近接ライゲーションアッセイによるER-ミトコンドリア接触部位における内因性オルガネラ内タンパク質相互作用の可視化と定量

膜接触部位(MCS)を研究するための新しいアプローチの必要性は、これらの細胞構造とその構成要素の研究への関心の高まりにより高まっています。ここでは、MCSに存在するオルガネラ内およびオルガネラ間タンパク質複合体を同定および定量するために、以前に利用可能であった顕微鏡技術を統合したプロトコルを紹介します。

膜接触部位(MCS)は、膜融合を伴うことなく、並置された細胞小器官間の多様な生体分子(すなわち、カルシウムおよび脂質)の動的交換を可能にし、調節する、膜が近接する領域である。MCSは細胞の恒常性維持に不可欠であり、その機能は多量体タンパク質複合体として存在することが多い常在成分によって保証されています。MCSは、脂質合成と細胞カルシウム貯蔵の主要な部位である小胞体(ER)に関与することが多く、古典的な小胞体輸送経路から除外されているミトコンドリアなどの細胞小器官にとって特に重要です。ここ数年、ERとミトコンドリアの間のMCSは、その機能が細胞の代謝/生体エネルギーに強く影響するため、広く研究されてきました。これらの接触部位では、膜テザー、カルシウムチャネル、脂質移動タンパク質など、いくつかのタンパク質が同定され始めており、これらのMCS成分を研究するための新しい方法論と技術的アプローチの必要性が高まっています。ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)、ミトコンドリア染色、3Dイメージングセグメンテーションなど、互いに物理的に近く(>40 nm)、ER-ミトコンドリアMCSの同じ膜上に存在するタンパク質の検出を可能にする、組み合わせた技術的アプローチで構成されるプロトコルについて説明します。例えば、ERミトコンドリアと小胞体原形質膜MCSで相互作用し、局在することが以前に示されている2つのERアンカー脂質伝達タンパク質、ORP5とORP8を使用しました。ORP5-ORP8 PLAを細胞イメージングソフトウェア解析と関連付けることにより、ORP5-ORP8複合体のミトコンドリア表面からの距離を推定し、ORP5-ORP8 PLA相互作用の約50%がミトコンドリアに近接する小胞体サブドメインで発生していると判断することができました。

オルガネラ間コミュニケーションは真核細胞の決定的な特徴です。オルガネラが通信する1つの方法は、テザー、脂質移動タンパク質、カルシウムチャネルなどの構造的および機能的タンパク質によって維持される2つのオルガネラ間の密接な膜対抗である膜接触部位(MCS)を形成することです¹。MCSは、類似または異なる細胞小器官間で確立することができ、それらは細胞の恒常性を維持するために重要な細胞成分の交換を媒介する。現在までに、小胞体(ER)-ミトコンドリア、小胞体-原形質膜(PM)、および小胞体-脂肪滴(LD)接触を含むいくつかのMCSが同定されています¹。その中で、ERとミトコンドリアの間に形成されるもの(MERCS)は、脂質やカルシウムの恒常性を含むいくつかの細胞機能の調節に関与しているため、最も研究されています²。ミトコンドリアは古典的な小胞輸送経路からほとんど除外されているため、ERから主要な脂質または脂質前駆体を輸入するために、MERCSとその分子成分に依存しています。MERCSを介したこれらの脂質の非小胞輸送は、適切なミトコンドリア脂質組成の維持、ならびにそれらの機能的および構造的完全性を保証します³。

さまざまな細胞機能へのMCSの重要な関与を考えると、それらの分子成分のより深い理解を提供することへの関心は、ここ数年で大幅に増加しています。MCSに関する知識を深めるために、いくつかのタイプのイメージングベースのアプローチが使用されてきました。その中でも、蛍光プローブベースの近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、内因性レベル⁴でオルガネラ間タンパク質間相互作用(検出範囲40 nm)を検出することにより、MCSの存在量の指標として広く使用されています。例えば、MERCSは、VDAC1-IP3R、GRP75-IP3R、CypD-IP3、およびPTPIP51-VAPB 5,6,7,8を含むいくつかのミトコンドリア-ERタンパク質ペア間のPLAを使用して視覚化および定量化されています。この技術は、MCS ^5,7,9,10,11に存在するオルガネラ間タンパク質間相互作用の検出と定量に使用されていますが、ほとんどの研究ではPLAとオルガネラ染色が組み合わされていませんでした。その結果、PLA相互作用と関連するオルガネラとの近接性の測定を可能にする定量的方法はまだ開発されていません。したがって、これまでのところ、ERタンパク質の場合、他の細胞小器官と接触している膜サブドメイン内でのそれらの相互作用は、広く分布したERネットワーク内でのそれらの相互作用と区別されていませんでした。

ここでは、同じオルガネラの膜に存在するタンパク質間のPLA相互作用を検出し、MCSでパートナーオルガネラの膜への近接を分析するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、2つの前提に基づいて開発されました:1)過剰発現条件下で、ER脂質転移タンパク質ORP5およびORP8がER-ミトコンドリアおよびER-PM MCSで共局在および相互作用することを示す以前の研究12,13,14,15およびORP5がER-LD接触^で局在すること^16,17;2)PLA、共焦点顕微鏡、オルガネラ標識、3Dイメージング分析などの既存技術。

1.ミトコンドリア染色および近接ライゲーションアッセイ(PLA)

1. プレート 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa細胞を、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%非必須アミノ酸を5%_CO2を含む37°Cで添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で維持し、手順当日に75%〜90%の細胞コンフルエントを可能にする希釈で、^1.5ウェルプレート中の1.5mmガラスカバーガラスに入れます。
   注:HeLa細胞は、ミトコンドリア染色およびPLAの前に、siRNA処理および/またはDNAプラスミドトランスフェクションなどの追加の処理に提出することができます。
2. ミトコンドリア染色
   1. 細胞を37°Cで予め温めた無血清培地で一度洗浄する。 細胞を予め温めた無血清培地で、5%_CO2で37°Cで10分間インキュベートします。
   2. あらかじめ温めた無血清培地で1 μMの赤色ミトコンドリアマーカーを調製します。
   3. 細胞を500 μLのミトコンドリアマーカー溶液とともに、5%_CO2を含む37°Cで30分間インキュベートします。ミトコンドリアマーカー治療およびプロトコルの次のステップの間、カバーガラス上の細胞を可能な限り光から保護してください。
   4. インキュベーション後、予め温めた無血清培地で1倍、1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2倍細胞を洗浄します。固定前の長い洗浄ステップはミトコンドリアの形態に影響を与える可能性があるため、できるだけ早くこのステップを実行してください。
   5. カバーガラスから1x PBSを取り出し、調製したばかりの4%PFA(1x PBS中)で化学フードの下で室温(暗所)で30分間インキュベートして細胞を固定します。500 μLの1x PBSで3回2分間洗浄します(使い捨てピペットまたはポンプに接続された真空システムを使用)。
   6. 1x PBSを取り外し、カバーガラスを500 μLの50mM NH₄Clとともに室温(暗所)で15分間インキュベートします。真空システムを使用して、500 μLの1x PSBで1回2分間洗浄します。
   7. ORP5-ORP8 PLAの場合はブロッキングバッファー1(BB1、1%BSA、1x PBS溶液中の0.1%サポニン)で3回2分間、ORP8-PTPIP51 PLAの場合はブロッキングバッファー2(BB2、2%BSA、0.1%正常ヤギ血清、1x PBS中0.1サポニン)で2分間洗浄します。
   8. カバーガラスを24ウェルプレートから湿度チャンバーに移します。カバーガラスをチャンバーに移した後、乾燥を避けるために100 μLのBB(使用する抗体のペアに応じてBB1またはBB2)を追加します。
      注意: 光から保護された湿度チャンバーは、ペトリ皿(プラスチックまたはガラス)をアルミホイルで包み、ペトリ皿の周囲に湿ったペーパータオルを数枚追加することで簡単かつ迅速に取得できます。
3. 近接ライゲーションアッセイ(PLA)
   注意: PLAプロトコルは、わずかな変更を加えて製造元の指示に従います。
   1. 一次抗体インキュベーション
      1. 一次抗体作業溶液を調製します。BB1でウサギ抗ORP5(1:150)とマウス抗ORP8(1:200)、BB2でマウス抗ORP8(1:200)とウサギ抗PTPIP51(1:200)、BB1でウサギ抗ORP5(1:150)とマウス抗PTPIP51(1:200)を希釈します。カバーガラスごとに(少なくとも)40 μLの一次抗体溶液を調製します(例:ウサギ抗ORP50.27 μL、マウス抗ORP80.2 μL、BB139.53 μL)。
      2. 真空システムを使用して前回の洗浄(ステップ1.2.8)からBBを取り出し、カバーガラスに40 μLの一次抗体溶液を追加します。光から保護された湿度チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。
   2. 真空システムを使用して、カバーガラスを対応するBB100 μLで5分間3回洗浄します。
   3. PLAプローブインキュベーション
      1. PLAプローブの作業溶液を準備します。ウサギプラス(1:5)とマウスマイナス(1:5)PLAプローブをBBで希釈し、混合します。カバーガラスごとに、(少なくとも)40 μLのPLAプローブ溶液を調製します(例:8 μLのウサギプラスPLAプローブ、8 μLのマウスマイナスPLAプローブ、24 μLのBB)。使用前に、PLAプローブ溶液を室温で20分間放置してください。
      2. 真空システムを使用して(ステップ1.3.2から)カバーガラスからBBを取り外し、カバーガラスに40μLのPLAプローブ溶液を追加します。光から保護された湿度チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。
   4. カバーガラスを室温で100 μLの1x洗浄バッファーA中で2回5分間洗浄します。
   5. 結紮
      1. 5倍ライゲーションバッファーを超純水で1:5に希釈して混合します。各カバーガラスについて、(少なくとも)40 μLのライゲーション溶液(8 μLの5xライゲーションバッファー、31 μLの超純水)を準備します。
      2. リガーゼ(1 U/μL、PLAキットに付属)を、前のステップで調製した1xライゲーションバッファーに1:40の希釈率で加え、混合します。
      3. 真空システムを使用してカバーガラスから1x洗浄バッファーAを取り出し(ステップ1.3.4から)、カバーガラスに40 μLのリガーゼ溶液を加え、光から保護された湿度チャンバー内で37°Cで30分間インキュベートします。
   6. カバーガラスを100 μLの1x洗浄バッファーA中で、真空システムを使用して室温で2回2分間洗浄します。
   7. 重合
      1. 5倍増幅バッファーを超純水で1:5に希釈し、混合します。カバーガラスごとに、(少なくとも)40 μLの増幅溶液(8 μLの5倍増幅バッファー、31.5 μLの超純水)を準備します。
      2. ポリメラーゼ(10 U/μL、PLAキットに付属)を前のステップで調製した1x重合バッファーに1:80の希釈で加え、混合します。
      3. 真空システムを使用してカバーガラスから1x洗浄バッファーAを取り出し(ステップ1.3.6から)、カバーガラスに40 μLのポリメラーゼ溶液を加え、光から保護された湿度チャンバー内で37°Cで1時間40分間インキュベートします。
   8. カバーガラスからポリメラーゼ溶液を取り除き、光から保護された湿度チャンバー内の室温で、100 μLの1x洗浄バッファーBで2回10分間洗浄します。
   9. カバーガラスを100 μLの0.001x洗浄バッファーB中で、光から保護された湿度チャンバー内で室温で1分間1回洗浄します。
   10. DAPI(濃度1.6〜0.4 μg/mL)を含む封入剤を使用して、顕微鏡検査用のスライドガラスにカバースリップを取り付けます。マニキュアで密封します。

2. 画像取得

1. PLAの結果を観察し、付属のソフトウェアを使用して63倍の油浸対物レンズを備えた蛍光共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。
2. 405 nmレーザーダイオードまたは白色光レーザーを使用して蛍光励起を設定し、GaAsP PMTまたはハイブリッド検出器でスペクトルウィンドウを収集します。各焦点面(300 nmに及ぶ)で、PLA(λex = 488 nm、λem = 505-560 nm)およびミトコンドリア(λex = 543 nm、λem = 606-670 nm)の蛍光シグナルを取得します。

3. ミトコンドリアに関連するPLAスポットの画像処理と評価

1. 細胞コンポーネント間の距離マップを生成する画像分析用のソフトウェアを使用して、共焦点画像を処理します。以下の手順に従って、PLAスポットとミトコンドリアネットワークの3D再構成を生成し、細胞イメージングソフトウェアを使用してそれらの間の距離にアクセスします(図1)。
2. 3D距離マップ拡張機能のインストール
   1. XTオプション付きの細胞解析ソフトウェアパッケージとMATLABソフトウェアの両方をインストールするか、Webサイトから自由にダウンロードできるMATLABコンパイラランタイム(MRC)のみをインストールします。
   2. XTension の起動時に MATLAB を起動するように細胞解析ソフトウェアを次のように設定します: Imaris (Mac OS X) または [編集] メニュー (Windows) オプションから [環境設定] を選択し、[カスタム ツール] パネルに変更して、パスを設定します。
      C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB.exe for Windows または/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab for Mac OS X.
3. 画像をソフトウェアにインポートする
   1. 共焦点スタック画像を .IMSファイルを、アリーナセクションから直接、またはバッチ変換を可能にするスタンドアロン ファイルコンバーター を使用します。
   2. インポート後、画像が適切にキャリブレーションされていることを確認してください。[ 画像プロパティ>画像ジオメトリ>編集]をクリックし、ボクセルサイズがXとYで実際の画像に期待されるピクセルサイズに対応していること(取得ソフトウェアの画像キャリブレーションを参照)、ZのボクセルサイズがZスタックを生成するために顕微鏡によって適用されたステップに対応していることを確認します。値が正しくない場合は、次の手順で距離が正しく推定されるように変更します。
   3. メニューの [ディスプレイ調整 ]でさまざまなチャンネルのコントラストを調整する には、[編集]>[ディスプレイ調整の表示]をクリックします。 各チャンネルを個別に調整して、各色の表示を最適化します。この手順は画像値に直接影響しませんが、正確なしきい値を設定したり、弱いオブジェクトを検出したりするには不可欠です。
   4. [編集] オプション > [3D を切り抜く] オプションを使用して画像をトリミングし、分析を 1 つのセルに制限します。同じ視野内の別のセルを分析するには、同じ画像をもう一度開き、別の画像を切り抜きます。
4. ORP5-ORP8スポット検出
   1. ORP5とORP8の相互作用の場所で生成されたPLA信号を検出するには、[新しいスポット の追加] オプションをクリックして、新しいオブジェクトのセットを作成し、スポット検出ウィザードを開きます。
   2. スポット検出を実行するチャネルを選択します。
   3. 推定XY直径を調整して(オブジェクトサイズが異なる場合は範囲を調整する必要があります)、スポット検出アルゴリズムが目的のオブジェクトを見つけやすくします。選択した値が高すぎると、近くのオブジェクトが融合することに注意してください。値が小さすぎると、1つの信号が複数の物体と見なされたり、異常な信号が検出されたりする場合があります。
   4. [背景減算]をクリックして、スポット検出の前に画像の背景を削除し、関心のあるオブジェクトの周囲の局所的なコントラストを高めます。
   5. しきい値パラメーターとして品質(オブジェクト中心の強度)とソフトウェア自動しきい値を維持してスポット検出しきい値を調整するか、この値を少し変更してすべてのオブジェクトを検出します。スポット検出が終了したら、検出パラメータを保存し、他の画像の処理に再利用します。
5. ミトコンドリアネットワーク検出
   1. ミトコンドリアネットワークを検出してサーフェスレンダリングを生成するには、[ 新しいサーフェスの追加 ]をクリックして新しいオブジェクトを作成し、サーフェス検出ウィザードを開きます。
   2. サーフェスの作成を実行するチャネルを選択します。
   3. ガウス フィルタを適用してより滑らかなサーフェスを得るには、[ スムーズ] チェック ボックスをオンにし、サーフェス上で観察可能な最小の詳細を示すしきい値を設定します。
   4. バックグラウンド減算を実行して、ローカルコントラストを強調し、しきい値ステップを支援します。
   5. 信号の強度に基づいてミトコンドリアネットワークを検出するようにしきい値を調整します。しきい値を適切に設定するのが難しい場合は、前の手順に戻って、滑らかさと背景の減算の程度を調整することをお勧めします。
   6. 必要に応じて、表面にフィルターを適用して、しきい値に起因する小さな残差を除去します。これを行うには、[サーフェスの分類] ウィンドウで [ ボクセルの数 ] フィルターを選択し、上限と下限のしきい値を試して、関心のあるオブジェクトのみを保持します。サーフェスの作成が終了したら、作成パラメータを保存し、他のイメージの処理に再利用します。
6. ミトコンドリア周辺の3次元距離マップの生成
   1. 以下のようにして先に作成したミトコンドリア表面の外側の距離マップを生成する。シーンツリーボックスでミトコンドリア表面を選択します。[ 画像処理]をクリックします> サーフェス機能 > 距離変換.これにより、マップをオブジェクト サーフェスの外側で計算するか内側で計算するかを選択するように求める Matlab XTension が呼び出されます。
   2. [ 外側サーフェスオブジェクト ]を選択して、PLAスポットとミトコンドリアの表面の間の距離を測定します。生成されると、距離マップはディスプレイ調整パネルに新しいチャンネルとして表示されます。このチャネルでは、すべてのピクセルに最も近いミトコンドリアまでの距離に対応する値があります。
7. 最も近いミトコンドリアからの物体の距離の抽出
   1. 各ポイントから最も近いミトコンドリアまでの距離を測定し、最も近いポイントを特定して視覚化するには、シーンツリーボックスで以前に生成されたスポットを選択します。
   2. 統計と詳細ログで、[ 特定の値 ] を選択します (スポットごとに 1 つの測定値を取得します)。 [中心強度 Ch=X ] を選択します (X は距離マップ チャンネルの番号に対応します)。これにより、距離マップ内の最も近いミトコンドリアまでの距離に対応する各スポット中心の値を測定します。
   3. ウィンドウの左下にある フロッピーディスク アイコンをクリックして、データを.csvファイルとしてエクスポートします。
   4. ミトコンドリアまでの距離に基づいてスポットの亜集団を抽出するには、シーン ツリーでスポットを選択し、[ フィルター] タブをクリックします。
   5. このウィンドウで、中心強度Ch=Xに基づく新しいフィルターをもう一度追加し、下限を0 μm、上限しきい値を0.380 μmに設定して、ミトコンドリアから380 nm未満のスポットを抽出します。
      注:380 nmの閾値は、一次抗体と二次抗体の会合(30 nm)にPLA増幅シグナルの半値幅(FWHM)の半分を加えたPLA反応に基づいて推定されました。
   6. 選択したスポットに焦点を合わせたり、たとえば明確な色を付けたりするには、[ 選択範囲を新しいスポットに 複製]ボタンを押して複製手順を実行します。

上記のプロトコルを用いて、2つのERアンカー脂質転移タンパク質であるORP5とORP8の相互作用部位を検出し、他の細胞小器官、特にミトコンドリアと接触している小胞体膜サブドメインでの発生を評価しました。そのために、HeLa細胞のミトコンドリアネットワークを赤色のミトコンドリアマーカーで染色し、免疫蛍光法で特異性を試験した一次抗体抗ORP5および抗ORP8を用いて固定した後、ORP5-ORP8 PLAグリーンスポットを検出した¹⁵。共焦点画像は、HeLa細胞における内因性ORP5-ORP8 PLA相互作用が、網状ER、皮質ER、および一般にミトコンドリア関連小胞体膜(MAM;図2A)。MAMsで生じるORP5-ORP8 PLA相互作用を定量化するために、ミトコンドリアからの各PLAスポットの距離を3D画像解析を用いて評価した。380 nmの距離閾値を使用して、3Dイメージング分析により、内因性ORP5-ORP8 PLA相互作用の約50%がMAMで検出されたことが明らかになりました(図2A、B)。相互作用の他の50%は、皮質ER15と網状^ER15の間で分布していた。PLAの特異性を検証するために、ORP5-ORP8 PLA実験を、ORP5標的およびORP8標的siRNAで処理した細胞(陰性対照)またはORP5およびORP8を共過剰発現する細胞(陽性対照)のいずれかで実施した。ORP5およびORP8のダウンレギュレーションは、PLAシグナルの総数の大幅な減少を誘発しました(MAM、網状ER、および皮質ER;図2A、C)、それらの共過剰発現はPLAの増加をもたらしたが(図2A、C)、ORP5−ORP8 PLAの特異性を確認した。しかし、興味深いことに、ORP5とORP8を共発現する細胞においてMAMで生じるORP5-ORP8 PLA相互作用の割合は、これらのタンパク質が内因性レベルで発現している細胞で観察されたものと同様であり(図2B)、MAMにおける複合体としての存在を支持しています。ミトコンドリアと密着している小胞体膜サブドメインにおけるORP5およびORP8の存在をさらに確認するために、ORP5またはORP8とORP5およびORP8の既知の結合パートナーであるミトコンドリア外膜タンパク質PTPIP51との間の追加の定量PLA分析を実施した¹³。PLAシグナルはORP5-PTPIP51とORP8-PTPIP51のカップルの両方で検出され、それらの平均数はORP5-ORP8 PLAカップルと同様であり、ER-ミトコンドリアMCSでのORP5とORP8の局在を確認しました(図3)。

最後に、私たちの研究室の最近の研究では、PHPLCd-RFPまたはmcherry-PLN1を導入したHeLa細胞で同様のアプローチを使用して、それぞれPMまたはLDをマークすることにより、ER-PM接触でのORP5-ORP8 PLA相互作用の発生を分析し、ミトコンドリア、ER、およびLD間の三者接触部位を特定することができました(図4)^15。17.

図1:ミトコンドリアに近接したPLAシグナルを同定するためのワークフロー。 まず、共焦点スタックをセグメント化して、PLA病巣(スポット)とミトコンドリアネットワーク(表面)を特定します。次に、表面(ミトコンドリア)の外側に向かって3D距離マップが計算され、最も近いミトコンドリアから各スポットの距離を測定できます。最後に、PLAスポットは、検出システムの精度に基づいて確立された380nmの近接閾値に基づいて、2つの集団(赤と緑)に分類されます。この図はモンテイロ・カルドーゾらから修正されたものである¹⁵。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ER-ミトコンドリア接触部に局在する内因性レベルで発現したORP5-ORP8複合体の代表的な画像。 (A)ORP5-ORP8 PLA共焦点シリーズとそれぞれの3D再構成。スケールバー:10 μmおよび2 μm(拡大画像)。(B)ミトコンドリアと密着しているORP5-ORP8 PLA病巣の定量。遠藤、n = 33細胞、およびOverexp ORP5 + ORP8、n = 27細胞。データはSEM±平均(平均の標準誤差)として表示されます。この画像はMonteiro-Cardosoらから修正されています¹⁵。(C)総ORP5-ORP8 PLA病巣の定量化。遠藤、n = 38細胞、siORP5+siORP8、n = 38細胞、およびOverexp ORP5+ORP8、n = 35細胞。データはSEM±平均(平均の標準誤差)として表示されます。この画像はMonteiro-Cardosoらから修正されています¹⁵。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ORP5またはORP8とミトコンドリアタンパク質PTPIP51との間のPLAシグナルの代表的な画像 。 (A)共焦点系列を使用して3D再構成と距離マップを生成し、ORPR5またはORP8 PLAとPTPIP51相互作用がER-ミトコンドリアの密接な接触で発生することを確認しました。スケールバー:10 μmおよび2 μm(拡大画像)。(b)PTPIP51 PTPIP51を標的とするsiRNAで処理した対照およびHeLa細胞における共焦点(単焦点面)の免疫蛍光画像。スケールバー:10 μmおよび2 μm(拡大画像)。(c)コントロールおよびsiRNAで処理したHeLa細胞におけるORP5-PTPIP51およびORP8-PTPIP51 PLA共焦点画像PTPIP51。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ER-PMおよびER-ミトコンドリア-LD接触におけるORP5-ORP8 PLA複合体の局在化に使用される3D再構成の例。 (A)緑色の斑点で表されるORP5-ORP8 PLA、赤色の細胞で表されるPHPLCd-RFPでマークされたPM、および青色の表面で表されるMito-BFPでマークされたミトコンドリアを有するHeLa細胞の共焦点画像とそれぞれの3D再構成。左と中央の画像:HeLa細胞全体の表現。右の画像: セル内のズームされた領域の表現。(B)緑色の斑点で表されるORP5-ORP8 PLA、赤色の表面で表されるmCherry-PLN1でマークされたLD、および青色の表面で表されるMito-BFPを有するHeLa細胞のズームイン領域の共焦点画像とそれぞれの3D再構成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

このプロトコルは、MCS、特にMERCSにおけるオルガネラ間タンパク質PLA相互作用を同定および定量するために設計されました。このプロトコルの目新しさは、PLAと複数の細胞小器官の標識、共焦点顕微鏡、および3D画像分析を組み合わせて、同じ膜(この場合はミトコンドリア膜(MAM)またはMAMとLDに近接するER膜内)に存在する2つのタンパク質間のPLA相互作用を局在化および定量化することです。このプロトコルは、特定のMERCSだけでなく他のMCSでも局在する可能性のあるタンパク質を検証するためのツールとして使用できます。

2006年の開発以来、ERとミトコンドリアタンパク質の間のPLAは、MERCS^の定量に広く使用されています7^、9、^10、11。ただし、細胞内のMERCS存在量の指標としてのPLAの使用は、高分解能アプローチによって慎重に検証する必要があります。例えば、(電子顕微鏡で定量化)MERCSの存在量に影響を与えないミトコンドリアタンパク質であるSAM50のアブレーション15も、ERタンパク質ORP8とミトコンドリアタンパク質TOM20との間のPLA相互作用を変化させませんが、ORP8とミトコンドリアタンパク質Metaxin2との間のPLA相互作用を、それらの発現レベルを低下させることなく減少させます¹⁵.これらの結果は、PLA相互作用がアッセイに使用されるタンパク質のペアに特異的であり、MARCSの存在量を評価するための唯一のパラメーターとして使用できないことを反映しています。

それにもかかわらず、PLAは、 in situ 内因性タンパク質相互作用を検出するための実証済みの高感度アプローチです。split-GFPおよびFRETを含む他の蛍光プローブベースの検出方法、または高分解能イメージングアプローチとは対照的に、PLAはタグ付きタンパク質の過剰発現を必要とせず、標的オルガネラの物理的特性の変化などの固有の実験的アーチファクトを回避します¹⁵。PLAによるタンパク質相互作用の検出は、ウェスタンブロットによる共免疫沈降などの他の免疫検出法と比較しても利点を提供します。PLAは単一細胞レベルでの単一蛍光スポットの定量を可能にしますが、共免疫沈降は大量の生物学的物質を必要とし、適切な負荷制御を得ることが困難な不均一な細胞のプールから抽出されたタンパク質の相対定量のみを可能にします¹⁵。共免疫沈降よりもPLAをオルガネラ染色および共焦点顕微鏡法と組み合わせて使用することのさらなる利点は、最初のアプローチが細胞内レベルでのタンパク質相互作用の局在化を可能にすることです。

一方、このプロトコルの顕著な欠点は、MERCSよりも大きい約40 nmのPLA検出範囲と、約250 nmの共焦点顕微鏡によって達成される最大分解能に関連するため、接触部位を明確に特定することが困難になります。ただし、ここでは、一次抗体と二次抗体の会合(30 nm)にPLA増幅シグナルの半値幅の半分(350 nm)を加えたPLA反応のサイズに基づいて、ミトコンドリア表面に関連するPLAスポットを推定するために380 nmの閾値を使用しました。PLAの別の制限は、固定サンプルでのみ使用できるという事実に関連しており、明確で特異的で定量可能なPLAシグナルを取得するには、目的のタンパク質に非常に特異的な抗体の可用性が必要です¹⁵。さらに、距離推定のための3Dイメージング解析には、すべてのラボですぐに利用できるとは限らない特定のソフトウェアが必要です。

特に、上記の欠点のいくつかは、最近利用可能なテクノロジーを使用することで対処できます。例えば、従来の共焦点顕微鏡法は、Airyscanや構造化照明顕微鏡(SIM)¹⁷などの高解像度レベルのイメージング技術に置き換えることができ、CRISPR-Cas9技術を使用して内因性タンパク質を安定してタグ付けすることで、目的のタンパク質に対する優れた一次抗体の欠如を克服できます¹⁸.最後に、抗体およびPLAシグナルの品質と特異性は、以下のコントロールを使用して検証できます:1)コントロール細胞および目的のタンパク質が枯渇または過剰発現している細胞における免疫蛍光およびウェスタンブロットによる一次抗体の試験;2)目的のタンパク質の一方または両方が枯渇した細胞でPLAを行う工程;3)目的のタンパク質を共過剰発現する細胞においてPLAを行う工程;4)目的のタンパク質に対する両方の抗体を省略した状態でPLAを行う工程;5)目的のタンパク質に対して2つの抗体のうちの1つのみを用いてPLAを行う工程;6)一次抗体が生成された菌種と同じIgGを用いてPLAとのインキュベーションを行う。それらの特異性を評価するために、このプロトコルで使用された抗体を、対照細胞およびORP5¹⁵、ORP8¹⁵、またはPTPIP51を標的とするsiRNAで処理した細胞において、免疫蛍光法およびウェスタンブロットによって試験した(図3BおよびGuyardら¹⁷)。さらに、抗ORP5および抗ORP8特異性は、抗体検出シグナルとEGFPシグナルとの間のピアソン係数を評価することによってEGFPタグORP5またはORP8を発現する細胞において評価されている¹⁵。抗ORP5 15、抗ORP8¹⁵、および抗PTPIP51(図1および図3C)抗体の特異性を、これらのタンパク質が枯渇した細胞でさらに分析され、PLAシグナルの減少につながりました。注目すべきことに、免疫蛍光染色に適した抗体濃度は、通常、PLAにも適しています。ただし、使用する抗体によっては、ブロッキング溶液および/または抗体濃度を調整して、PLA染色を改善することができます。ORP5-ORP8およびORP8-PTPIP51 PLA染色は、ブロッキング溶液を調整した後に改善した。高品質のミトコンドリア染色やPLA染色を得るためには、3D変調を促進するために重要な、バックグラウンドシグナルの少ない高品質の共焦点画像を取得することが不可欠です。例えば、高いバックグラウンドを有する共焦点画像は、閾値調整に影響を与え、その結果、ミトコンドリアネットワークまたはPLAの3D変調の精度に影響を与える。

結論として、ここで提示されたプロトコルは、多細胞オルガネラ標識を使用し、3D再構成共焦点画像で距離マップを生成することにより、特定のMERCSサブドメインでのPLAタンパク質相互作用(MCSに関与する同じ膜内の シスに 局在するタンパク質間、または並置された膜内の トランス に局在するタンパク質間の相互作用)の局在化と定量を可能にします。ここで説明する手順は、MERCSでのタンパク質相互作用を検出するための他の方法論と比較して技術的に単純で比較的高速ですが、得られたデータは再現性が高いです。さらに、このプロトコルは、目的のタンパク質に利用可能な抗体や細胞小器官を染色するために利用可能なマーカーと同じくらい汎用性があります。したがって、それはタンパク質のペアの広い範囲およびいくつかの細胞小器官およびMCSに適用することができる。

著者は開示するものは何もありません。

この研究は、ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD)、ATIP-Avenir Program、Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548)、Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527)、I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope、ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging;ANR-11-IDEX-0003-02/サクレー植物科学)。