una rete di nylon. Smaltire il sangue secondo le linee guida per la gestione dei rifiuti biologici dell'istituto.
   4. Esaminare la rete alla ricerca di trombi catturati e documentare i risultati.
9. Prepararsi per l'analisi istologica.
   1. Se è prevista un'analisi istologica, fissare eventuali trombi presenti nella soluzione di formalina seguendo le procedure di sicurezza appropriate.
      ATTENZIONE: Utilizzare sempre una cappa aspirante quando si maneggia la formaldeide.

7. Procedura di pulizia

1. Smontare il circuito di flusso. Gettare la sacca di sangue in PVC e il tubo.
2. Immergere tutti gli altri componenti a contatto con il sangue (connettori, rubinetti, luer lock, ecc.) in una soluzione detergente in polvere all'1% di enzima attivo per una notte. Sciacquare con acqua tiepida del rubinetto, seguita da acqua deionizzata e asciugare all'aria.
   1. Se rimangono coaguli, sonicare i componenti nella soluzione detergente. Risciacquare abbondantemente e asciugare all'aria.
3. Pulire la pompa.
   1. Se la pompa può essere smontata, immergere e sonicare i componenti a contatto con il sangue con una soluzione detergente/sgrassante multiuso all'1%, seguita da una soluzione detergente in polvere attiva all'1% per gli enzimi.
   2. Se la pompa non può essere smontata, collegarla a un nuovo circuito di flusso riempito con soluzioni detergenti e farla funzionare ad alta velocità per almeno 30 minuti. Ripetere se necessario.
4. Sciacquare accuratamente la pompa con acqua tiepida del rubinetto, seguita da acqua deionizzata e asciugare all'aria.

L'esecuzione di questo protocollo consente l'identificazione di aree localizzate di deposizione piastrinica, rivelando punti problematici all'interno del percorso del flusso della pompa. L'applicazione coerente di questo protocollo consente miglioramenti incrementali affrontando questi "punti caldi" identificati.

Ad esempio, durante lo sviluppo del PediaFlow PF5 VAD, abbiamo riscontrato problemi nella lucidatura manuale del lato di pressione delle palette dello statore a causa delle dimensioni miniaturizzate dei componenti. I test di trombosi in vitro hanno evidenziato questo problema, poiché la deposizione di piastrine è stata costantemente osservata lungo le radici delle lame, come si vede nella Figura 2A. Un modello di deposizione simile è stato successivamente confermato in uno studio acuto su animali, in cui la pompa è stata collegata extracorporeamente alla circolazione di una pecora e ha funzionato per 3 ore (non dettagliato in questo articolo). Per risolvere questo problema, abbiamo impiegato una tecnica di elettrolucidatura per ottenere una finitura a specchio su questi componenti in titanio, che ha eliminato con successo la formazione di trombi in queste aree (Figura 2B). Questa pompa è stata successivamente impiegata in uno studio in vivo di 7 giorni sugli ovini, che ha anche dimostrato l'assenza di trombosi.

Un'altra caratteristica problematica identificata nei nostri prototipi di pompe era la giunzione tra i componenti dell'alloggiamento di prua e di poppa. Una coaptazione imperfetta in questa giunzione potrebbe creare una fessura in cui il sangue potrebbe penetrare e coagularsi, come si vede nella Figura 3A. Abbiamo testato diversi metodi di lappatura e lucidatura per migliorare l'adattamento di questi componenti e abbiamo utilizzato il metodo del test della trombosi in vitro per valutare i risultati. I miglioramenti sono stati valutati riapplicando il protocollo, che ha confermato la riduzione della formazione di trombi alla giunzione, come dimostrato nella Figura 3B.

È fondamentale distinguere la trombosi causata da un errore sperimentale o da un artefatto dall'effettiva formazione di coaguli all'interno del dispositivo. Diversi fattori possono innescare un'eccessiva coagulazione. Durante la somministrazione della soluzione di CaCl₂ , un piccolo volume di sangue viene aspirato nella siringa per aspirare l'aria intrappolata nella porta, come descritto al punto 6.3.1. Se questo sangue rimane esposto ad un'alta concentrazione di CaCl₂ per troppo tempo, può iniziare a coagulare prematuramente. Quando viene successivamente iniettato nell'ansa, questo sangue coagulato può fungere da nidus per un'ulteriore crescita del coagulo, potenzialmente ingerito nel VAD. La Figura 4 mostra un grande trombo che è stato presumibilmente ingerito in una pompa centrifuga a levitazione magnetica, occludendo il percorso del flusso.

L'iniezione di un grande volume di CaCl₂ in una sola volta può innescare una coagulazione fuori controllo. Per evitare ciò, si raccomanda di aumentare prima la concentrazione di CaCl₂ nell'ansa a 5 mM, controllare l'ACT e quindi procedere con una seconda dose per raggiungere l'ACT target.

I coaguli sferici, poco aderenti, osservati sulle superfici, sono spesso il risultato di bolle d'aria incapsulate all'interno di coaguli, esempi dei quali sono mostrati nella Figura 5A, B. Questi coaguli circolanti possono colpire i bordi d'attacco della girante e delle pale dello statore, creando depositi che assomigliano a macchie di insetti sul parabrezza di un'auto. Ciò sottolinea l'importanza di de-airare completamente il loop come passaggio critico del protocollo. Allo stesso modo, qualsiasi materiale estraneo e detriti che circolano nell'ansa potrebbero essere incapsulati nei trombi e aderire alle superfici della pompa, come mostrato nella Figura 5C, D.

Al contrario, la presenza di trombi ad anello alle giunzioni tubo-connettore, come mostrato nella Figura 6, indica tipicamente che l'ACT era all'interno di un intervallo ottimale che supportava la coagulazione localizzata senza degenerare in coagulazione incontrollata. Le giunzioni tubo-connettori sono note per essere la regione più trombogenica nei circuiti ECMO³⁵. Nella nostra esperienza, questo intervallo ACT ottimale è compreso tra 200 s e 300 s. Se l'ACT durante gli esperimenti scende al di sotto di 200 s, un ulteriore bolo di eparina di 25 u può essere iniettato nel loop.

Evitare le insidie sopra descritte e garantire un'esecuzione coerente del protocollo massimizzerà la sua utilità nell'identificare potenziali rischi trombogenici nelle prime fasi del processo di sviluppo del VAD, consentendo miglioramenti mirati prima di passare agli studi sugli animali.

Figura 1: Schema del circuito di flusso di prova. (A) Circuito di flusso di prova per una pompa con punte di afflusso e deflusso da 1/4" e (B) per una pompa con punte di mandata e mandata da 3/8". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Miglioramento iterativo e valutazione di prototipi VAD utilizzando il protocollo di trombosi in vitro . (A) La deposizione piastrinica è stata osservata costantemente lungo le radici delle palette dello statore nella versione lucidata manualmente della pompa. (B) Questo problema è stato risolto nella versione elettrolucidata. In entrambi i test, l'ACT è stato mantenuto tra 250 s e 300 s e la pompa è stata azionata a 2,5 L/min per 1 h. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Il protocollo di trombosi in vitro è stato utilizzato per risolvere il problema dell'adattamento imperfetto tra i componenti di accoppiamento dell'alloggiamento della pompa. (A) Il design di base soffriva di una coaptazione imperfetta in questa giunzione, che portava a un ristagno e coagulazione del sangue in quello spazio. Riquadro: il coagulo risultante, estratto e allungato tra due tamponi di cotone. (B) Un design rivisto con un montaggio migliorato ha eliminato questo problema. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Un grande trombo che occlude il percorso del flusso di una pompa centrifuga a levitazione magnetica, presumibilmente derivante da un errore sperimentale durante l'iniezione di CaCl₂ nel circuito di flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Coaguli di condensazione ad adesione lossa, materiale estraneo e detriti. (A,B) I coaguli sferici ad adesione debolmente osservati sulle superfici sono spesso il risultato di bolle d'aria incapsulate all'interno di coaguli. (C, D) Qualsiasi materiale estraneo e detriti che circolano nel circuito potrebbero incapsularsi in trombi che aderiscono alle superfici della pompa o colpire i bordi d'attacco (LE) delle pale della girante e dello statore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Trombo ad anello. (A) Un trombo ad anello formato alla giunzione tubo-connettore. (B) Il trombo anulare disposto accanto a una lama di rasoio in acciaio inossidabile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La prima sperimentazione sull'uomo di una nuova pompa è sempre un'impresa precaria, poiché gli studi preclinici non possono prevedere in modo affidabile la trombogenicità dei VAD nell'uomo²⁶. In particolare, alcuni VAD che hanno dimostrato l'assenza di trombosi negli studi sugli animali hanno successivamente mostrato una significativa trombogenicità nell'uso clinico³⁶. Un aggressivo regime di test in vitro, specificamente progettato per provocare la trombosi, offre una preziosa opportunità per identificare potenziali difetti di progettazione o produzione nelle prime fasi del processo di sviluppo. Sebbene questo protocollo non possa offrire una previsione definitiva delle future prestazioni in vivo di un VAD, questo approccio proattivo può rivelare potenziali hotspot di trombosi che possono emergere in condizioni di procoagulante.

I metodi in vitro esistenti per la trombosi VAD variano notevolmente per quanto riguarda la durata del test e le strategie anticoagulanti. Hastings et al. hanno condotto test con sangue suino altamente eparinizzato per un periodo di 48 ore, replicando con successo i modelli di trombosi osservati clinicamente nelle pompe ECMO³⁷. Al contrario, gli studi pionieristici di Schima et al. hanno utilizzato la protamina per abbassare l'ACT del sangue eparinizzato a 3 volte il suo valore basale all'inizio del test, terminando l'esperimento quando l'ACT è sceso a 1,5 volte il basale²³. Questo approccio innovativo ha compresso i tipici studi in vivo di 2 o 3 giorni in appena 1 o 3 ore di test in vitro .

Maruyama et al. hanno sistematicamente confrontato l'uso di complessi citrato-calcio ed eparina-protamina per i test della trombosi, in cui il cloruro di calcio viene aggiunto per invertire l'azione del citrato e il solfato di protamina viene utilizzato per neutralizzare l'eparina²⁷. Hanno concluso che la ricalcificazione del sangue cittrato forniva una risposta ACT più graduale e monotona. Utilizzando il complesso citrato-calcio, Maruyama e colleghi hanno ottenuto un controllo preciso dell'ACT, mantenendolo a 200 s per un test di 2 ore. Il loro studio in vitro che ha confrontato più prototipi di pompe ha replicato efficacemente i modelli di trombosi osservati negli studi sugli animali.

Sebbene il protocollo qui descritto sia in gran parte basato sul metodo di Maruyama, abbiamo cercato di affrontare due ostacoli chiave alla sua più ampia accessibilità. In primo luogo, lo studio di Maruyama ha utilizzato componenti bioattivi del circuito di flusso rivestiti di eparina, che possono essere costosi e difficili da reperire. Abbiamo semplificato l'approccio aggiungendo direttamente una quantità fissa di eparina al sangue e utilizzando componenti del circuito di test prontamente disponibili da fornitori comuni. In secondo luogo, il loro metodo richiedeva iniezioni multiple di cloruro di calcio e citrato trisodico durante il test per mantenere un ACT costante. Al contrario, questo protocollo avvia i test a un ACT più elevato ed evita la necessità di continui aggiustamenti, riducendo così la complessità e il potenziale di errori procedurali. Questi adattamenti rendono il protocollo di questo studio più accessibile alla maggior parte dei laboratori che conducono test del sangue in vitro dei VAD.

Sebbene questo protocollo affronti le principali barriere tecniche, il suo successo e la sua utilità finale dipendono ancora dall'esecuzione attenta e coerente di ogni fase sperimentale. Un aspetto critico di questo protocollo è l'accurata disaerazione dell'ansa e l'attento metodo di iniezione di sostanze nel circuito senza generare emboli d'aria. Il fallimento in una di queste aree potrebbe introdurre artefatti che potrebbero confondere i risultati inducendo un'eccessiva trombosi.

È fondamentale che non siano presenti bolle d'aria e interfacce sangue-aria nel circuito prima di iniziare il test. Eventuali bolle d'aria che circolano nel circuito potrebbero incapsularsi in coaguli e molto probabilmente si depositeranno sui bordi d'attacco della girante e delle pale dello statore. La linea di pressione lato ingresso presenta il rischio maggiore di immissione di aria a causa della bassa pressione creata a monte dell'ingresso della pompa. Quando si avvia la pompa e si aumenta la sua velocità, la colonna d'aria nella linea di pressione verrà aspirata nel flusso. Per evitare ciò, le linee di pressione vengono pre-innescate con BSA o sangue, come descritto nel passaggio 4.3. Sebbene la disaerazione sia particolarmente importante quando si lavora con il sangue, si consiglia anche di disaerare prima di far circolare la BSA. Questa precauzione è necessaria perché l'ingestione e la rottura di emboli d'aria di grandi dimensioni possono produrre schiuma che può persistere dopo aver drenato la soluzione di BSA e potenzialmente interferire con i test successivi.

Il metodo di iniezione delle soluzioni di eparina e CaCl₂ richiede una tecnica precisa e un'esecuzione attenta, poiché il lavaggio ripetuto della siringa aumenta il rischio di introdurre emboli d'aria. Per mitigare questo rischio si potrebbe prendere in considerazione l'incorporazione di una siringa motorizzata programmata per erogare volumi precisi di sostanze. Tale apparato consentirebbe anche l'iniezione continua di eparina durante il test, calibrata per mantenere l'ACT a un livello costante, riducendo così la variabilità causata dai cambiamenti nella dinamica della coagulazione nel tempo.

Ci sono limitazioni a questo metodo, in particolare le condizioni di stato stazionario in vitro, che differiscono dalle condizioni di flusso pulsatile in vivo. Sebbene siano disponibili loop pulsatili in vitro , richiedono un numero maggiore di componenti, aggiungendo complessità che possono potenzialmente introdurre artefatti.

Un altro aspetto degno di nota di questo protocollo è che i test sono stati condotti a temperatura ambiente piuttosto che alla temperatura fisiologica di 37 °C. Mentre la temperatura fisiologica imiterebbe meglio le condizioni in vivo , posizionare il circuito di flusso in una camera riscaldata e mantenere costantemente i 37 °C è stato difficile a causa della necessità di un accesso frequente al circuito di flusso durante gli esperimenti. È stata anche presa in considerazione l'immersione del serbatoio di sangue in un bagno d'acqua riscaldato; Tuttavia, questo approccio era incompatibile con l'attuale configurazione ad anello verticale, che riduce al minimo gli artefatti sperimentali facilitando il trasporto di bolle d'aria verso la parte superiore del serbatoio di sangue.

Inoltre, lo studio di Patel et al. ha valutato l'impatto della temperatura sui test di trombosi in vitro con sangue ovino e bovino³⁸. I loro risultati suggeriscono che il test a temperatura ambiente offre una migliore sensibilità rispetto al test a 37 °C e consente durate di test più brevi (1 ora contro 2 ore). Considerando l'ulteriore vantaggio dell'eliminazione delle ingombranti apparecchiature di riscaldamento, essi propongono che i test a temperatura ambiente siano un'opzione praticabile e pratica per la valutazione della trombogenicità in vitro dei biomateriali.

Questo protocollo si basa sul rilevamento visivo della formazione di trombi, il che lo rende particolarmente adatto per VAD con alloggiamenti trasparenti o rimovibili. Per i dispositivi con alloggiamenti permanenti e opachi, l'ispezione diretta per la deposizione di trombi è più impegnativa senza compromettere l'integrità strutturale del dispositivo. In tali casi, l'uso di telecamere a fibre ottiche flessibili può fornire una soluzione parziale, consentendo un'ispezione interna limitata.

Infine, fattori come la scelta della specie di donatore, il metodo di raccolta, il tipo di anticoagulante utilizzato e l'età del sangue possono influenzare la risposta trombogenica. Le concentrazioni di eparina e calcio fornite in questo protocollo sono valori di riferimento specifici per la configurazione utilizzata in questo studio. Inoltre, le misure ACT possono variare tra i diversi strumenti 32,33,34. Pertanto, questo protocollo può richiedere regolazioni di precisione attraverso tentativi ed errori per determinare l'intervallo ACT ottimale per una determinata configurazione di laboratorio.

Per migliorare ulteriormente la coerenza tra gli esperimenti, gli studi futuri potrebbero incorporare elementi del test ASTM F2888-19 come misura di controllo, utilizzando il sangue ricalcificato dalla fase di titolazione per la valutazione concomitante della trombogenicità nei materiali di riferimento^39,40. Questo approccio ridurrebbe la dipendenza dal raggiungimento di un ACT standardizzato, poiché questa metrica potrebbe non tenere pienamente conto delle variazioni di coagulabilità derivanti da differenze nelle proprietà del sangue come l'ematocrito, la conta piastrinica e la concentrazione totale di proteine.

Nonostante queste limitazioni, questo metodo di test rimane uno strumento prezioso per l'identificazione precoce dei rischi trombogenici durante lo sviluppo del VAD e offre un approccio pratico e accessibile per migliorare iterativamente la sicurezza del dispositivo prima di passare agli studi sugli animali.

S.E.O. attualmente lavora come consulente per Magenta Medical e in precedenza è stato consulente presso Boston Scientific. Nessun altro autore ha informazioni finanziarie rilevanti o conflitti di interesse da segnalare.

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health grant R01HL089456 e dal progetto numero W81XWH2010387 dell'attività di acquisizione della ricerca medica dell'esercito degli Stati Uniti.