Imunohistoquímica Fluorescente Cíclica Multiplex

A imunohistoquímica cíclica multiplex permite a detecção in situ de múltiplos marcadores simultaneamente usando incubação antígeno-anticorpo repetida, varredura de imagens e alinhamento e integração de imagens. Aqui, apresentamos o protocolo operacional para identificação de substratos de células imunes com essa tecnologia em amostras de câncer de pulmão e metástases cerebrais pareadas.

O microambiente tumoral envolve interações entre células hospedeiras, células tumorais, células imunes, células estromais e vasculatura. Caracterizar e organizar espacialmente subgrupos de células imunes e proteínas-alvo são cruciais para fins prognósticos e terapêuticos. Isso levou ao desenvolvimento de métodos de coloração imunoistoquímica multiplexada. A imunohistoquímica por fluorescência multiplex permite a detecção simultânea de múltiplos marcadores, facilitando uma compreensão abrangente da função celular e das interações intercelulares. Neste trabalho, descrevemos um fluxo de trabalho para o ensaio de imunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex e sua aplicação na análise de quantificação de subgrupos de linfócitos. A coloração por imunoistoquímica fluorescente cíclica multiplex segue etapas e reagentes semelhantes aos da imunohistoquímica padrão, envolvendo recuperação de antígenos, incubação cíclica de anticorpos e coloração em lâmina de tecido fixada em formalina e emblocada em parafina (FFPE). Durante a reação antígeno-anticorpo, uma mistura de anticorpos de diferentes espécies é preparada. Condições, como tempo de recuperação de antígenos e concentração de anticorpos, são otimizadas e validadas para aumentar a relação sinal-ruído. Esta técnica é reprodutível e serve como uma ferramenta valiosa para pesquisas em imunoterapia e aplicações clínicas.

As metástases cerebrais (MB) representam os tumores mais comuns do sistema nervoso central (SNC), ocorrendo em quase metade dos casos de câncer de pulmão não pequenas células (CPNPC), com mau prognóstico1^. Estima-se que 10%-20% dos pacientes com CPNPC já apresentam MB no momento do diagnóstico inicial, e aproximadamente 40% dos casos de CPNPC desenvolverão MB durante o curso do tratamento². O microambiente tumoral (TME) está intimamente associado à ocorrência de CPNPC e MB, incluindo vários componentes, como vasos sanguíneos, fibroblastos, macrófagos, matriz extracelular (MEC), células imunes linfoides, derivadas da medula óssea e moléculas sinalizadoras ^3,4. As células imunes microambientais desempenham um papel crucial na influência do crescimento e desenvolvimento de células cancerosas. Metástases cerebrais apresentam inúmeros alvos potenciais de tratamento caracterizados por microambientes imunológicos complexos e processos de sinalização. Por exemplo, os inibidores de PD-1 demonstraram eficácia clínica para pacientes com metástase cerebral de câncer de pulmão (MBCL) como um inibidor de ponto de verificação imunológica (ICI). No entanto, a frequência de respostas à terapia com PD-1 varia entre CPNPC primário e MCCBL⁵, sugerindo que o microambiente imune tumoral atua como um regulador crítico da ICI.

A imuno-histoquímica (IHQ) é uma ferramenta valiosa nos campos da biologia, medicina de fundação e patologia⁶. Esse método de detecção visualiza a expressão antigênica através da interação antígeno-anticorpo em uma lâmina^tecidual7. A imunoistoquímica é utilizada para diagnosticar marcadores preditivos, avaliar marcadores prognósticos, orientar terapias-alvo e explorar as funções biológicas das células^tumorais8. No entanto, o método tradicional de IHQ só pode detectar um biomarcador de cada vez. Para suprir essa limitação, a inovação da tecnologia imunoistoquímica levou ao desenvolvimento da imunohistoquímica por fluorescência multiplex (mfIHC), que permite a identificação simultânea de múltiplos marcadores proteicos na mesma lâmina tecidual, tanto em campo claro quanto em campo^{fluorescente9}. Esse avanço fornece uma análise precisa da composição celular e das interações moleculares entre células estromais, células imunes e células cancerosas dentro da TME.

Neste estudo, apresentamos um protocolo de imunohistoquímica cíclica multiplex para analisar a distribuição espacial das células imunes. Dois anticorpos primários de espécies diferentes, como coelho e rato, são escolhidos para incubação simultaneamente, seguidos por anticorpos secundários marcados com fluorescência. A recuperação do antígeno é realizada após cada rodada de reação antígeno-anticorpo. A autofluorescência é bloqueada e 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) é usado para colorir os núcleos. O painel inclui detecção sequencial de CD3, CD8, CD20 e CK, as células são categorizadas de acordo com os marcadores: células tumorais (CK+), células T maduras (CD3+), células T citotóxicas (CD3+CD8+), células B (CD20+)^10,11.

A pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética médica do Yunnan Cancer Hospital/Third Affiliated Hospital da Kunming Medical University. Todos os sujeitos/responsáveis assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Preparação do slide

1. Cortes de blocos de parafina pareados contendo células de metástases cerebrais de tumor primário de pulmão ou câncer de pulmão com espessura de 4 μm usando micrótomo. Retire as seções para regar e separe com uma pinça, escolha a melhor e cole-a na lâmina revestida de polilisina.
2. Coloque as lâminas dos tecidos em estufa a 65 °C durante 30 minutos para aumentar a adesão tecidual.
3. Mergulhe as lâminas em xileno através de três mudanças, cada uma com duração de 10 min.
4. Reduzir gradualmente a concentração de álcool e incubar as lâminas em etanol 100% por 5 min, etanol 90% por 5 min, etanol 75% por 5 min e em água deionizada por 3 min.

2. Recuperação de epítopo induzida pelo calor (HIER)

1. Diluir 100x solução tampão citrato de sódio (pH 6,0) a 1x (10 mM) em água deionizada, preparando solução tampão suficiente para submergir completamente as lâminas.
2. Coloque as corrediças em uma panela de pressão, submetendo-as a fogo alto (100 °C) e pressão (~30 psi) por 2 min. Após o aquecimento, deixe as lâminas arrefecerem até à temperatura ambiente em água destilada durante 3 min.
3. Dissolver um pacote de 52 g de solução salina tamponada com fosfato (PBS; em pó) em 5 L de água deionizada para preparar solução tampão PBS (pH 7,0). Coloque as lâminas em solução tampão PBS por 5 min, com 3 trocas.

3. Bloqueio da peroxidase

1. Cobrir as secções com peróxido de hidrogénio a 3% e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Enxágue as lâminas em PBS, 3x por 5 min cada.
2. Use papel filtro para absorver o excesso de água longe do perímetro do tecido. Enquanto isso, certifique-se de que o tecido esteja úmido.

4. Incubação primária de anticorpos para a primeira rodada

1. Preparar uma mistura funcional dos anticorpos primários para CD8 (anticorpo monoclonal de coelho, clone SP16) e CD20 (anticorpo monoclonal de camundongo, clone L26), diluídos 1:50 em diluente primário de anticorpos Bond.
2. Adicione o complexo de anticorpos às secções e incube durante 1 h à temperatura ambiente.
3. Preparar uma solução de solução salina tamponada com tpolo 0,1% de Tween/fosfato: 1 ml de Tween em 1 L de solução tampão PBS.
4. Lavar os cortes com solução salina tamponada com tpolo 0,1%, 3x por 5 min cada. Use papel filtro para retirar o excesso de água do perímetro do tecido, enquanto isso, certifique-se de que o tecido esteja úmido.

5. Incubação de anticorpos secundários para a primeira rodada

1. Preparar uma mistura de anticorpo anti-coelho de cabra marcado com fluorescência (Excitação (Ex): 495 nm) e anticorpo anti-rato de cabra (Ex: 578 nm), diluído 1:50 em solução salina tampão fosfato. O anticorpo de cabra anti-coelho liga-se ao anticorpo primário de CD8, e o anticorpo de cabra anti-camundongo liga-se ao anticorpo primário de CD20.
2. Adicione a mistura de anticorpos secundários gota a gota e incube à temperatura ambiente durante 1 h.

6. Recuperação de epítopos induzida pelo calor e bloqueio da peroxidase

1. Diluir 100x citrato de sódio (pH 6,0) a 1x (10 mM) em água deionizada, preparando solução tampão suficiente para submergir completamente as lâminas.
2. Coloque as corrediças em uma panela de pressão e submeta-as a fogo alto (100 °C) e pressão (~30 psi) por 1 min. Após o aquecimento, coloque as lâminas em água destilada para arrefecer até à temperatura ambiente durante 3 min.
3. Execute o bloqueio da peroxidase conforme descrito na etapa 3.

7. Incubação de anticorpos primários para segunda rodada

1. Preparar uma mistura funcional dos anticorpos primários para CD3 (anticorpo monoclonal de coelho, clone SP7) e CK (anticorpo monoclonal de camundongo, MX005), diluídos 1:50 em diluente primário de anticorpos.
2. Adicione o complexo de anticorpos às secções e incube durante 1 h à temperatura ambiente.
3. Lavar com solução salina tamponada com tpolo 0,1%, 3x por 5 min cada. Use papel filtro para retirar o excesso de água do perímetro do tecido, enquanto isso, certifique-se de que o tecido esteja úmido.

8. Incubação de anticorpos secundários para segunda rodada

1. Preparar a mistura de anticorpos anti-coelho (Ex: 652 nm) e anticorpo anti-rato de cabra (Ex: 590 nm), diluindo 1:50 em solução salina tampão fosfato. O anticorpo de cabra anti-coelho liga-se ao anticorpo primário de CD3, e o anticorpo de cabra anti-camundongo liga-se ao anticorpo primário de CK.
2. Adicionar mistura de anticorpos secundários gota a gota, incubar à temperatura ambiente por 1 h. Lavar com solução salina tamponada com tpolo 0,1%, 3x por 5 min cada.

9. Têmpera de autofluorescência e coloração DAPI

1. Adicionar reagente (0,15 M/L KMnO₄) ao corte de tecido por 1 min. Enxágue com água corrente por 5 min.
   CUIDADO: KMnO₄ é tóxico e danifica a pele. Certifique-se de usar luvas ao manusear os slides. Se o líquido pingar na pele, limpe-o rapidamente com guardanapos limpos e lave com água corrente.
2. Secar a lâmina com concentrações crescentes de álcool (70%, 90%, 100%), por 3 min em cada concentração.
3. Adicione DAPI e lamínula para imagens multiespectrais. A quantidade de DAPI depende do tamanho do tecido. Certifique-se de que o tecido está completamente coberto por DAPI após a adição da lamínula.

10. Digitalização de slides

1. Coloque as corrediças em uma bandeja e empurre até que não possa ser empurrada mais.
2. Para iniciar o programa, clique duas vezes no ícone do programa na área de trabalho. Durante a inicialização, a janela de seleção de modo é exibida. A janela de seleção exibe dois modos de campo brilhante e fluorescente: modo automático e modo manual. No modo de varredura fluorescente, clique em Modo Automático.
3. Mover o cursor do mouse sobre ? para exibir as informações sobre as configurações. Clique em Configuração do Filtro > Canal de Filtro para escolher o Número do Canal > Pseudocor. Defina a cor e salve.
4. Clique em Trabalho de rotina > modo de varredura > Automático completo. Clique em Trabalho de Rotina > Nome do Slide para definir o nome do slide para a saída. Clique em Configurações de Canal > de Trabalho de Rotina para escolher filtros.
5. Clique em Opções de Rotina de Trabalho > Verificação para determinar a qualidade resultante e o local de armazenamento do slide virtual.
6. Clique em Visualizar para configuração de limite e seleção do intervalo a ser verificado.
7. Clique em Filtros de > de Hardware > Foco Automático de > ao Vivo > Exposição Automática > Ganho Digital > Tick use tempo de exposição manual > Tick limitando o intervalo > Definir Corrente.
8. Clique em Trabalho de rotina > Iniciar varredura. Selecione o nível de ampliação como 20x ou 40x. Escolha 20x para tamanhos de arquivo apropriados. A extensão MRXS é definida pelo scanner MIDI pannorâmico 3D. A extensão de imagem também pode ser alterada para imagem TIFF.
9. Clique em Visualizador de Slides > Caixa de Ferramentas Multiview para escolher a imagem para confocal e, em seguida, alinhe e integre a imagem.

11. Avaliação quantitativa da densidade celular

1. Quantifique porcentagens de células imunes positivas (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) em áreas tumorais e estromas com o software de scanner Halo 10. Validar a coloração de CK para definir o tecido tumoral.

Apresentamos um protocolo para detecção cíclica de antígenos usando fluorescência multiplex de 5 cores em uma única lâmina. Através da otimização do ensaio, possibilitamos a incubação de dois anticorpos de espécies diferentes (Figura 1). Os dispositivos necessários para o procedimento experimental incluem panela de pressão e caixa de imunomarcação (Figura 2A).

Após o término do ensaio, definimos a pseudocor dos quatro marcadores antes de escanear as lâminas. As pseudocores de CD3, CD8, CD20 e CK são amarelo, vermelho, verde e ciano, respectivamente. Os núcleos são marcados com DAPI. Regiões representativas do tumor e estroma são selecionadas para análise. O espectro fluorescente em 495 nm, 578 nm, 652 nm e 590 nm é capturado usando scanner digital automático 3D. Uma imagem representativa de pilha e imagens marcadas com marcação única no tecido de metástases cerebrais de câncer de pulmão são mostradas na Figura 2B. Com base em imagens contendo sinal de fluorescência de marcador único, o software do scanner extraiu características fenotípicas celulares baseadas em pseudocor. Números correspondentes de células imunes positivas e células imunes totais também foram contados. Os níveis de proteína corados em cada proteína são quantificados nos tecidos detectados calculando-se o H-score¹². Após esses procedimentos, o número de cada tipo de linfócitos infiltrantes no tumor e a proporção de cada tipo celular no número total de células-alvo são contados e analisados. A proporção de cada tipo de célula imune apresenta a porcentagem efetiva de linfócitos infiltrantes do tumor. A porcentagem de células T CD3+, CD3+CD8+ e células B CD20+ foi analisada em metástases cerebrais de câncer de pulmão em comparação com cortes primários de câncer de pulmão. Resultados representativos são mostrados na Figura 3. A densidade de células imunes (células T CD3+, células T CD3+ CD8+) é menor nas metástases cerebrais de câncer de pulmão do que no câncer primário de pulmão. As células B CD20+ são mais elevadas no grupo de metástases cerebrais do que no grupo de câncer de pulmão primário. No entanto, os resultados não diferem significativamente entre esses dois grupos para as amostras limitadas.

Figura 1: Fluxo de trabalho da coloração imunoistoquímica por fluorescência cíclica multiplex. As seções de 4 μm são cortadas e aderidas em lâmina adesiva. As seguintes etapas operacionais são realizadas: desparafinização e reidratação, recuperação de antígenos, recuperação de antígenos, bloqueio de antígenos, incubação de mistura primária de anticorpos, incubação secundária de anticorpos, repetindo as etapas de recuperação de antígenos, bloqueio de antígenos, incubação de mistura de anticorpos primários e incubação de anticorpos secundários, seguido de redução de autofluorescência, seleção do filtro apropriado para varredura de lâminas e análise dos resultados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Métodos de operação da coloração imunoistoquímica por fluorescência multiplex. O tratamento antigênico é realizado pelo aquecimento de seções em uma panela de pressão. (A) A panela de pressão é usada para recuperação de epítopos induzida pelo calor. No processo de incubação de anticorpos, as lâminas são colocadas na caixa de imunomarcação. (B) Imagens representativas compostas e de coloração única para o painel usado no tecido de metástases cerebrais de câncer de pulmão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Proporção de células imunes dentro de metástases cerebrais de câncer de pulmão primário e câncer de pulmão. A proporção de células imunes CD3+, CD3+CD8+, CD20+ em quatro tecidos de metástases cerebrais de câncer de pulmão é menor do que os tecidos de câncer primário de pulmão pareados (barras de erro: desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Descrevemos o processo para coloração imunoistoquímica por fluorescência cíclica multiplex. A seleção primária de anticorpos é um aspecto crucial do ensaio imunohistoquímico de fluorescência, e anticorpos monoclonais são recomendados para melhor especificidade e repetibilidade. Para otimizar a concentração de trabalho do anticorpo primário, uma série de diluições tem sido testada através de experimentos de imunohistoquímica. Tanto os controles positivos (para avaliar a expressão do antígeno alvo) quanto os controles negativos (sem incubação primária de anticorpos) são essenciais e devem ser estabelecidos.

Neste protocolo, os anticorpos primários são diluídos e preparados para uma mistura de diferentes espécies. Os anticorpos secundários marcados com fluorescência também são agrupados e incubados da mesma forma, derivados de espécies diferentes. Assim, a etapa crítica é escolher a espécie para diferentes anticorpos primários com base nos antígenos, e o anticorpo monoclonal é preferido em comparação com o anticorpo policlonal. Estes podem garantir que a combinação entre o anticorpo primário e o anticorpo secundário seja específica. O líquido misto deve atingir a concentração de trabalho para ambos os anticorpos primários e a reatividade cruzada não deve existir entre os dois anticorpos simultaneamente. Se os anticorpos primários forem da mesma espécie, um anticorpo secundário é incubado primeiro, depois o segundo. Ao determinar a sequência de incubação de anticorpos primários em um painel, deve-se dar prioridade aos anticorpos que são sensíveis à reação antígeno-anticorpo, para os antígenos de baixa expressão, a intensidade se fortaleceria durante a recuperação do segundo epítopo. Antes da segunda rodada de incubação de anticorpos, a recuperação repetida do antígeno leva menos tempo (1 min) em comparação com a primeira operação (2 min). A intensidade da fluorescência da coloração cíclica prévia não diminuirá, embora os cortes sofram recuperação induzida pelo calor duas vezes. Para evitar imunorreatividade inespecífica, as condições de incubação precisam ser otimizadas, incluindo concentração de trabalho de anticorpos, tempo de incubação e temperatura ambiental.

Vários métodos de recuperação de epítopos foram desenvolvidos nas últimas décadas, principalmente divididos em recuperação de epítopo induzida por calor (HIER) e recuperação de epítopo induzida por protease (PIER). O aquecimento é um método eficiente de recuperação antigênica que expõe epítopos de antígenos, tornando-os mais efetivamente detectados por anticorpos¹³. As duas principais opções para recuperação de antígenos são baseadas em tampão citrato e tampão EDTA de alto pH¹⁴. A condição de recuperação otimizada é identificada de acordo com o antígeno alvo.

A autofluorescência pode interferir na imagem fluorescente em cortes causados por fluoróforos endógenos e reagentes utilizados no processamento tecidual¹⁵. O uso de um reagente associado é necessário para a eluição . Os fluoróforos são selecionados com picos de emissão, evitando-se picos de autofluorescência (em torno de 490 nm)^16,17. Sudan Black B e NaBH4 têm sido relatados por extinguir a autofluorescência tecidual^18,19. A combinação de Sudan Black B e NaBH4 reduziu a fluorescência de fundo em tecido alvo fixado em formalina²⁰. Neste protocolo, o tratamento tecidual do KMnO₄ em uma concentração de 0,15 M/L economiza tempo por 1 min. O KMnO₄ cobre uma camada no tecido para proteger a fluorescência espontânea e reduz a fluorescência de fundo, a coloração específica da proteína detectada é mais visualizada.

As lâminas inteiras são escaneadas em quatro canais de filtros diferentes, a análise do alinhamento das imagens é necessária, é um grande desafio alinhar a localização de estruturas unicelulares e subcelulares. Para imagens multiespectrais desta técnica, equipamentos profissionais de imagem de luz e software de análise quantitativa são necessários para evitar crosstalk espectral. O custo dispendioso do instrumento limita a sua aplicação. A co-incubação de dois anticorpos economiza tempo, especialmente quando se trata de um painel de 6 marcadores, que requer 3 ciclos de incubação. Esta técnica é utilizada para visualizar a caracterização mais detalhada de células imunes em microambientes imunes tumorais. No futuro, o método será aplicado para análise quantitativa de estruturas linfoides terciárias associadas ao tumor.

Em resumo, a imunohistoquímica por fluorescência cíclica multiplex permite que múltiplos alvos sejam corados por fluoróforos marcados individualmente em uma única lâmina. Este ensaio fornece uma melhor compreensão da distribuição espacial das pilhas no microambiente imune do tumor, e a proximidade espacial das pilhas imunes do tumor contribui para a selecção dos pacientes que beneficiarão da imunoterapia.

Os autores declaram não ter interesses financeiros ou relações pessoais concorrentes conhecidos que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NO.81860413, 81960455), Fundo do Departamento de Ciência e Tecnologia de Yunnan (202001AY070001-080), Fundação de Pesquisa Científica do Departamento de Educação da Província de Yunnan (2019J1274).