Visualização e quantificação de interações endógenas intra-organelas em sítios de contato ER-mitocôndrias por ensaios de ligadura de proximidade

A necessidade de novas abordagens para o estudo dos sítios de contato com membranas (SCM) tem crescido devido ao crescente interesse no estudo dessas estruturas celulares e seus componentes. Aqui, apresentamos um protocolo que integra tecnologias de microscopia previamente disponíveis para identificar e quantificar complexos proteicos intra-organelas e interorganelas que residem em SCGs.

Sítios de contato com a membrana (MCSs) são áreas de proximidade da membrana que permitem e regulam a troca dinâmica de diversas biomoléculas (isto é, cálcio e lipídios) entre as organelas justapostas sem envolver a fusão da membrana. Os SCG são essenciais para a homeostase celular, e suas funções são asseguradas pelos componentes residentes, que muitas vezes existem como complexos proteicos multiméricos. Os SCMs frequentemente envolvem o retículo endoplasmático (RE), um importante local de síntese lipídica e armazenamento celular de cálcio, e são particularmente importantes para organelas, como as mitocôndrias, que são excluídas das vias clássicas de transporte vesicular. Nos últimos anos, os SCG entre o RE e as mitocôndrias têm sido extensivamente estudados, pois suas funções impactam fortemente o metabolismo celular/bioenergética. Várias proteínas começaram a ser identificadas nesses sítios de contato, incluindo cabos de membrana, canais de cálcio e proteínas de transferência de lipídios, levantando a necessidade de novas metodologias e abordagens técnicas para estudar esses componentes da MCS. Aqui, descrevemos um protocolo que consiste em abordagens técnicas combinadas, que incluem ensaio de ligadura de proximidade (PLA), coloração mitocondrial e segmentação de imagem 3D, que permite a detecção de proteínas fisicamente próximas (>40 nm) entre si e que residem na mesma membrana em MCSs de mitocôndrias de RE. Por exemplo, usamos duas proteínas de transferência lipídica ancoradas em RE, ORP5 e ORP8, que já demonstraram interagir e se localizar em MCSs de membrana plasmática de RE e ER-membrana plasmática. Ao associar o PLA ORP5-ORP8 com a análise de software de imagem celular, foi possível estimar a distância do complexo ORP5-ORP8 da superfície mitocondrial e determinar que cerca de 50% da interação ORP5-ORP8 PLA ocorre em subdomínios de RE próximos às mitocôndrias.

A comunicação interorganela é uma característica definidora das células eucarióticas. Uma maneira pela qual as organelas se comunicam é formando sítios de contato com a membrana (MCSs), que são oposições de membrana próximas entre duas organelas que são mantidas por proteínas estruturais e funcionais, como amarrações, proteínas de transferência de lipídios e canais de cálcio¹. Os SCGs podem ser estabelecidos entre organelas semelhantes ou diferentes e medeiam a troca de componentes celulares, o que é importante para a manutenção da homeostase celular. Até o momento, vários SCMs foram identificados, incluindo retículo endoplasmático (RE)-mitocôndrias, RE-membrana plasmática (PM) e contatos RE-gotículas lipídicas (DL)¹. Dentre elas, as formadas entre o RE e as mitocôndrias (MERCSs) estão entre as mais estudadas, pois estão envolvidas na regulação de diversas funções celulares, incluindo a homeostase lipídica e do^cálcio2. Como as mitocôndrias são amplamente excluídas das vias de transporte vesicular clássicas, elas dependem do MERCS e de seus constituintes moleculares para importar lipídios chave ou precursores lipídicos do RE. O transporte não vesicular desses lipídios através dos MERCSs garante a manutenção da composição lipídica mitocondrial adequada, bem como sua integridade funcional e estrutural³.

Dado o envolvimento crucial dos MCSs em várias funções celulares, o interesse em fornecer uma compreensão mais profunda de seus componentes moleculares tem aumentado muito nos últimos anos. Vários tipos de abordagens baseadas em imagem têm sido usados para avançar o conhecimento sobre os SCGs. Dentre eles, o ensaio de ligadura de proximidade (PLA) baseado em sonda de fluorescência tem sido amplamente utilizado como um indicador da abundância de MCSs por meio da detecção de interações proteína-proteína interorganela (em uma faixa de detecção de 40 nm) em níveis endógenos⁴. Por exemplo, MERCSs foram visualizados e quantificados usando PLA entre vários pares de proteínas mitocondria-RE, incluindo VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 e PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Embora essa tecnologia tenha sido utilizada para detectar e quantificar interações proteína-proteína interorganelas presentes no ACM 5,7,9,10,11^, a maioria dos estudos não combinou PLA com coloração de organela. Consequentemente, um método quantitativo que permita medir a proximidade entre as interações do PLA e organelas associadas ainda não foi desenvolvido. Assim, até o momento, no caso das proteínas de RE, sua interação dentro de subdomínios de membrana em contato com outras organelas não foi distinguida de sua interação dentro da rede de RE amplamente distribuída.

Aqui, descrevemos um protocolo para detectar interações de PLA entre proteínas que residem na membrana da mesma organela e analisar sua proximidade com a membrana da organela parceira no MCS. Esse protocolo foi desenvolvido com base em duas premissas: 1) estudos prévios mostrando que, em condições de superexpressão, as proteínas de transferência lipídica ORP5 e ORP8 co-localizam e interagem em ER-mitocôndrias e ER-PM MCSs 12,13,14,15 e que ORP5 localiza-se em contatos ER-LD ^16,17; 2) tecnologias existentes, incluindo PLA, microscopia confocal, marcação de organelas e análise de imagens 3D.

1. Coloração mitocondrial e ensaio de ligadura de proximidade (PLA)

1. Placa 0,5 x 10 5-2 x 10 5 células HeLa, mantidas em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com¹⁰% de SFB, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de aminoácidos não essenciais a 37 °C com 5% de CO₂, em lamínulas de vidro de 13 mm em placas de^1,5 em 24 poços em uma diluição que permite 75%-90% de confluência celular no dia do procedimento.
   NOTA: É importante ressaltar que as células HeLa podem ser submetidas a tratamentos adicionais, como tratamento com siRNA e/ou transfecção de DNA plasmidial, antes da coloração mitocondrial e PLA.
2. Coloração mitocondrial
   1. Lavar as células uma vez em meio sem soro pré-aquecido a 37 °C. Incubar as células com meio pré-aquecido sem soro por 10 min a 37 °C com 5% de CO₂.
   2. Preparar 1 μM de marcador mitocondrial vermelho em meio pré-aquecido sem soro.
   3. Incubar as células com 500 μL de solução marcadora mitocondrial durante 30 min a 37 °C com CO₂ a 5%. Durante o tratamento com marcadores mitocondriais e as etapas seguintes do protocolo, mantenha as células em lamínulas protegidas da luz o máximo possível.
   4. Após a incubação, lavar as células 1x em meio pré-aquecido sem soro e 2x em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Execute esta etapa o mais rápido possível, pois longos passos de lavagem antes da fixação podem afetar a morfologia mitocondrial.
   5. Retire o 1x PBS das lamínulas e fixe as células incubando-as em PFA 4% recém-preparado (em 1x PBS) por 30 min à temperatura ambiente (no escuro) sob o capô químico. Lave 3x por 2 min em 500 μL de 1x PBS (usando pipetas descartáveis ou um sistema de vácuo conectado a uma bomba).
   6. Remova o PBS 1x e incube as lamínulas com 500 μL de 50mM NH₄Cl por 15 min à temperatura ambiente (no escuro). Lave 1x por 2 min em 500 μL de 1x PSB usando um sistema de vácuo.
   7. Lavar 3x por 2 min em 500 μL do tampão de bloqueio 1 (BB1, 1% BSA, 0,1% saponina em 1x PBS) para o PLA ORP5-ORP8 ou tampão de bloqueio 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% de soro normal de cabra, 0,1 saponina em 1x PBS) para o ORP8-PTPIP51 PLA.
   8. Transfira as lamínulas da placa de 24 poços para uma câmara de umidade. Após transferir as lamínulas para a câmara, adicionar 100 μL de BB (BB1 ou BB2, de acordo com os pares de anticorpos utilizados) para evitar o ressecamento.
      NOTA: Uma câmara de umidade protegida da luz pode ser fácil e rapidamente obtida envolvendo uma placa de Petri (plástico ou vidro) em papel alumínio e adicionando alguns pedaços de papel toalha molhado na periferia da placa de Petri.
3. Ensaio de ligadura de proximidade (PLA)
   NOTA: O protocolo PLA segue as instruções do fabricante com pequenas modificações.
   1. Incubação primária de anticorpos
      1. Prepare a solução primária de trabalho de anticorpos. Diluir coelho anti-ORP5 (1:150) mais camundongo anti-ORP8 (1:200) em BB1, camundongo anti-ORP8 (1:200) mais coelho anti-PTPIP51 (1:200) em BB2, e coelho anti-ORP5 (1:150) mais camundongo anti-PTPIP51 (1:200) em BB1. Preparar (pelo menos) 40 μL de solução de anticorpos primários por lamínula (por exemplo, 0,27 μL de coelho anti-ORP5, 0,2 μL de camundongo anti-ORP8, 39,53 μL de BB1).
      2. Retirar o BB da lavagem anterior (passo 1.2.8) utilizando um sistema de vácuo e adicionar 40 μL de solução de anticorpos primários às lamínulas. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara de humidade protegida da luz.
   2. Lave as lamínulas 3x por 5 min com 100 μL do BB correspondente usando o sistema de vácuo.
   3. Incubação da sonda PLA
      1. Prepare a solução de trabalho das sondas PLA. Diluir as sondas PLA de coelho PLUS (1:5) e MINUS (1:5) em BB e misturar. Para cada lamínula, prepare (pelo menos) 40 μL de solução de sonda PLA (por exemplo, 8 μL de sonda PLUS PLA de coelho, 8 μL de sonda MENOS PLA de ratinho, 24 μL de BB). Deixe a solução da sonda PLA descansar por 20 minutos à temperatura ambiente antes do uso.
      2. Retire o BB das lamínulas (do passo 1.3.2) utilizando um sistema de vácuo e adicione 40 μL de solução de sonda PLA às lamínulas. Incubar durante 1 h a 37°C numa câmara de humidade protegida da luz.
   4. Lave as lamínulas 2x durante 5 minutos em 100 μL de 1x tampão de lavagem A à temperatura ambiente.
   5. Ligadura
      1. Diluir o tampão de ligadura de 5x a 1:5 em água ultrapura e misturar. Para cada lamínula, preparar (pelo menos) 40 μL de solução de ligadura (8 μL de tampão de ligadura 5x, 31 μL de água ultrapura).
      2. Adicionar a ligase (1 U/μL, fornecida no kit PLA) a 1x tampão de ligadura preparado na etapa anterior na diluição de 1:40 e misturar.
      3. Retirar 1x tampão de lavagem A das lamínulas (do passo 1.3.4) utilizando um sistema de vácuo, adicionar 40 μL de solução de ligase às lamínulas e incubar durante 30 minutos a 37 °C numa câmara de humidade protegida da luz.
   6. Lave as lamínulas 2x por 2 min em 100 μL de 1x tampão de lavagem A à temperatura ambiente usando o sistema de vácuo.
   7. Polimerização
      1. Diluir o tampão de amplificação 1:5 de 5x em água ultrapura e misturar. Para cada lamínula, preparar (pelo menos) 40 μL de solução de amplificação (8 μL de tampão de amplificação 5x, 31,5 μL de água ultrapura).
      2. Adicione a polimerase (10 U/μL, fornecida no kit PLA) ao tampão de polimerização 1x preparado na etapa anterior na diluição de 1:80 e misture.
      3. Retirar 1x tampão de lavagem A das lamínulas (do passo 1.3.6) utilizando um sistema de vácuo, adicionar 40 μL de solução de polimerase às lamínulas e incubar durante 1 h 40 min a 37 °C numa câmara de humidade protegida da luz.
   8. Remova a solução de polimerase das lamínulas e lave 2x por 10 min em 100 μL de 1x tampão de lavagem B à temperatura ambiente em uma câmara de umidade protegida da luz.
   9. Lave as lamínulas 1x por 1 min em 100 μL de 0,001x tampão de lavagem B à temperatura ambiente em uma câmara de umidade protegida da luz.
   10. Monte as lamínulas em lâminas de vidro para microscopia usando meio de montagem com DAPI (concentração entre 1,6-0,4 μg/mL). Selo com esmalte.

2. Aquisição de imagens

1. Observe os resultados do PLA e adquira imagens usando microscopia confocal de fluorescência com objetiva de imersão em óleo de 63x usando o software que o acompanha.
2. Ajuste a excitação de fluorescência usando um diodo laser de 405 nm ou um laser de luz branca e colete as janelas espectrais com PMTs GaAsP ou detectores híbridos. Em cada plano focal (abrangendo 300 nm), adquira os sinais de fluorescência para PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) e mitocôndrias (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).

3. Processamento de imagens e avaliação de manchas de PLA associadas a mitocôndrias

1. Processar as imagens confocais utilizando um software para análise de imagens que gera mapas de distância entre os componentes celulares. Siga os passos abaixo para gerar reconstituições 3D de pontos de PLA e da rede mitocondrial e acessar a distância entre eles usando um software de imagem celular (Figura 1).
2. Instalação da extensão do mapa de distância 3D
   1. Instale o pacote de software de análise de células com a opção XT e o software MATLAB ou apenas um tempo de execução do compilador MATLAB (MRC), que pode ser baixado gratuitamente do site.
   2. Configure o software de análise de células para iniciar o MATLAB quando um XTension for iniciado da seguinte maneira: na opção Imaris (Mac OS X) ou no menu Editar (Windows), selecione Preferências, mude para o painel Ferramentas personalizadas e defina o caminho:
      C:\Arquivos de Programas\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe para Windows ou/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab para Mac OS X.
3. Importar as imagens para o software
   1. Converter as imagens de pilha confocal em um arquivo . IMS, diretamente através da seção Arena ou usando o conversor de arquivos autônomo que permite a conversão em lote.
   2. Após a importação, verifique se as imagens permanecem devidamente calibradas. Clique em Editar > Propriedades da Imagem > Geometria da Imagem e verifique se o tamanho do voxel corresponde em X e Y ao tamanho do pixel esperado para a imagem real (veja calibração da imagem no software de aquisição) e se o tamanho do voxel em Z corresponde ao passo aplicado pelo microscópio para gerar a pilha Z. Se os valores não estiverem corretos, modifique-os para garantir uma estimativa correta das distâncias nas etapas a seguir.
   3. Ajuste o contraste dos diferentes canais no menu Ajuste de exibição clicando em Editar > Mostrar ajuste de exibição. Ajuste cada canal independentemente para otimizar a exibição de cada cor. Esta etapa não afeta diretamente os valores da imagem, mas é essencial para definir limites precisos ou detectar objetos fracos.
   4. Limite a análise a uma única célula cortando a imagem usando as opções Editar > Cortar 3D. Para analisar outra célula no mesmo campo de visão, abra a mesma imagem mais uma vez e corte-a de forma diferente.
4. Detecção de pontos ORP5-ORP8
   1. Detecte os sinais PLA gerados no local da interação ORP5 e ORP8 clicando na opção Adicionar novos pontos, que cria um novo conjunto de objetos e abre o assistente de detecção de pontos.
   2. Selecione o canal no qual a detecção de ponto deve ser executada.
   3. Ajuste o Diâmetro XY Estimado (o intervalo deve ser adaptado se o tamanho do objeto for diferente) para ajudar o algoritmo de detecção de ponto a encontrar os objetos de interesse. Observe que, se o valor escolhido for muito alto, os objetos próximos se fundirão. Se o valor for muito pequeno, um sinal pode ser considerado como vários objetos, ou sinais aberrantes podem ser detectados.
   4. Clique em Subtração de plano de fundo para remover o plano de fundo da imagem antes da detecção de pontos para melhorar o contraste local ao redor dos objetos de interesse.
   5. Ajuste o limite de detecção de ponto mantendo a qualidade (intensidade no centro do objeto) como o parâmetro de limite e o limite automático do software, ou modifique ligeiramente esse valor para detectar todos os objetos. Quando a detecção de ponto estiver concluída, salve os parâmetros de detecção e reutilize-os para processar outras imagens.
5. Detecção de redes mitocondriais
   1. Detecte a rede mitocondrial para gerar uma renderização de superfície clicando em Adicionar novas superfícies para criar um novo objeto e abra o assistente de detecção de superfície.
   2. Selecione o canal no qual a criação da superfície deve ser executada.
   3. Aplique um filtro gaussiano para obter uma superfície mais lisa clicando na caixa de seleção Liso e definindo um limite indicando os menores detalhes observáveis na superfície.
   4. Execute uma subtração em segundo plano para melhorar os contrastes locais e ajudar na etapa de limite.
   5. Ajuste o limiar para detectar a rede mitocondrial com base na intensidade do sinal. Se for difícil definir corretamente o limite, recomenda-se voltar à etapa anterior para ajustar o grau de suavidade e subtração de fundo.
   6. Se necessário, aplique um filtro na superfície para remover pequenos resíduos resultantes do limiar. Para fazer isso, selecione o filtro Número de Voxels na janela classificar superfície e jogue com os limites superior e inferior para manter apenas os objetos de interesse. Quando a criação da superfície terminar, salve os parâmetros de criação e reutilize-os para processar outras imagens.
6. Geração do mapa de distância 3D em torno das mitocôndrias
   1. Gere um mapa de distância fora da superfície mitocondrial previamente criado da seguinte forma. Selecione a superfície das mitocôndrias na caixa da árvore de cena. Clique em Processamento de imagem > função de superfícies > transformação de distância. Isso chamará um Matlab XTension que pede ao usuário para escolher se o mapa deve ser computado fora ou dentro da superfície do objeto.
   2. Selecione Objeto de superfície externa para medir a distância entre os pontos de PLA e a superfície da mitocôndria. Uma vez gerado, o mapa de distância aparece como um novo canal no painel de ajuste de exibição. Neste canal, cada pixel tem um valor correspondente à distância à mitocôndria mais próxima.
7. Extração das distâncias dos objetos da mitocôndria mais próxima
   1. Para medir a distância de cada ponto até as mitocôndrias mais próximas e identificar e visualizar as mais próximas, selecione os pontos gerados anteriormente na caixa da árvore de cena.
   2. Nas estatísticas e no log detalhado, selecione Valores Específicos (para obter uma medida para cada ponto). Selecione Center Intensity Ch=X (com X correspondente ao número do canal do mapa de distância). Isso medirá o valor de cada centro do ponto, que corresponde à sua distância até a mitocôndria mais próxima, no mapa de distância.
   3. Exporte os dados como um arquivo .csv clicando no ícone Disquete no canto inferior esquerdo da janela.
   4. Para extrair uma subpopulação de manchas com base em suas distâncias para as mitocôndrias, selecione os pontos na árvore de cenas e clique na guia Filtros .
   5. Nesta janela, adicione um novo filtro baseado mais uma vez no Centro de Intensidade Ch=X e extraia os pontos a menos de 380 nm de distância das mitocôndrias, definindo o limiar inferior para 0 μm e o limite superior para 0,380 μm.
      NOTA: O limiar de 380 nm foi estimado com base em uma reação de PLA incluindo a associação entre os anticorpos primários e secundários (30 nm) mais metade da largura total na metade máxima (FWHM) dos sinais de amplificação de PLA (350 nm).
   6. Para se concentrar nos pontos selecionados e, por exemplo, dar-lhes uma cor distinta, execute uma etapa de duplicação pressionando o botão Duplicar seleção para novos pontos .

Usando o protocolo descrito acima, detectamos os locais de interação de duas proteínas de transferência lipídica ancoradas em RE, ORP5 e ORP8, e avaliamos sua ocorrência em subdomínios da membrana de RE em contato com outras organelas, em particular, com as mitocôndrias. Para tanto, a rede mitocondrial em células HeLa foi corada com marcador mitocondrial vermelho, e manchas verdes de PLA ORP5-ORP8 foram detectadas após fixação com os anticorpos primários anti-ORP5 e anti-ORP8, cuja especificidade foi previamente testada por^{imunofluorescência15}. Imagens confocais mostraram que as interações endógenas ORP5-ORP8 PLA nas células HeLa ocorreram no RE reticular, RE cortical e nos subdomínios RE em contato próximo com mitocôndrias, comumente referidos como membranas de RE associadas à mitocôndria (MAMs; Figura 2A). A fim de quantificar as interações ORP5-ORP8 PLA que ocorrem em MAMs, a distância de cada ponto de PLA da mitocôndria foi avaliada usando análise de imagem 3D. Usando um limiar de distância de 380 nm, a análise de imagens 3D revelou que cerca de 50% das interações endógenas ORP5-ORP8 PLA foram detectadas em MAMs (Figura 2A,B). Os outros 50% das interações foram distribuídos entre a RE cortical e reticular¹⁵. Para validar a especificidade do PLA, experimentos de PLA ORP5-ORP8 foram realizados em células tratadas com siRNAs direcionados a ORP5 e ORP8 (controle negativo) ou em células co-superexpressando ORP5 e ORP8 (controle positivo). A downregulation de ORP5 e ORP8 induziu uma diminuição maciça no número total de sinais de PLA (em MAMs, no RE reticular e no RE cortical; Figura 2A,C), enquanto sua co-superexpressão resultou em aumento do PLA (Figura 2A,C), confirmando a especificidade do PLA ORP5-ORP8. No entanto, curiosamente, a porcentagem de interações ORP5-ORP8 PLA que ocorrem em MAMs em células co-superexpressando ORP5 e ORP8 foi semelhante àquela observada em células onde essas proteínas foram expressas em níveis endógenos (Figura 2B), apoiando sua existência como um complexo em MAMs. Para confirmar ainda mais a presença de ORP5 e ORP8 em subdomínios da membrana de RE em contato próximo com mitocôndrias, análises quantitativas adicionais de PLA entre ORP5 ou ORP8 e a proteína externa da membrana mitocondrial PTPIP51, um parceiro de ligação conhecido de ORP5 e ORP8¹³, foram realizadas. Sinais de PLA foram detectados em ambos os pares ORP5-PTPIP51 e ORP8-PTPIP51, e seus números médios foram semelhantes ao par ORP5-ORP8 PLA, confirmando a localização de ORP5 e ORP8 nos MCSs ER-mitocôndrias (Figura 3).

Finalmente, em trabalhos recentes de nosso laboratório, usando uma abordagem semelhante em células HeLa transfectadas com PHPLCd-RFP ou mcherry-PLN1 para marcar o PM ou LD, respectivamente, pudemos analisar a ocorrência de interações ORP5-ORP8 PLA em contatos ER-PM e identificar um sítio de contato de três vias entre mitocôndrias, RE e LDs (Figura 4)^{15, 17º}.

Figura 1: Fluxo de trabalho para a identificação de sinais de PLA em estreita proximidade com as mitocôndrias. Primeiro, as pilhas confocais são segmentadas para identificar os focos de PLA (manchas) e a rede mitocondrial (superfícies). Em seguida, mapas de distância 3D são computados em direção ao exterior das superfícies (mitocôndrias), permitindo a medição da distância de cada ponto da mitocôndria mais próxima. Finalmente, as manchas PLA são classificadas em duas populações (vermelha e verde) com base em um limiar de proximidade de 380 nm estabelecido com base na precisão do sistema de detecção. Esse valor foi modificado de Monteiro-Cardoso et ^al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas do complexo ORP5-ORP8 expressas em níveis endógenos localizados em contatos ER-mitocôndrias. (A) Série confocal ORP5-ORP8 PLA e respectivas reconstituições 3D. Barras de escala: 10 μm e 2 μm (imagens expandidas). (B) Quantificação de focos de PLA ORP5-ORP8 em íntimo contato com mitocôndrias. Endo, n = 33 células, e Overexp ORP5+ORP8, n = 27 células. Os dados são apresentados como média ± EPM (erro padrão da média). Essa imagem foi modificada de Monteiro-Cardoso et ^al.15. (C) Quantificação dos focos totais de PLA ORP5-ORP8. Endo, n = 38 células, siORP5+siORP8, n = 38 células, e Overexp ORP5+ORP8, n = 35 células. Os dados são apresentados como média ± EPM (erro padrão da média). Essa imagem foi modificada de Monteiro-Cardoso et ^al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens representativas dos sinais de PLA entre ORP5 ou ORP8 com a proteína mitocondrial PTPIP51. (A) Séries confocais foram usadas para gerar reconstituições 3D e mapas de distância para confirmar que as interações de PLA ORPR5 ou ORP8 com PTPIP51 ocorrem em contatos próximos de ER-mitocôndrias. Barras de escala: 10 μm e 2 μm (imagens expandidas). (B) PTPIP51 imagens confocais de imunofluorescência (plano focal único) em células controle e HeLa tratadas com siRNA visando PTPIP51. Barras de escala: 10 μm e 2 μm (imagens expandidas). (C) Imagens confocais de PLA ORP5-PTPIP51 e ORP8-PTPIP51 em células controle e HeLa tratadas com siRNA visando PTPIP51. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplos de reconstruções 3D usadas para localizar o complexo PLA ORP5-ORP8 nos contatos ER-PM e ER-mitocôndria-LD. (A) Imagem confocal e respectiva reconstituição 3D de uma célula HeLa com PLA ORP5-ORP8, representada pelas manchas verdes, o MP marcado com PHPLCd-RFP, representado pela hemácia, e as mitocôndrias marcadas com Mito-BFP, representadas pelas superfícies azuis. Imagens à esquerda e ao centro: representação de toda a célula HeLa. Imagem à direita: representação de uma região ampliada dentro da célula. (B) Imagem confocal e respectiva reconstituição 3D de uma região ampliada de uma célula HeLa com PLA ORP5-ORP8, representada pelas manchas verdes, LDs marcadas com mCherry-PLN1, representada pelas superfícies vermelhas, e Mito-BFP, representada pelas superfícies azuis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo foi projetado para identificar e quantificar interações inter-organelas de proteínas PLA em MCSs, em particular em MERCSs. A novidade do protocolo é que ele combina PLA com a marcação de múltiplas organelas, microscopia confocal e análise de imagens 3D para localizar e quantificar interações de PLA entre duas proteínas residentes na mesma membrana, neste caso dentro da membrana de RE em estreita proximidade com a membrana da mitocôndria (MAM) ou com o MAM e LDs simultaneamente. Este protocolo pode ser usado como uma ferramenta para validar proteínas que potencialmente se localizam em MERCSs específicos, mas também em outros MCSs.

Desde o seu desenvolvimento em 2006, o PLA entre um RE e uma proteína mitocondrial tem sido amplamente utilizado para quantificar MERCSs 7,9,10,11. No entanto, o uso de PLA como um indicador da abundância de MERCS em células precisa ser cuidadosamente verificado por abordagens de alta resolução. Por exemplo, a ablação de SAM50, uma proteína mitocondrial que não afeta a abundância de MERCSs (quantificada por microscopia eletrônica)15, também não altera as interações de PLA entre a proteína ER ORP8 e a proteína mitocondrial TOM20, mas reduz as interações de PLA entre ORP8 e a proteína mitocondrial Metaxin2 sem reduzir seus níveis de expressão ¹⁵. Estes resultados refletem que as interações de PLA podem ser específicas para o par de proteínas usadas no ensaio e não podem ser usadas como o único parâmetro para avaliar a abundância de MERCS.

No entanto, o PLA é uma abordagem comprovadamente sensível para detectar interações proteicas endógenas in situ . Ao contrário de outros métodos de detecção baseados em sonda fluorescente, incluindo split-GFP e FRET, ou abordagens de imagem de alta resolução, o PLA não requer a superexpressão de proteínas marcadas, evitando artefatos experimentais inerentes, como a alteração das propriedades físicas das organelas alvo¹⁵. A detecção de interações proteicas por PLA também oferece vantagens em relação a outros métodos de imunodetecção, como a co-imunoprecipitação com western blot. Enquanto o PLA permite a quantificação de pontos de fluorescência simples em nível unicelular, a co-imunoprecipitação requer uma alta quantidade de material biológico e permite apenas a quantificação relativa da proteína extraída de um pool de células heterogêneas, para as quais um controle de carga adequado é difícil de obter¹⁵. A vantagem adicional do uso de PLA combinado com coloração de organela e microscopia confocal sobre a co-imunoprecipitação é que a primeira abordagem permite a localização de interações proteicas em nível subcelular.

Por outro lado, as desvantagens proeminentes deste protocolo estão associadas à faixa de detecção de PLA de cerca de 40 nm, que é maior que os MERCSs, e à resolução máxima alcançada pela microscopia confocal de cerca de 250 nm, o que dificulta a identificação inequívoca dos locais de contato. No entanto, aqui, um limiar de 380 nm foi usado para estimar os pontos de PLA associados à superfície mitocondrial com base no tamanho da reação de PLA, incluindo a associação dos anticorpos primário e secundário (30 nm) mais metade da FWHM dos sinais de amplificação de PLA (350 nm). Outra limitação do PLA está relacionada ao fato de que ele só pode ser usado em amostras fixas, e a aquisição de um sinal de PLA distinto, específico e quantificável requer a disponibilidade de anticorpos altamente específicos para a proteína de interesse¹⁵. Além disso, a análise de imagens 3D para estimativa de distância requer softwares específicos que podem não estar prontamente disponíveis em todos os laboratórios.

Notavelmente, algumas das desvantagens mencionadas acima podem ser abordadas com o uso de tecnologias recentemente disponíveis. Por exemplo, a microscopia confocal convencional pode ser substituída por técnicas de imagem em nível de maior resolução, como Airyscan ou microscopia iluminada estruturada (SIM)¹⁷, e a falta de bons anticorpos primários para as proteínas de interesse pode ser superada com a marcação estável de proteínas endógenas usando a tecnologia CRISPR-Cas918. Finalmente, a qualidade e a especificidade dos anticorpos e dos sinais de PLA podem ser verificadas usando os seguintes controles: 1) testar os anticorpos primários por imunofluorescência e western blot em células controle e em células nas quais a proteína de interesse foi esgotada ou superexpressa; 2) realização de PLA em células nas quais uma ou ambas as proteínas de interesse tenham sido esgotadas; 3) realização de PLA em células co-superexpressando as proteínas de interesse; 4) realizar PLA omitindo ambos os anticorpos para as proteínas de interesse; 5) realização de PLA utilizando apenas um dos dois anticorpos para as proteínas de interesse; 6) realização de PLA com incubação com a mesma IgG da espécie a partir da qual os anticorpos primários foram gerados. Para avaliar sua especificidade, os anticorpos utilizados nesse protocolo foram testados por imunofluorescência e western blot em células controle e em células tratadas com siRNA direcionado para ORP5 15, ORP8¹⁵ ou PTPIP51 (Figura 3B e Guyard et al.17). Além disso, a especificidade anti-ORP5 e anti-ORP8 foi avaliada em células que expressam ORP5 ou ORP8 marcadas com EGFP por meio da avaliação do coeficiente de Pearson entre o sinal de detecção de anticorpos e o sinal EGFP¹⁵. As especificidades dos anticorpos anti-ORP5¹⁵, anti-ORP8¹⁵ e anti-PTPIP51 (Figura 1 e Figura 3C) foram posteriormente analisadas nas células em que essas proteínas estavam depletadas, levando a uma diminuição dos sinais de PLA. De notar, a concentração de anticorpos que é adequada para coloração de imunofluorescência geralmente também é adequada para PLA; no entanto, dependendo dos anticorpos utilizados, alguns ajustes na solução de bloqueio e/ou nas concentrações de anticorpos podem ser feitos para melhorar a coloração de PLA. A coloração ORP5-ORP8 e ORP8-PTPIP51 PLA foi melhorada após ajuste da solução de bloqueio. Para obter coloração mitocondrial e PLA de alta qualidade, é essencial obter imagens confocais de alta qualidade com baixos sinais de fundo, que são importantes para facilitar a modulação 3D. Por exemplo, imagens confocais com ajustes de alto limiar de impacto de fundo e, consequentemente, afetam a precisão da modulação 3D da rede mitocondrial ou PLA.

Em conclusão, o protocolo aqui apresentado permite a localização e quantificação de interações de proteínas PLA em subdomínios específicos de MERCS (interações entre proteínas localizadas em cis dentro da mesma membrana engajadas em MCSs ou entre proteínas localizadas em trans dentro das membranas justapostas) usando marcação multicelular de organelas e gerando mapas de distância em imagens confocais reconstruídas em 3D. Embora os procedimentos aqui descritos sejam tecnicamente simples e relativamente rápidos em comparação com outras metodologias para detectar interações proteicas em MERCSs, os dados obtidos são altamente reprodutíveis. Além disso, esse protocolo é tão versátil quanto os anticorpos disponíveis para as proteínas de interesse e como os marcadores disponíveis para coloração das organelas. Portanto, pode ser aplicado a uma ampla gama de pares de proteínas e diversas organelas e MCSs.

Os autores não têm nada a revelar.

Este trabalho foi apoiado pela ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), pelo Programa ATIP-Avenir, pela Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548), e pela Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Fitotecnia).