JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

Abstract

אתרי מגע עם ממברנות (MCSs) הם אזורים של קרבה קרובה לממברנה המאפשרים ומווסתים את החילוף הדינמי של ביומולקולות מגוונות (כלומר, סידן ושומנים) בין האברונים הסמוכים זה לזה מבלי לערב איחוי ממברנה. MCSs חיוניים להומאוסטזיס תאי, ותפקודם מובטח על ידי המרכיבים המקומיים, אשר קיימים לעתים קרובות כקומפלקסים חלבונים מולטימריים. MCS מערבת לעתים קרובות את הרשתית האנדופלסמית (ER), אתר עיקרי של סינתזת שומנים ואחסון סידן תאי, והם חשובים במיוחד עבור אברונים, כגון המיטוכונדריה, אשר אינם נכללים במסלולי ההובלה השלפוחית הקלאסיים. בשנים האחרונות, MCS בין חדר המיון למיטוכונדריה נחקרו בהרחבה, שכן תפקודיהם משפיעים מאוד על חילוף החומרים בתאים/ביו-אנרגטיקה. מספר חלבונים החלו להיות מזוהים באתרי מגע אלה, כולל קשירת ממברנה, תעלות סידן וחלבונים להעברת שומנים, מה שמעלה את הצורך במתודולוגיות חדשות ובגישות טכניות לחקר רכיבי MCS אלה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המורכב מגישות טכניות משולבות, הכוללות בדיקת קשירת קרבה (PLA), צביעת מיטוכונדריה וסגמנטציה של הדמיה תלת-ממדית, המאפשרת זיהוי חלבונים הקרובים פיזית (>40 ננומטר) זה לזה ושוכנים על אותו קרום ב-MCS של ER-מיטוכונדריה. לדוגמה, השתמשנו בשני חלבוני העברת שומנים מעוגני ER, ORP5 ו-ORP8, שהוכחו בעבר כמתקשרים ומתמקמים ב-MCS של קרום המיטוכונדריה והפלזמה של ER. על ידי שיוך ORP5-ORP8 PLA עם ניתוח תוכנה להדמיית תאים, ניתן היה להעריך את המרחק של קומפלקס ORP5-ORP8 מפני השטח המיטוכונדריאליים ולקבוע כי כ-50% מהאינטראקציה של ORP5-ORP8 PLA מתרחשת בתת-תחומים של ER בסמיכות למיטוכונדריה.

Introduction

תקשורת בין אברונים היא מאפיין מגדיר של תאים אאוקריוטים. אחת הדרכים שבהן אברונים מתקשרים היא על ידי יצירת אתרי מגע עם ממברנות (MCS), שהם ניגודי קרום קרובים בין שני אברונים הנשמרים על ידי חלבונים מבניים ופונקציונליים, כגון קשירה, חלבוני העברת שומנים ותעלות סידן1. MCS יכולים להיווצר בין אברונים דומים או שונים, והם מתווכים את חילופי המרכיבים התאיים, אשר חשוב לשמירה על הומאוסטזיס תאי. עד כה זוהו מספר MCS, כולל רטיקולום אנדופלסמי (ER)-מיטוכונדריה, קרום פלזמה ER (PM) ומגעי טיפות ליפידים ER (LD)1. ביניהם, אלה שנוצרו בין ER לבין המיטוכונדריה (MERCSs) הם בין הנחקרים ביותר כפי שהם מעורבים ברגולציה של כמה פונקציות התאים, כולל שומנים וסידן הומאוסטזיס2. מכיוון שהמיטוכונדריה אינם נכללים במידה רבה במסלולי ההובלה השלפוחיתיים הקלאסיים, הם מסתמכים על MERCS ועל המרכיבים המולקולריים שלהם כדי לייבא שומנים מרכזיים או מבשרי שומנים מהמיון. ההובלה הלא-שלפוחית של שומנים אלה על פני MERCSs מבטיחה שמירה על הרכב שומנים מיטוכונדריאלי תקין, כמו גם שלמותם התפקודית והמבנית3.

בהתחשב במעורבות המכרעת של MCS בתפקודים תאיים שונים, העניין במתן הבנה עמוקה יותר של המרכיבים המולקולריים שלהם גדל מאוד בשנים האחרונות. מספר סוגים של גישות מבוססות הדמיה שימשו לקידום הידע על MCSs. ביניהם, בדיקת קשירת קרבה מבוססת פלואורסצנטיות (PLA) נמצאת בשימוש נרחב כאינדיקטור לשפע של MCS על ידי זיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון בין אברונים (בטווח זיהוי של 40 ננומטר) ברמות אנדוגניות4. לדוגמה, MERCSs הודגמו וכומתו באמצעות PLA בין מספר זוגות חלבוני מיטוכונדריה-ER, כולל VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 ו- PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. למרות שטכנולוגיה זו שימשה לזיהוי וכימות אינטראקציות חלבון-חלבון בין אברונים הנמצאים ב- MCS 5,7,9,10,11, רוב המחקרים לא שילבו PLA עם צביעת אברונים. כתוצאה מכך, שיטה כמותית המאפשרת למדוד את הקרבה בין אינטראקציות PLA לבין אברונים קשורים עדיין לא פותחה. עד כה, במקרה של חלבוני ER, האינטראקציה שלהם בתוך תת-תחומים של ממברנות במגע עם אברונים אחרים לא הובדלה מהאינטראקציה שלהם בתוך רשת המיון המפוזרת.

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות PLA בין חלבונים השוכנים בקרום של אותו אברון ולניתוח קרבתם לממברנה של אברון השותף ב-MCS. פרוטוקול זה פותח בהתבסס על שתי הנחות: 1) מחקרים קודמים שהראו כי בתנאי ביטוי יתר, חלבוני העברת השומנים ER ORP5 ו- ORP8 מבצעים לוקליזציה משותפת ומקיימים אינטראקציה ב- ER-מיטוכונדריה וב- ER-PM MCSs 12,13,14,15 וכי ORP5 מתמקם במגעי ER-LD 16,17; 2) טכנולוגיות קיימות, כולל PLA, מיקרוסקופ קונפוקלי, תיוג אברונים וניתוח הדמיה תלת-ממדית.

Protocol

1. צביעה מיטוכונדריאלית ובדיקת קשירת קרבה (PLA)

  1. צלחת 0.5 x 10 5-2 x 10 5 תאי HeLa, מתוחזקים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות ב-37°C עם 5% CO2, בזכוכית 13 מ"מ מכסה את החלקות בלוחות1.5 ב-24 בארות בדילול המאפשר מפגש תאים של 75%-90% ביום ההליך.
    הערה: יש לציין כי ניתן לשלוח תאי HeLa לטיפולים נוספים, כגון טיפול siRNA ו / או טרנספקציה פלסמיד DNA, לפני צביעה מיטוכונדריאלית ו- PLA.
  2. צביעת מיטוכונדריה
    1. יש לשטוף את התאים פעם אחת בתווך ללא סרום שחומם מראש ב-37°C. יש לדגור על התאים עם מדיום שחומם מראש ללא סרום למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2.
    2. הכינו סמן מיטוכונדריאלי אדום 1 מיקרומטר בתווך שחומם מראש ללא סרום.
    3. לדגור על התאים עם 500 μL של תמיסת סמן מיטוכונדריאלי במשך 30 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2. במהלך הטיפול בסמנים מיטוכונדריאליים ובשלבים הבאים של הפרוטוקול, יש לשמור על התאים על הכיסויים מוגנים מפני אור ככל האפשר.
    4. לאחר הדגירה, יש לשטוף את התאים 1x בתווך ללא סרום שחומם מראש ו-2x במי מלח חוצצים פוספט (PBS). בצעו שלב זה מהר ככל האפשר, שכן שלבי שטיפה ארוכים לפני הקיבוע עלולים להשפיע על המורפולוגיה של המיטוכונדריה.
    5. הסר את 1x PBS מהכיסויים, ותקן את התאים על ידי דגירה עליהם ב- 4% PFA טרי מוכן (ב- 1x PBS) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (בחושך) מתחת למכסה המנוע הכימי. יש לשטוף 3 פעמים למשך 2 דקות ב-500 מיקרוליטר של 1x PBS (באמצעות פיפטים חד פעמיים או מערכת ואקום המחוברת למשאבה).
    6. הסר את 1x PBS, ודגר על הכיסויים עם 500 μL של 50mM NH4Cl למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (בחושך). יש לשטוף 1x במשך 2 דקות ב-500 μL של PSB אחד באמצעות מערכת ואקום.
    7. יש לשטוף 3x למשך 2 דקות ב-500 מיקרוליטר של חיץ חוסם 1 (BB1, 1%BSA, 0.1% סאפונין ב-1x PBS) עבור ORP5-ORP8 PLA או חיץ חוסם 2 (BB2, 2% BSA, 0.1% סרום עיזים רגיל, 0.1 סאפונין ב-1x PBS) עבור ORP8-PTPIP51 PLA.
    8. העבירו את הכיסויים מהצלחת בעלת 24 הבארות לתא לחות. לאחר העברת הכיסויים לתוך התא, להוסיף 100 μL של BB (BB1 או BB2, על פי זוגות נוגדנים בשימוש) כדי למנוע יובש.
      הערה: תא לחות מוגן מפני אור ניתן להשיג בקלות ובמהירות על ידי עטיפת צלחת פטרי (פלסטיק או זכוכית) ברדיד אלומיניום והוספת כמה חתיכות של מגבת נייר רטוב בשולי צלחת פטרי.
  3. בדיקת קשירת קרבה (PLA)
    הערה: פרוטוקול PLA עוקב אחר הוראות היצרן עם שינויים קלים.
    1. דגירה ראשונית של נוגדנים
      1. הכן את פתרון העבודה העיקרי נוגדנים. לדלל ארנב anti-ORP5 (1:150) בתוספת עכבר anti-ORP8 (1:200) ב-BB1, עכבר anti-ORP8 (1:200) בתוספת ארנב anti-PTPIP51 (1:200) ב-BB2, וארנב anti-ORP5 (1:150) בתוספת עכבר anti-PTPIP51 (1:200) ב-BB1. הכינו (לפחות) 40 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל כיסוי (למשל, 0.27 מיקרוליטר של ארנב נגד ORP5, 0.2 מיקרוליטר של עכבר נגד ORP8, 39.53 מיקרוליטר של BB1).
      2. הסר את ה- BB מהשטיפה הקודמת (שלב 1.2.8) באמצעות מערכת ואקום, והוסף 40 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית לכיסויים. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא לחות המוגן מפני אור.
    2. יש לכבס את החלקות 3x למשך 5 דקות עם 100 μL של BB המתאים באמצעות מערכת ואקום.
    3. דגירה של גשושית PLA
      1. הכן את פתרון העבודה של בדיקות PLA. לדלל ארנב PLUS (1:5) ועכבר מינוס (1:5) בדיקות PLA ב- BB, ולערבב. עבור כל כיסוי, הכינו (לפחות) 40 μL של תמיסת בדיקה PLA (למשל, 8 μL של בדיקת ארנב PLUS PLA, 8 μL של בדיקת עכבר MINUS PLA, 24 μL של BB). אפשר לתמיסת הבדיקה PLA לשבת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
      2. הסר את ה- BB מהכיסויים (משלב 1.3.2) באמצעות מערכת ואקום, והוסף 40 μL של תמיסת בדיקת PLA לכיסויים. יש לדגור במשך שעה אחת ב-37°C בתא לחות המוגן מפני האור.
    4. יש לכבס את הכיסויים פעמיים למשך 5 דקות ב-100 מיקרוליטר של חיץ כביסה A אחד בטמפרטורת החדר.
    5. קשירה
      1. מדללים את חיץ הקשירה פי 5 ל-1:5 במים טהורים במיוחד ומערבבים. עבור כל כיסוי, הכינו (לפחות) 40 μL של תמיסת קשירה (8 μL של 5x חיץ קשירה, 31 μL של מים טהורים במיוחד).
      2. מוסיפים את הליגאז (1 U/μL, מסופק בערכת PLA) למאגר קשירה 1x שהוכן בשלב הקודם בדילול של 1:40, ומערבבים.
      3. הסירו את חיץ הכביסה A אחד מהכיסויים (משלב 1.3.4) באמצעות מערכת ואקום, הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת ליגאז לכיסויים, ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C בתא לחות מוגן מפני האור.
    6. יש לכבס את הכיסויים 2 פעמים למשך 2 דקות ב-100 מיקרוליטר של חיץ כביסה A אחד בטמפרטורת החדר באמצעות מערכת הוואקום.
    7. פילמור
      1. יש לדלל את חיץ ההגברה פי 5 ביחס של 1:5 במים טהורים במיוחד, ולערבב. עבור כל כיסוי, הכינו (לפחות) 40 מיקרוליטר של תמיסת הגברה (8 מיקרוליטר של חיץ הגברה פי 5, 31.5 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד).
      2. מוסיפים את הפולימראז (10 U/μL, מסופק בערכת PLA) למאגר פילמור 1x שהוכן בשלב הקודם בדילול של 1:80, ומערבבים.
      3. הסר חיץ כביסה A אחד מהכיסויים (משלב 1.3.6) באמצעות מערכת ואקום, הוסף 40 μL של תמיסת פולימראז לכיסויים, ודגר במשך שעה ו-40 דקות ב-37°C בתא לחות מוגן מפני האור.
    8. יש להסיר את תמיסת הפולימראז מהכיסויים ולשטוף פעמיים במשך 10 דקות ב-100 מיקרוליטר של חיץ כביסה B אחד בטמפרטורת החדר בתא לחות המוגן מפני האור.
    9. יש לכבס את הכיסויים פעם אחת למשך דקה אחת ב-100 מיקרוליטר של חיץ כביסה B של 0.001x בטמפרטורת החדר בתא לחות המוגן מפני האור.
    10. הרכיבו את הכיסויים על מגלשות זכוכית למיקרוסקופ באמצעות אמצעי הרכבה עם DAPI (ריכוז בין 1.6-0.4 מיקרוגרם/מ"ל). יש לאטום בלק.

2. רכישת תמונות

  1. התבונן בתוצאות ה- PLA, וקבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי עם מטרת טבילת שמן 63x באמצעות התוכנה הנלווית.
  2. הגדר את העירור הפלואורסצנטי באמצעות דיודת לייזר 405 ננומטר או לייזר אור לבן, ואסוף את החלונות הספקטרליים באמצעות PMT GaAsP או גלאים היברידיים. בכל מישור מוקד (המשתרע על פני 300 ננומטר), רכשו את האותות הפלואורסצנטיים עבור PLA (λex = 488 ננומטר, λem = 505-560 ננומטר) ומיטוכונדריה (λex = 543 ננומטר, λem = 606-670 ננומטר).

3. עיבוד תמונה והערכה של כתמי PLA הקשורים למיטוכונדריה

  1. עבד את התמונות הקונפוקליות באמצעות תוכנה לניתוח תמונות המייצרת מפות מרחק בין רכיבי התא. עקבו אחר השלבים הבאים כדי ליצור בנייה מחדש תלת-ממדית של כתמי PLA והרשת המיטוכונדריאלית וכדי לגשת למרחק ביניהם באמצעות תוכנת דימות תאי (איור 1).
  2. התקנת הרחבת מפת המרחק התלת-ממדית
    1. התקן הן את חבילת התוכנה לניתוח תאים עם אפשרות XT והן את תוכנת MATLAB או רק זמן ריצה של מהדר MATLAB (MRC), שניתן להוריד באופן חופשי מהאתר.
    2. הגדירו את תוכנת ניתוח התאים להפעלת MATLAB בעת הפעלת XTension באופן הבא: מתוך האפשרות Imaris (Mac OS X) או בתפריט Edit (Windows), בחרו Preferences, שנו לחלונית Custom Tools ולאחר מכן קבעו את הנתיב:
      C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe עבור Windows או/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab עבור Mac OS X.
  3. ייבוא התמונות לתוכנה
    1. המרת תמונות הערימה הקונפוקלית ל- . קובץ IMS, ישירות דרך קטע הזירה או באמצעות ממיר הקבצים העצמאי המאפשר המרת אצווה.
    2. לאחר הייבוא, ודאו שהתמונות עדיין מכוילות כהלכה. לחצו על Edit > Image Properties > Image Geometry, ובדקו שגודל הווקסל מתאים ב-X וב-Y לגודל הפיקסלים הצפוי לתמונה בפועל (ראו כיול תמונה בתוכנת הרכישה) ושגודל הווקסל ב-Z מתאים לשלב שמופעל על ידי המיקרוסקופ ליצירת ערימת Z. אם הערכים אינם נכונים, שנה אותם כדי להבטיח הערכה נכונה של המרחקים בשלבים הבאים.
    3. התאם את הניגודיות של הערוצים השונים בתפריט התאמת תצוגה על ידי לחיצה על ערוך > הצג התאמת תצוגה. התאימו כל ערוץ בנפרד כדי למטב את התצוגה של כל צבע. שלב זה אינו משפיע ישירות על ערכי התמונה, אך הוא חיוני לקביעת ערכי סף מדויקים או לזיהוי עצמים חלשים.
    4. הגבל את הניתוח לתא בודד על-ידי חיתוך התמונה באמצעות האפשרויות Edit > Crop 3D. כדי לנתח תא אחר באותו שדה ראייה, פתח שוב את אותה תמונה וחתוך אותה באופן שונה.
  4. זיהוי נקודתי ORP5-ORP8
    1. זהה את אותות ה- PLA שנוצרו במיקום האינטראקציה של ORP5 ו- ORP8 על ידי לחיצה על האפשרות הוסף נקודות חדשות , אשר יוצרת קבוצה חדשה של אובייקטים ופותחת את אשף זיהוי הנקודות.
    2. בחרו בערוץ שבו יש לבצע את זיהוי הספוט.
    3. התאם את קוטר XY המשוער (יש להתאים את הטווח אם גודל האובייקט שונה) כדי לסייע לאלגוריתם זיהוי הכתמים למצוא את האובייקטים המעניינים. שים לב שאם הערך שנבחר גבוה מדי, האובייקטים הסמוכים יתמזגו. אם הערך קטן מדי, אות אחד עשוי להיחשב כאובייקטים מרובים, או אותות חריגים עשויים להתגלות.
    4. לחץ על חיסור רקע כדי להסיר את רקע התמונה לפני זיהוי הספוט כדי לשפר את הניגודיות המקומית סביב האובייקטים המעניינים.
    5. התאם את סף זיהוי הכתמים על-ידי שמירה על האיכות (העוצמה במרכז האובייקט) כפרמטר הסף והסף האוטומטי של התוכנה, או שנה מעט ערך זה כדי לזהות את כל האובייקטים. לאחר סיום זיהוי הספוט, שמרו את פרמטרי הזיהוי והשתמשו בהם שוב לעיבוד תמונות אחרות.
  5. זיהוי רשת מיטוכונדריאלית
    1. זהה את הרשת המיטוכונדריאלית כדי ליצור עיבוד משטח על ידי לחיצה על הוסף משטחים חדשים כדי ליצור אובייקט חדש, ופתח את אשף זיהוי המשטחים.
    2. בחרו בערוץ שבו יש לבצע את יצירת המשטח.
    3. החילו מסנן גאוס לקבלת משטח חלק יותר בלחיצה על תיבת הסימון 'החלק ' וקביעת סף המציין את הפרטים הקטנים ביותר שניתן לראות על פני השטח.
    4. בצע חיסור רקע כדי לשפר את הניגודיות המקומית ולסייע בשלב הסף.
    5. כוונן את הסף כדי לזהות את הרשת המיטוכונדריאלית בהתבסס על עוצמת האות. אם קשה להגדיר כראוי את הסף, מומלץ לחזור לשלב הקודם כדי להתאים את מידת החלקות וחיסור הרקע.
    6. במידת הצורך, יש למרוח מסנן על המשטח כדי להסיר שאריות קטנות הנובעות מהסף. לשם כך, בחר את המסנן מספר Voxels בחלון סיווג פני השטח, ושחק עם הסף העליון והתחתון כדי לשמור רק את האובייקטים המעניינים. לאחר סיום יצירת המשטח, שמרו את פרמטרי היצירה והשתמשו בהם שוב לעיבוד תמונות אחרות.
  6. יצירת מפת המרחק התלת-ממדית סביב המיטוכונדריה
    1. צור מפת מרחק מחוץ למשטח המיטוכונדריאלי שנוצרה בעבר באופן הבא. בחרו את משטח המיטוכונדריה בתיבת עץ הסצנה. לחץ על עיבוד תמונה > משטחים פונקציה > שינוי מרחק. פעולה זו תקרא Matlab XTension המבקשת מהמשתמש לבחור אם המפה צריכה להיות מחושבת מחוץ או בתוך משטח האובייקט.
    2. בחרו 'עצם חיצוני על פני השטח ' כדי למדוד את המרחק בין כתמי PLA לפני השטח של המיטוכונדריה. לאחר יצירתה, מפת המרחק מוצגת כערוץ חדש בחלונית התאמת התצוגה. בערוץ זה, לכל פיקסל יש ערך המתאים למרחק למיטוכונדריה הקרובה ביותר.
  7. מיצוי מרחקי העצמים מהמיטוכונדריה הקרובה ביותר
    1. כדי למדוד את המרחק מכל נקודה למיטוכונדריה הקרובה ביותר וכדי לזהות ולהציג באופן חזותי את הנקודות הקרובות ביותר, בחרו את הנקודות שנוצרו בעבר בתיבת עץ הסצנה.
    2. ביומן הסטטיסטיקה והמפורט, בחר ערכים ספציפיים (כדי לקבל מדידה אחת לכל נקודה). בחר Center Intensity Ch=X (כאשר X מתאים למספר ערוץ מפת המרחק). פעולה זו תמדוד את הערך של כל מרכז נקודתי, המתאים למרחקו למיטוכונדריה הקרובה ביותר, במפת המרחק.
    3. יצא את הנתונים כקובץ .csv על ידי לחיצה על סמל התקליטון בפינה השמאלית התחתונה של החלון.
    4. כדי לחלץ תת-אוכלוסייה של כתמים בהתבסס על מרחקיהם למיטוכונדריה, בחרו את הכתמים בעץ הסצנה ולחצו על הכרטיסייה מסננים .
    5. בחלון זה, הוסף מסנן חדש המבוסס שוב על עוצמת המרכז Ch=X, וחלץ את הכתמים במרחק של פחות מ- 380 ננומטר מהמיטוכונדריה על-ידי הגדרת הסף התחתון ל- 0 מיקרומטר והסף העליון ל- 0.380 מיקרומטר.
      הערה: הסף של 380 ננומטר הוערך בהתבסס על תגובת PLA כולל הקשר בין הנוגדנים הראשוניים והמשניים (30 ננומטר) בתוספת מחצית הרוחב המלא בחצי מקסימום (FWHM) של אותות ההגברה של PLA (350 ננומטר).
    6. כדי להתמקד בנקודות הנקודות שנבחרו, ולדוגמה, להעניק להן צבע ייחודי, בצעו שלב שכפול בלחיצה על הלחצן 'שכפל בחירה לנקודות חדשות' .

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל, זיהינו את אתרי האינטראקציה של שני חלבוני העברת שומנים מעוגני ER, ORP5 ו- ORP8, והערכנו את התרחשותם בתת-תחומים של קרום ER במגע עם אברונים אחרים, בפרט, עם המיטוכונדריה. לשם כך, הרשת המיטוכונדריאלית בתאי HeLa הוכתמה בסמן מיטוכונדריאלי אדום, וכתמים ירוקים ORP5-ORP8 PLA זוהו לאחר קיבוע באמצעות נוגדנים ראשוניים anti-ORP5 ו- anti-ORP8, שהספציפיות שלהם נבדקה בעבר על ידי immunofluorescence15. תמונות קונפוקליות הראו כי אינטראקציות אנדוגניות של ORP5-ORP8 PLA בתאי HeLa התרחשו בחדר המיון הרשתית, בחדר המיון בקליפת המוח, ובתת-תחומים של ER במגע הדוק עם מיטוכונדריה, המכונים בדרך כלל ממברנות ER הקשורות למיטוכונדריה (MAMs; איור 2A). על מנת לכמת את אינטראקציות ORP5-ORP8 PLA המתרחשות ב- MAMs, המרחק של כל נקודת PLA מהמיטוכונדריה הוערך באמצעות ניתוח תמונה תלת-ממדי. באמצעות סף מרחק של 380 ננומטר, ניתוח הדמיה תלת-ממדית גילה שכ-50% מהאינטראקציות האנדוגניות של ORP5-ORP8 PLA זוהו ב-MAMs (איור 2A,B). 50% הנותרים של אינטראקציות חולקו בין קליפת המוח לבין הרשתית ER15. כדי לאמת את הספציפיות של ה-PLA, ניסויי ORP5-ORP8 PLA בוצעו בתאים שטופלו ב-siRNA ממוקד ORP5 וב-ORP8 (בקרה שלילית) או בתאים עם ביטוי יתר משותף של ORP5 ו-ORP8 (בקרה חיובית). הפחתת הרגולציה של ORP5 ו-ORP8 גרמה לירידה מסיבית במספר הכולל של אותות PLA (ב-MAMs, בחדר המיון הרשתית ובמיון קליפת המוח; איור 2A,C), בעוד שביטוי היתר שלהם הביא לעלייה ב-PLA (איור 2A,C), מה שמאשר את הספציפיות של ORP5-ORP8 PLA. אולם באופן מעניין, אחוז אינטראקציות ORP5-ORP8 PLA שהתרחשו ב-MAMs בתאים עם ביטוי יתר משותף של ORP5 ו-ORP8 היה דומה לזה שנצפה בתאים שבהם החלבונים האלה באו לידי ביטוי ברמות אנדוגניות (איור 2B), מה שתומך בקיומם כקומפלקס ב-MAMs. כדי לאשר עוד יותר את נוכחותם של ORP5 ו-ORP8 בתת-תחומים של קרום ER הנמצאים במגע הדוק עם מיטוכונדריה, בוצעו ניתוחי PLA כמותיים נוספים בין ORP5 או ORP8 לבין חלבון הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית PTPIP51, שותף קשירה ידוע של ORP5 ו-ORP813. אותות PLA זוהו גם בזוגות ORP5-PTPIP51 וגם בזוגות ORP8-PTPIP51, והמספרים הממוצעים שלהם היו דומים לזוג ORP5-ORP8 PLA, ואישרו לוקליזציה של ORP5 ו-ORP8 ב-MCS של ER-מיטוכונדריה (איור 3).

לבסוף, בעבודות אחרונות מהמעבדה שלנו, באמצעות שימוש בגישה דומה בתאי HeLa שהודבקו ב-PHPLCd-RFP או mcherry-PLN1 כדי לסמן את ה-PM או ה-LD, בהתאמה, הצלחנו לנתח את ההתרחשות של אינטראקציות ORP5-ORP8 PLA במגעים של ER-PM ולזהות אתר מגע תלת-כיווני בין מיטוכונדריה, חדר מיון ו-LDs (איור 4)15, 17.

figure-results-2821
איור 1: זרימת עבודה לזיהוי אותות PLA בקרבת מיטוכונדריה. ראשית, הערימות הקונפוקליות מחולקות כדי לזהות את מוקדי ה-PLA (כתמים) ואת הרשת המיטוכונדריאלית (משטחים). לאחר מכן, מפות מרחק תלת-ממדיות מחושבות לכיוון החלק החיצוני של המשטחים (מיטוכונדריה), ומאפשרות למדוד את המרחק של כל נקודה מהמיטוכונדריה הקרובה ביותר. לבסוף, כתמי PLA מסווגים לשתי אוכלוסיות (אדום וירוק) בהתבסס על סף קרבה של 380 ננומטר שנקבע על בסיס הדיוק של מערכת האיתור. נתון זה שונה מ- Monteiro-Cardoso et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3664
איור 2: תמונות מייצגות של קומפלקס ORP5-ORP8 המתבטאות ברמות אנדוגניות הממוקמות במגעים של ER-מיטוכונדריה. (A) סדרה קונפוקלית ORP5-ORP8 PLA והרכבה מחדש של תלת-ממד בהתאמה. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר ו- 2 מיקרומטר (תמונות מורחבות). (B) כימות של מוקדי ORP5-ORP8 PLA במגע הדוק עם מיטוכונדריה. Endo, n = 33 תאים, ו- Overexp ORP5+ORP8, n = 27 תאים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (שגיאת תקן של הממוצע). תמונה זו שונתה מ- Monteiro-Cardoso et al.15. (C) כימות של סך מוקדי ORP5-ORP8 PLA. Endo, n = 38 תאים, siORP5+siORP8, n = 38 תאים, ו- Overexp ORP5+ORP8, n = 35 תאים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (שגיאת תקן של הממוצע). תמונה זו שונתה מ- Monteiro-Cardoso et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4760
איור 3: תמונות מייצגות של אותות PLA בין ORP5 או ORP8 עם החלבון המיטוכונדריאלי PTPIP51. (A) סדרות קונפוקליות שימשו ליצירת מבנים מחדש תלת-ממדיים ומפות מרחק כדי לאשר שאינטראקציות ORPR5 או ORP8 PLA עם PTPIP51 מתרחשות במגעים קרובים של ER-מיטוכונדריה. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר ו- 2 מיקרומטר (תמונות מורחבות). (B) PTPIP51 תמונות קונפוקליות אימונופלואורסצנטיות (מישור מוקד יחיד) בבקרה ותאי HeLa שטופלו ב-siRNA המכוון PTPIP51. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר ו- 2 מיקרומטר (תמונות מורחבות). (C) תמונות קונפוקליות ORP5-PTPIP51 ו-ORP8-PTPIP51 PLA בבקרה ותאי HeLa שטופלו ב-siRNA המכוון PTPIP51. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5743
איור 4: דוגמאות לשחזורים תלת-ממדיים המשמשים למיקום קומפלקס ORP5-ORP8 PLA במגעי ER-PM ו-ER-מיטוכונדריה-LD. (A) תמונה קונפוקלית ובנייה מחדש תלת-ממדית בהתאמה של תא HeLa עם ORP5-ORP8 PLA, המיוצג על-ידי הכתמים הירוקים, PM המסומן ב-PHPLCd-RFP, המיוצג על-ידי התא האדום, ומיטוכונדריה המסומנים על-ידי מיטו-BFP, המיוצגים על-ידי משטחים כחולים. תמונות משמאל ובמרכז: ייצוג של כל תא HeLa. תמונה ימנית: ייצוג של אזור מוגדל בתוך התא. (B) תמונה קונפוקלית ובנייה מחדש תלת-ממדית בהתאמה של אזור מוגדל של תא HeLa עם ORP5-ORP8 PLA, המיוצג על-ידי הכתמים הירוקים, LDs המסומנים ב-mCherry-PLN1, המיוצג על-ידי המשטחים האדומים, ו-Mito-BFP, המיוצג על-ידי המשטחים הכחולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה נועד לזהות ולכמת אינטראקציות PLA בין אברונים של חלבונים בMCSs, במיוחד ב- MERCSs. החידוש של הפרוטוקול הוא שהוא משלב PLA עם תיוג של אברונים מרובים, מיקרוסקופ קונפוקלי וניתוח תמונה תלת-ממדית כדי למקם ולכמת אינטראקציות PLA בין שני חלבונים השוכנים באותו ממברנה, במקרה זה בתוך קרום המיון בסמיכות לקרום המיטוכונדריה (MAM) או עם MAM ו-LDs בו זמנית. פרוטוקול זה יכול לשמש ככלי לאימות חלבונים שעשויים להתמקם ב- MERCSs ספציפיים, אך גם ב- MCS אחרים.

מאז פיתוחו בשנת 2006, PLA בין ER לחלבון מיטוכונדריאלי נמצא בשימוש נרחב לכימות MERCSs 7,9,10,11. עם זאת, השימוש ב- PLA כאינדיקטור לשפע MERCS בתאים צריך להיות מאומת בקפידה על ידי גישות ברזולוציה גבוהה. לדוגמה, אבלציה של SAM50, חלבון מיטוכונדריאלי שאינו משפיע על שפע MERCSs (כפי שכומת במיקרוסקופ אלקטרונים)15, גם אינה משנה אינטראקציות PLA בין חלבון ER ORP8 לבין החלבון המיטוכונדריאלי TOM20, אך היא מפחיתה אינטראקציות PLA בין ORP8 לבין החלבון המיטוכונדריאלי Metaxin2 מבלי להפחית את רמות הביטוי שלהם 15. תוצאות אלה משקפות כי אינטראקציות PLA יכולות להיות ספציפיות לזוג החלבונים המשמשים בבדיקה ולא ניתן להשתמש בהן כפרמטר היחיד להערכת השפע של MERCS.

עם זאת, PLA היא גישה רגישה מוכחת לזיהוי אינטראקציות חלבון אנדוגני באתרו . בניגוד לשיטות גילוי פלואורסצנטיות אחרות, כולל GFP מפוצל ו-FRET, או גישות הדמיה ברזולוציה גבוהה, PLA אינו דורש ביטוי יתר של חלבונים מתויגים, תוך הימנעות מממצאים ניסיוניים אינהרנטיים, כגון שינוי התכונות הפיזיקליות של אברוני המטרה15. זיהוי אינטראקציות חלבונים על ידי PLA מציע גם יתרונות ביחס לשיטות אחרות לזיהוי חיסוני, כגון קו-אימונומשקעים עם כתם מערבי. בעוד PLA מאפשר כימות של נקודות פלואורסצנטיות בודדות ברמת התא הבודד, משקעים קו-חיסוניים דורשים כמות גבוהה של חומר ביולוגי ומאפשרים רק כימות יחסי של החלבון המופק ממאגר של תאים הטרוגניים, שעבורם קשה להשיג בקרת העמסה מתאימה15. היתרון הנוסף של השימוש ב- PLA בשילוב עם צביעת אברונים ומיקרוסקופ קונפוקלי על פני משקעים חיסוניים משותפים הוא שהגישה הראשונה מאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבונים ברמה התת-תאית.

מצד שני, החסרונות הבולטים של פרוטוקול זה קשורים לטווח זיהוי PLA של כ -40 ננומטר, שהוא גדול יותר מ- MERCSs, ועם הרזולוציה המקסימלית המושגת על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי של כ -250 ננומטר, מה שמקשה על זיהוי חד משמעי של אתרי מגע. עם זאת, כאן, סף של 380 ננומטר שימש להערכת כתמי PLA הקשורים למשטחי מיטוכונדריה בהתבסס על גודל תגובת ה- PLA, כולל הקשר של הנוגדנים הראשוניים והמשניים (30 ננומטר) בתוספת מחצית מה- FWHM של אותות ההגברה של ה- PLA (350 ננומטר). מגבלה נוספת של PLA קשורה לעובדה שניתן להשתמש בו רק בדגימות קבועות, ורכישת אות PLA מובחן, ספציפי וניתן לכימות דורשת זמינות של נוגדנים ספציפיים מאוד לחלבון המעניין15. בנוסף, ניתוח הדמיה תלת-ממדית להערכת מרחק דורש תוכנה ספציפית שייתכן שלא תהיה זמינה בכל המעבדות.

יש לציין כי ניתן לטפל בחלק מהחסרונות שהוזכרו לעיל באמצעות שימוש בטכנולוגיות שהיו זמינות לאחרונה. לדוגמה, ניתן להחליף מיקרוסקופיה קונפוקלית קונפוקלית קונבנציונלית בטכניקות הדמיה ברמת רזולוציה גבוהה יותר, כגון Airyscan או מיקרוסקופ מואר מובנה (SIM)17, וניתן להתגבר על היעדר נוגדנים ראשוניים טובים לחלבונים המעניינים על ידי תיוג יציב של חלבונים אנדוגניים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas918. לבסוף, ניתן לאמת את האיכות והספציפיות של הנוגדנים ואותות ה- PLA באמצעות הבקרות הבאות: 1) בדיקת הנוגדנים הראשוניים על ידי immunofluorescence וכתם מערבי בתאי ביקורת ובתאים שבהם החלבון המעניין דולדל או מבוטא יתר על המידה; 2) ביצוע PLA בתאים שבהם אחד או שני החלבונים בעלי העניין התרוקנו; 3) ביצוע PLA בתאים המבטאים יתר על המידה את החלבונים המעניינים; 4) ביצוע PLA תוך השמטת שני הנוגדנים לחלבונים המעניינים; 5) ביצוע PLA באמצעות אחד משני הנוגדנים בלבד עבור החלבונים המעניינים; 6) ביצוע PLA עם דגירה עם אותו IgG כמו המין שממנו נוצרו הנוגדנים הראשוניים. כדי להעריך את הספציפיות שלהם, הנוגדנים ששימשו בפרוטוקול הזה נבדקו על-ידי אימונופלואורסנציה וכתם מערבי בתאי ביקורת ובתאים שטופלו ב-siRNA המכוון ל-ORP5 15, ORP815 או PTPIP51 (איור 3B ו-Guyard et al.17). יתר על כן, הספציפיות של anti-ORP5 ו- anti-ORP8 הוערכה בתאים המבטאים ORP5 או ORP8 המתויגים ב- EGFP על ידי הערכת מקדם פירסון בין אות זיהוי הנוגדנים לבין אות EGFP15. הספציפיות של הנוגדנים anti-ORP5 15, anti-ORP815 ו-anti-PTPIP51 (איור 1 ואיור 3C) נותחו עוד יותר בתאים שבהם החלבונים האלה היו מדולדלים, מה שהוביל לירידה באותות PLA. יש לציין כי ריכוז הנוגדנים המתאים לצביעת אימונופלואורסנציה מתאים בדרך כלל גם ל- PLA; עם זאת, בהתאם לנוגדנים המשמשים, ניתן לבצע התאמות מסוימות בתמיסת החסימה ו / או בריכוזי הנוגדנים כדי לשפר את צביעת ה- PLA. צביעת ORP5-ORP8 ו-ORP8-PTPIP51 PLA שופרה לאחר התאמת פתרון החסימה. כדי להשיג צביעה מיטוכונדריאלית ו- PLA באיכות גבוהה, חיוני להשיג תמונות קונפוקליות באיכות גבוהה עם אותות רקע נמוכים, אשר חשובים כדי להקל על אפנון תלת ממדי. לדוגמה, תמונות קונפוקליות עם התאמות סף השפעה גבוהות על הרקע, וכתוצאה מכך, משפיעות על הדיוק של אפנון תלת ממדי של הרשת המיטוכונדריאלית או PLA.

לסיכום, הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר לוקליזציה וכימות של אינטראקציות חלבוני PLA בתת-תחומים ספציפיים של MERCS (אינטראקציות בין חלבונים הממוקמים ב-cis בתוך אותה ממברנה העוסקת ב-MCS או בין חלבונים הממוקמים בטרנס בתוך הממברנות הסמוכות) על ידי שימוש בתיוג אברונים רב-תאיים ויצירת מפות מרחק בתמונות קונפוקליות משוחזרות בתלת ממד. למרות שההליכים המתוארים כאן הם פשוטים מבחינה טכנית ומהירים יחסית בהשוואה למתודולוגיות אחרות לזיהוי אינטראקציות חלבונים ב- MERCSs, הנתונים המתקבלים ניתנים לשחזור במידה רבה. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא רב-תכליתי כמו הנוגדנים הזמינים עבור החלבונים המעניינים וכמו הסמנים הזמינים להכתמת האברונים. לכן, זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של זוגות של חלבונים וכמה אברונים MCSs.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), תוכנית ATIP-Avenir, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548), ואת Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay מדעי הצמח).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)Gibco14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)VWR21236.291
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5Agar ScientificL46R13-15
CMXRos red MitoTrackerInvitrogenM7512red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-XLeicaDMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well PlatesMerckCLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green SigmaDUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI SigmaDUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS SigmaDUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUSSigmaDUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence SigmaDUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement Gibco51985026serum free medium
Imaris software v 9.3BitplaneN/Acell imaging software
Incubator UINCU-line IL10VWR390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) Knittel Glass
mouse anti-ORP8 Santa Cruz134409
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148
rabbit anti-ORP5 SigmaHAP038712
SaponinSigma84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase freeInvitrogen10977-035

References

  1. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287(2019).
  2. Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
  3. Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
  4. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  5. Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
  6. Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443(2021).
  7. Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
  8. Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899(2016).
  9. Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074(2021).
  10. Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
  11. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
  12. Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  13. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  14. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757(2017).
  15. Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364(2022).
  16. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162(2020).
  17. Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107(2022).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE200PLA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved