Visualisierung und Quantifizierung endogener intraorganeller Proteininteraktionen an ER-Mitochondrien-Kontaktstellen durch Proximity-Ligation-Assays

Der Bedarf an neuen Ansätzen zur Untersuchung von Membrankontaktstellen (MCS) ist aufgrund des zunehmenden Interesses an der Untersuchung dieser zellulären Strukturen und ihrer Komponenten gestiegen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das bisher verfügbare Mikroskopietechnologien integriert, um intra- und interorganelle Proteinkomplexe, die sich an MCS befinden, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Membrankontaktstellen (MCS) sind Bereiche mit enger Membrannähe, die den dynamischen Austausch verschiedener Biomoleküle (d. h. Kalzium und Lipide) zwischen den nebeneinander liegenden Organellen ermöglichen und regulieren, ohne dass eine Membranfusion erforderlich ist. MCS sind essentiell für die zelluläre Homöostase, und ihre Funktionen werden durch die residenten Komponenten sichergestellt, die oft als multimere Proteinkomplexe vorliegen. MCS betreffen häufig das endoplasmatische Retikulum (ER), einen wichtigen Ort der Lipidsynthese und der zellulären Kalziumspeicherung, und sind besonders wichtig für Organellen wie die Mitochondrien, die von den klassischen vesikulären Transportwegen ausgeschlossen sind. In den letzten Jahren wurden MCS zwischen dem ER und den Mitochondrien ausgiebig untersucht, da ihre Funktionen den zellulären Stoffwechsel/die Bioenergetik stark beeinflussen. An diesen Kontaktstellen wurden mehrere Proteine identifiziert, darunter Membrankabel, Kalziumkanäle und Lipidtransferproteine, was den Bedarf an neuen Methoden und technischen Ansätzen zur Untersuchung dieser MCS-Komponenten erhöht. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das aus kombinierten technischen Ansätzen besteht, die Proximity-Ligations-Assay (PLA), Mitochondrien-Färbung und 3D-Imaging-Segmentierung umfassen, die den Nachweis von Proteinen ermöglicht, die physikalisch nahe beieinander (>40 nm) sind und sich auf derselben Membran an ER-Mitochondrien-MCS befinden. Zum Beispiel haben wir zwei ER-verankerte Lipidtransferproteine, ORP5 und ORP8, verwendet, von denen bereits gezeigt wurde, dass sie an ER-Mitochondrien und ER-Plasmamembran-MCS interagieren und lokalisieren. Durch die Assoziation des ORP5-ORP8 PLA mit der Analyse der Zellbildgebungssoftware war es möglich, den Abstand des ORP5-ORP8-Komplexes von der mitochondrialen Oberfläche abzuschätzen und festzustellen, dass etwa 50% der ORP5-ORP8 PLA-Interaktion an ER-Subdomänen in unmittelbarer Nähe der Mitochondrien stattfindet.

Die Kommunikation zwischen den Organellen ist ein wesentliches Merkmal eukaryotischer Zellen. Eine Art und Weise, wie Organellen kommunizieren, ist die Bildung von Membrankontaktstellen (MCSs), bei denen es sich um enge Membranoppositionen zwischen zwei Organellen handelt, die durch strukturelle und funktionelle Proteine wie Haltegurte, Lipidtransferproteine und Kalziumkanäle aufrechterhalten werden¹. MCS können zwischen ähnlichen oder unterschiedlichen Organellen etabliert werden und vermitteln den Austausch zellulärer Komponenten, was für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase wichtig ist. Bisher wurden mehrere MCS identifiziert, darunter endoplasmatische Retikula (ER)-Mitochondrien, ER-Plasmamembran (PM) und ER-Lipidtröpfchen (LD)-Kontakte¹. Unter ihnen gehören diejenigen, die zwischen dem ER und den Mitochondrien (MERCS) gebildet werden, zu den am besten untersuchten, da sie an der Regulierung mehrerer zellulärer Funktionen beteiligt sind, einschließlich der Lipid- und Kalziumhomöostase². Da Mitochondrien von den klassischen vesikulären Transportwegen weitgehend ausgeschlossen sind, sind sie auf MERCS und ihre molekularen Bestandteile angewiesen, um Schlüssellipide oder Lipidvorläufer aus dem ER zu importieren. Der nicht-vesikuläre Transport dieser Lipide durch MERCS gewährleistet die Aufrechterhaltung der korrekten Zusammensetzung der mitochondrialen Lipide sowie ihrer funktionellen und strukturellen Integrität³.

Angesichts der entscheidenden Beteiligung von MCS an verschiedenen zellulären Funktionen hat das Interesse an einem tieferen Verständnis ihrer molekularen Bestandteile in den letzten Jahren stark zugenommen. Verschiedene Arten von bildgebenden Ansätzen wurden verwendet, um das Wissen über MCS zu erweitern. Unter ihnen wurde der Fluoreszenzsonden-basierte Proximity-Ligation-Assay (PLA) häufig als Indikator für die Häufigkeit von MCS verwendet, indem er interorganelle Protein-Protein-Wechselwirkungen (in einem Nachweisbereich von 40 nm) auf endogenen Ebenen nachweist⁴. Zum Beispiel wurden MERCS visualisiert und quantifiziert, indem PLA zwischen mehreren Mitochondrien-ER-Proteinpaaren verwendet wurde, darunter VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 und PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Obwohl diese Technologie verwendet wurde, um interorganelle Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen und zu quantifizieren, die am MCS^{vorhanden sind} 5,7,9,10,11^, kombinierten die meisten Studien PLA nicht mit Organellenfärbung. Folglich wurde noch keine quantitative Methode entwickelt, die es ermöglicht, die Nähe zwischen PLA-Wechselwirkungen und assoziierten Organellen zu messen. Bisher wurde daher im Falle von ER-Proteinen ihre Interaktion innerhalb von Membransubdomänen in Kontakt mit anderen Organellen nicht von ihrer Interaktion innerhalb des weit verteilten ER-Netzwerks unterschieden.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Nachweis von PLA-Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die sich in der Membran derselben Organelle befinden, und um ihre Nähe zur Membran der Partnerorganelle am MCS zu analysieren. Dieses Protokoll wurde auf der Grundlage von zwei Prämissen entwickelt: 1) frühere Studien, die zeigen, dass unter Überexpressionsbedingungen die ER-Lipidtransferproteine ORP5 und ORP8 an ER-Mitochondrien und ER-PM MCS 12,13,14,15 kolokalisieren und interagieren und dass ORP5 an ER-LD-Kontakten lokalisiert^16,17; 2) bestehende Technologien, einschließlich PLA, konfokale Mikroskopie, Organellenmarkierung und 3D-Bildgebungsanalyse.

1. Mitochondriale Färbung und Proximity-Ligations-Assay (PLA)

1. Platte 0,5 x 10 5-2 x 10⁵ HeLa-Zellen, aufbewahrt in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren bei 37 °C mit 5 % CO₂, in 13-mm-Glasdeckgläsern in 1,5-in-24-Well-Platten in einer Verdünnung, die am Tag des Eingriffs eine Zellkonfluenz von 75 % bis 90 % ermöglicht.
   HINWEIS: Zu beachten ist, dass HeLa-Zellen vor der mitochondrialen Färbung und PLA zusätzlichen Behandlungen unterzogen werden können, wie z. B. einer siRNA-Behandlung und/oder einer DNA-Plasmidtransfektion.
2. Mitochondriale Färbung
   1. Waschen Sie die Zellen einmal in einem serumfreien, bei 37 °C vorgewärmten Medium. Die Zellen werden mit vorgewärmtem serumfreiem Medium für 10 min bei 37 °C mit 5 %_CO2 inkubiert.
   2. Bereiten Sie 1 μM roten mitochondrialen Marker in einem vorgewärmten serumfreien Medium vor.
   3. Die Zellen werden mit 500 μl mitochondrialer Markerlösung für 30 min bei 37 °C mit 5 %_CO2 inkubiert. Bewahren Sie die Zellen während der Behandlung mit mitochondrialen Markern und den folgenden Schritten des Protokolls so gut wie möglich auf Deckgläsern vor Licht geschützt auf.
   4. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen 1x in vorgewärmtem serumfreiem Medium und 2x in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich durch, da lange Waschschritte vor der Fixierung die mitochondriale Morphologie beeinträchtigen können.
   5. Entfernen Sie das 1x PBS aus den Deckgläsern und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in frisch zubereitetem 4% PFA (in 1x PBS) für 30 Minuten bei Raumtemperatur (im Dunkeln) unter der chemischen Haube inkubieren. 3x für 2 min in 500 μl 1x PBS waschen (mit Einwegpipetten oder einem an eine Pumpe angeschlossenen Vakuumsystem).
   6. Entfernen Sie das 1x PBS und inkubieren Sie die Deckgläser mit 500 μl 50 mM NH₄Cl für 15 Minuten bei Raumtemperatur (im Dunkeln). 1x 2 min in 500 μl 1x PSB mit einem Vakuumsystem waschen.
   7. 3x für 2 min in 500 μl Blockierungspuffer 1 (BB1, 1 % BSA, 0,1 % Saponin in 1x PBS) für das ORP5-ORP8 PLA oder Blockierungspuffer 2 (BB2, 2 % BSA, 0,1 % normales Ziegenserum, 0,1 Saponin in 1x PBS) für das ORP8-PTPIP51 PLA waschen.
   8. Übertragen Sie die Deckgläser von der 24-Well-Platte in eine Feuchtigkeitskammer. Nachdem Sie die Deckgläser in die Kammer gegeben haben, fügen Sie 100 μl BB (BB1 oder BB2, je nach verwendetem Antikörperpaar) hinzu, um Trockenheit zu vermeiden.
      HINWEIS: Eine lichtgeschützte Feuchtigkeitskammer kann einfach und schnell erreicht werden, indem eine Petrischale (Kunststoff oder Glas) in Aluminiumfolie eingewickelt und einige Stücke nasses Papiertuch in den Rand der Petrischale gelegt werden.
3. Proximity-Ligations-Assay (PLA)
   HINWEIS: Das PLA-Protokoll folgt den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen.
   1. Inkubation von Primärantikörpern
      1. Bereiten Sie die primäre Antikörper-Arbeitslösung vor. Verdünnung von Kaninchen-Anti-ORP5 (1:150) plus Maus-Anti-ORP8 (1:200) in BB1, Maus-Anti-ORP8 (1:200) plus Kaninchen-Anti-PTPIP51 (1:200) in BB2 und Kaninchen-Anti-ORP5 (1:150) plus Maus-Anti-PTPIP51 (1:200) in BB1. Bereiten Sie (mindestens) 40 μl Primärantikörperlösung pro Deckglas vor (z. B. 0,27 μl Kaninchen-Anti-ORP5, 0,2 μl Maus-Anti-ORP8, 39,53 μl BB1).
      2. Entfernen Sie das BB aus der vorherigen Wäsche (Schritt 1.2.8) mit einem Vakuumsystem und geben Sie 40 μl Primärantikörperlösung in die Deckgläser. 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer lichtgeschützten Feuchtekammer inkubieren.
   2. Deckgläser 3x für 5 min mit 100 μL des entsprechenden BB im Vakuumsystem waschen.
   3. Inkubation der PLA-Sonde
      1. Bereiten Sie die Arbeitslösung der PLA-Sonden vor. Kaninchen PLUS (1:5) und Maus MINUS (1:5) PLA-Sonden in BB verdünnen und mischen. Bereiten Sie für jedes Deckglas (mindestens) 40 μl PLA-Sondenlösung vor (z. B. 8 μl Kaninchen-PLUS-PLA-Sonde, 8 μl Maus-MINUS-PLA-Sonde, 24 μl BB). Lassen Sie die PLA-Sondenlösung vor Gebrauch 20 Minuten bei Raumtemperatur einwirken.
      2. Entfernen Sie das BB mit einem Vakuumsystem aus den Deckgläsern (aus Schritt 1.3.2) und geben Sie 40 μl PLA-Sondenlösung in die Deckgläser. 1 Stunde bei 37°C in einer lichtgeschützten Feuchtekammer inkubieren.
   4. Waschen Sie die Deckgläser 2x für 5 min in 100 μl 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur.
   5. Gebundenheit
      1. 5x Ligationspuffer auf 1:5 in Reinstwasser verdünnen und mischen. Bereiten Sie für jedes Deckglas (mindestens) 40 μl Ligationslösung vor (8 μl 5x Ligationspuffer, 31 μl Reinstwasser).
      2. Geben Sie die Ligase (1 U/μl, im PLA-Kit enthalten) zu 1x Ligationspuffer, der im vorherigen Schritt in einer Verdünnung von 1:40 hergestellt wurde, und mischen Sie.
      3. 1x Waschpuffer A aus den Deckgläsern (aus Schritt 1.3.4) mit einem Vakuumsystem entfernen, 40 μl Ligaselösung in die Deckgläser geben und 30 min bei 37 °C in einer lichtgeschützten Feuchtekammer inkubieren.
   6. Waschen Sie die Deckgläser 2x für 2 min in 100 μl 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur mit dem Vakuumsystem.
   7. Polymerisation
      1. 5x Amplifikationspuffer 1:5 in Reinstwasser verdünnen und mischen. Bereiten Sie für jedes Deckglas (mindestens) 40 μl Amplifikationslösung vor (8 μl 5-facher Amplifikationspuffer, 31,5 μl Reinstwasser).
      2. Die Polymerase (10 U/μl, im PLA-Kit enthalten) zu dem im vorherigen Schritt hergestellten 1-fachen Polymerisationspuffer in einer Verdünnung von 1:80 zugeben und mischen.
      3. 1x Waschpuffer A aus den Deckgläsern (aus Schritt 1.3.6) mit einem Vakuumsystem entfernen, 40 μl Polymeraselösung in die Deckgläser geben und 1 h 40 min bei 37 °C in einer lichtgeschützten Feuchtekammer inkubieren.
   8. Die Polymeraselösung aus den Deckgläsern entfernen und 2 x für 10 Minuten in 100 μl 1x Waschpuffer B bei Raumtemperatur in einer lichtgeschützten Feuchtigkeitskammer waschen.
   9. Waschen Sie die Deckgläser 1x für 1 min in 100 μl von 0,001x Waschpuffer B bei Raumtemperatur in einer lichtgeschützten Feuchtigkeitskammer.
   10. Montieren Sie die Deckgläser auf Objektträger für die Mikroskopie mit Eindeckmedium mit DAPI (Konzentration zwischen 1,6-0,4 μg/ml). Mit Nagellack versiegeln.

2. Bildaufnahme

1. Beobachten Sie die PLA-Ergebnisse und nehmen Sie Bilder mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv mit der mitgelieferten Software auf.
2. Stellen Sie die Fluoreszenzanregung mit einer 405-nm-Laserdiode oder einem Weißlichtlaser ein und erfassen Sie die Spektralfenster mit GaAsP-PMTs oder Hybriddetektoren. In jeder Brennebene (über 300 nm) werden die Fluoreszenzsignale für PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) und Mitochondrien (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm) erfasst.

3. Bildverarbeitung und Beurteilung von PLA-Flecken, die mit Mitochondrien assoziiert sind

1. Verarbeiten Sie die konfokalen Bilder mit einer Software zur Bildanalyse, die Abstandskarten zwischen den zellulären Komponenten erstellt. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um 3D-Rekonstitutionen von PLA-Flecken und dem mitochondrialen Netzwerk zu erstellen und den Abstand zwischen ihnen mithilfe einer Zellbildgebungssoftware zu ermitteln (Abbildung 1).
2. Installation der 3D-Entfernungskartenerweiterung
   1. Installieren Sie sowohl das Zellanalyse-Softwarepaket mit der XT-Option als auch die MATLAB-Software oder nur eine MATLAB-Compiler-Runtime (MRC), die kostenlos von der Website heruntergeladen werden kann.
   2. Richten Sie die Zellanalysesoftware so ein, dass MATLAB gestartet wird, wenn eine XTension gestartet wird, und zwar wie folgt: Wählen Sie in der Option Imaris (Mac OS X) bzw. im Menü " Bearbeiten " (Windows) die Option "Voreinstellungen", wechseln Sie zum Bedienfeld " Benutzerdefinierte Werkzeuge" und legen Sie dann den Pfad fest:
      C:\Programme\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe für Windows oder/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab für Mac OS X.
3. Importieren Sie die Bilder in die Software
   1. Konvertieren Sie die konfokalen Stapelbilder in eine . IMS-Datei, entweder direkt über den Arena-Bereich oder mit dem eigenständigen Dateikonverter , der eine Batch-Konvertierung ermöglicht.
   2. Überprüfen Sie nach dem Import, ob die Bilder richtig kalibriert bleiben. Klicken Sie auf > Bildeigenschaften > Bildgeometrie bearbeiten und überprüfen Sie, ob die Voxelgröße in X und Y der für das eigentliche Bild erwarteten Pixelgröße entspricht (siehe Bildkalibrierung in der Erfassungssoftware) und ob die Voxelgröße in Z dem Schritt entspricht, den das Mikroskop zur Erzeugung des Z-Stapels anwendet. Wenn die Werte nicht korrekt sind, ändern Sie sie, um eine korrekte Schätzung der Entfernungen in den folgenden Schritten sicherzustellen.
   3. Passen Sie den Kontrast der verschiedenen Kanäle im Menü Display-Anpassung an, indem Sie auf Bearbeiten > Display-Justage anzeigen klicken. Passen Sie jeden Kanal unabhängig voneinander an, um die Anzeige der einzelnen Farben zu optimieren. Dieser Schritt wirkt sich nicht direkt auf die Bildwerte aus, ist aber unerlässlich, um präzise Schwellenwerte festzulegen oder schwache Objekte zu erkennen.
   4. Beschränken Sie die Analyse auf eine einzelne Zelle, indem Sie das Bild mit den Optionen Bearbeiten > 3D zuschneiden zuschneiden. Um eine andere Zelle im selben Sichtfeld zu analysieren, öffnen Sie dasselbe Bild erneut und schneiden Sie es anders zu.
4. ORP5-ORP8 Spot-Detektion
   1. Erkennen Sie die PLA-Signale, die an der Stelle der ORP5- und ORP8-Interaktion erzeugt werden, indem Sie auf die Option Neue Spots hinzufügen klicken , wodurch ein neuer Satz von Objekten erstellt und der Spot-Erkennungsassistent geöffnet wird.
   2. Wählen Sie den Kanal aus, auf dem die Spot-Erkennung durchgeführt werden soll.
   3. Passen Sie den geschätzten XY-Durchmesser an (der Bereich muss angepasst werden, wenn die Objektgröße abweicht), damit der Spot-Erkennungsalgorithmus die gewünschten Objekte finden kann. Beachten Sie, dass bei einem zu hohen Wert die Objekte in der Nähe verschmelzen. Wenn der Wert zu klein ist, kann ein Signal als mehrere Objekte betrachtet werden, oder es können abweichende Signale erkannt werden.
   4. Klicken Sie auf Hintergrundsubtraktion , um den Bildhintergrund vor der Spot-Erkennung zu entfernen und den lokalen Kontrast um die interessierenden Objekte zu verstärken.
   5. Passen Sie den Schwellenwert für die Spot-Erkennung an, indem Sie die Qualität (Intensität in der Objektmitte) als Schwellenwertparameter und den automatischen Schwellenwert der Software beibehalten, oder ändern Sie diesen Wert geringfügig, um alle Objekte zu erkennen. Sobald die Spot-Erkennung abgeschlossen ist, speichern Sie die Erkennungsparameter und verwenden Sie sie wieder, um andere Bilder zu verarbeiten.
5. Detektion mitochondrialer Netzwerke
   1. Erkennen Sie das mitochondriale Netzwerk, um ein Oberflächen-Rendering zu generieren, indem Sie auf Neue Oberflächen hinzufügen klicken, um ein neues Objekt zu erstellen, und öffnen Sie den Oberflächenerkennungsassistenten.
   2. Wählen Sie den Kanal aus, auf dem die Flächenerstellung durchgeführt werden soll.
   3. Wenden Sie einen Gauß-Filter an, um eine glattere Oberfläche zu erhalten, indem Sie auf das Markierungsfeld " Glätten" klicken und einen Schwellenwert festlegen, der die kleinsten auf der Oberfläche beobachtbaren Details angibt.
   4. Führen Sie eine Hintergrundsubtraktion durch, um die lokalen Kontraste zu verstärken und den Schwellenwertschritt zu unterstützen.
   5. Passen Sie den Schwellenwert an, um das mitochondriale Netzwerk basierend auf der Intensität des Signals zu erkennen. Wenn es schwierig ist, den Schwellenwert richtig einzustellen, wird empfohlen, zum vorherigen Schritt zurückzukehren, um den Grad der Glätte und der Hintergrundsubtraktion anzupassen.
   6. Wenden Sie bei Bedarf einen Filter auf die Oberfläche an, um kleine Rückstände zu entfernen, die sich aus dem Schwellenwert ergeben. Wählen Sie dazu den Filter Anzahl der Voxel im Fenster Oberfläche klassifizieren aus, und spielen Sie mit den oberen und unteren Schwellenwerten, um nur die Objekte von Interesse beizubehalten. Sobald die Oberflächenerstellung abgeschlossen ist, speichern Sie die Erstellungsparameter, und verwenden Sie sie wieder, um andere Bilder zu verarbeiten.
6. Generierung der 3D-Entfernungskarte um die Mitochondrien
   1. Generieren Sie eine Entfernungskarte außerhalb der mitochondrialen Oberfläche, die Sie zuvor wie folgt erstellt haben. Wählen Sie die Mitochondrienoberfläche im Szenenbaumfeld aus. Klicken Sie auf Bildverarbeitung > Oberflächenfunktion > Abstandstransformation. Dadurch wird eine Matlab XTension aufgerufen, die den Benutzer auffordert, auszuwählen, ob die Karte außerhalb oder innerhalb der Objektoberfläche berechnet werden soll.
   2. Wählen Sie Objekt außerhalb der Oberfläche, um den Abstand zwischen den PLA-Flecken und der Oberfläche der Mitochondrien zu messen. Nach der Generierung wird die Entfernungskarte als neuer Kanal im Anzeigeanpassungsfenster angezeigt. In diesem Kanal hat jedes Pixel einen Wert, der dem Abstand zu den nächstgelegenen Mitochondrien entspricht.
7. Extraktion der Entfernungen der Objekte vom nächstgelegenen Mitochondrium
   1. Um die Entfernung von jedem Punkt zum nächstgelegenen Mitochondrium zu messen und die nächstgelegenen Mitochondrien zu identifizieren und zu visualisieren, wählen Sie die zuvor generierten Punkte in der Szenenbaumbox aus.
   2. Wählen Sie in den Statistiken und im detaillierten Protokoll die Option Spezifische Werte aus (um eine Messung für jeden Spot zu erhalten). Wählen Sie Mittenintensität Ch=X (wobei X der Nummer des Entfernungs-Map-Kanals entspricht). Dadurch wird der Wert jedes Punktmittelpunkts gemessen, der seiner Entfernung zum nächstgelegenen Mitochondrium in der Entfernungskarte entspricht.
   3. Exportieren Sie die Daten als .csv-Datei, indem Sie auf das Diskettensymbol unten links im Fenster klicken.
   4. Um eine Subpopulation von Flecken basierend auf ihrer Entfernung zu den Mitochondrien zu extrahieren, wählen Sie die Flecken im Szenenbaum aus und klicken Sie auf die Registerkarte Filter.
   5. Fügen Sie in diesem Fenster einen neuen Filter hinzu, der wiederum auf der Zentrumsintensität Ch=X basiert, und extrahieren Sie die Flecken, die weniger als 380 nm von den Mitochondrien entfernt sind, indem Sie den unteren Schwellenwert auf 0 μm und den oberen Schwellenwert auf 0,380 μm setzen.
      HINWEIS: Der Schwellenwert von 380 nm wurde auf der Grundlage einer PLA-Reaktion geschätzt, die die Assoziation zwischen den primären und sekundären Antikörpern (30 nm) plus die Hälfte der vollen Breite bei halbem Maximum (FWHM) der PLA-Amplifikationssignale (350 nm) umfasst.
   6. Um sich auf die ausgewählten Spots zu konzentrieren und ihnen z. B. eine bestimmte Farbe zu geben, führen Sie einen Duplizierungsschritt durch, indem Sie auf die Schaltfläche "Auswahl auf neue Spots duplizieren " klicken.

Mit Hilfe des oben beschriebenen Protokolls detektierten wir die Interaktionsstellen von zwei ER-verankerten Lipidtransferproteinen, ORP5 und ORP8, und untersuchten ihr Vorkommen an ER-Membran-Subdomänen in Kontakt mit anderen Organellen, insbesondere mit den Mitochondrien. Dazu wurde das mitochondriale Netzwerk in HeLa-Zellen mit einem roten mitochondrialen Marker gefärbt, und ORP5-ORP8 PLA Green Spots wurden nach der Fixierung mit den primären Antikörpern Anti-ORP5 und Anti-ORP8 nachgewiesen, deren Spezifität zuvor durch Immunfluoreszenz^{getestet wurde 15}. Konfokale Bilder zeigten, dass endogene ORP5-ORP8-PLA-Interaktionen in den HeLa-Zellen im retikulären ER, kortikalen ER und in ER-Subdomänen in engem Kontakt mit Mitochondrien auftraten, die allgemein als Mitochondrien-assoziierte ER-Membranen (MAMs; Abbildung 2A). Um die an MAMs auftretenden ORP5-ORP8-PLA-Wechselwirkungen zu quantifizieren, wurde der Abstand jedes PLA-Spots zu den Mitochondrien mittels 3D-Bildanalyse ausgewertet. Unter Verwendung einer Abstandsschwelle von 380 nm ergab die 3D-Bildgebungsanalyse, dass etwa 50 % der endogenen ORP5-ORP8-PLA-Wechselwirkungen an MAMs detektiert wurden (Abbildung 2A,B). Die anderen 50% der Interaktionen verteilten sich auf das kortikale und das retikuläre ER¹⁵. Um die Spezifität des PLA zu validieren, wurden ORP5-ORP8 PLA-Experimente entweder in Zellen durchgeführt, die mit ORP5-Targeting- und ORP8-Targeting-siRNAs behandelt wurden (Negativkontrolle) oder in Zellen, die ORP5 und ORP8 co-exprimieren (Positivkontrolle). Die Herunterregulierung von ORP5 und ORP8 induzierte eine massive Abnahme der Gesamtzahl der PLA-Signale (an MAMs, am retikulären ER und am kortikalen ER; Abbildung 2A,C), während ihre Co-Überexpression zu einem Anstieg von PLA führte (Abbildung 2A,C), was die Spezifität des ORP5-ORP8 PLA bestätigt. Interessanterweise war jedoch der Prozentsatz der ORP5-ORP8-PLA-Interaktionen, die an MAMs in Zellen auftraten, die ORP5 und ORP8 co-überexprimierten, ähnlich wie in Zellen, in denen diese Proteine auf endogenen Ebenen exprimiert wurden (Abbildung 2B), was ihre Existenz als Komplex an MAMs unterstützt. Um das Vorhandensein von ORP5 und ORP8 an ER-Membran-Subdomänen in engem Kontakt mit Mitochondrien weiter zu bestätigen, wurden zusätzliche quantitative PLA-Analysen zwischen ORP5 oder ORP8 und dem äußeren mitochondrialen Membranprotein PTPIP51, einem bekannten Bindungspartner von ORP5 und ORP8¹³, durchgeführt. PLA-Signale wurden sowohl in ORP5-PTPIP51- als auch in ORP8-PTPIP51 Paaren detektiert, und ihre durchschnittliche Anzahl war ähnlich wie beim ORP5-ORP8-PLA-Paar, was die Lokalisierung von ORP5 und ORP8 an ER-Mitochondrien-MCS bestätigt (Abbildung 3).

Schließlich konnten wir in neueren Arbeiten aus unserem Labor durch die Verwendung eines ähnlichen Ansatzes in HeLa-Zellen, die mit PHPLCd-RFP oder mcherry-PLN1 transfiziert wurden, um die PM bzw. LD zu markieren, das Auftreten von ORP5-ORP8-PLA-Wechselwirkungen an ER-PM-Kontakten analysieren und eine Drei-Wege-Kontaktstelle zwischen Mitochondrien, dem ER und LDs identifizieren (Abbildung 4)^{15, 17}. Anmelden

Abbildung 1: Workflow zur Identifizierung von PLA-Signalen in unmittelbarer Nähe zu den Mitochondrien. Zunächst werden die konfokalen Stapel segmentiert, um die PLA-Foci (Flecken) und das mitochondriale Netzwerk (Oberflächen) zu identifizieren. Dann werden 3D-Entfernungskarten zur Außenseite der Oberflächen (Mitochondrien) berechnet, die die Messung der Entfernung jedes Flecks vom nächstgelegenen Mitochondrium ermöglichen. Schließlich werden PLA-Flecken in zwei Populationen (rot und grün) eingeteilt, basierend auf einer Näherungsschwelle von 380 nm, die auf der Grundlage der Präzision des Detektionssystems festgelegt wird. Diese Abbildung wurde von Monteiro-Cardoso et ^al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Bilder des ORP5-ORP8-Komplexes, der in endogenen Konzentrationen exprimiert wird und an ER-Mitochondrien-Kontakten lokalisiert ist. (A) ORP5-ORP8 PLA konfokale Serien und entsprechende 3D-Rekonstitutionen. Maßstabsleisten: 10 μm und 2 μm (erweiterte Bilder). (B) Quantifizierung von ORP5-ORP8-PLA-Foci in engem Kontakt mit Mitochondrien. Endo, n = 33 Zellen, und Overexp ORP5+ORP8, n = 27 Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (Standardfehler des Mittelwerts) dargestellt. Dieses Bild wurde von Monteiro-Cardoso et ^al.15 modifiziert. (C) Quantifizierung der gesamten ORP5-ORP8-PLA-Foci. Endo, n = 38 Zellen, siORP5+siORP8, n = 38 Zellen, und Overexp ORP5+ORP8, n = 35 Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (Standardfehler des Mittelwerts) dargestellt. Dieses Bild wurde von Monteiro-Cardoso et ^al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder von PLA-Signalen zwischen ORP5 oder ORP8 mit dem mitochondrialen Protein PTPIP51. (A) Konfokale Serien wurden verwendet, um 3D-Rekonstitutionen und Distanzkarten zu erstellen, um zu bestätigen, dass ORPR5- oder ORP8-PLA-Wechselwirkungen mit PTPIP51 an ER-Mitochondrien-engen Kontakten auftreten. Maßstabsleisten: 10 μm und 2 μm (erweiterte Bilder). (B) PTPIP51 konfokalen Immunfluoreszenzbildern (einzelne Fokusebene) in Kontroll- und HeLa-Zellen, die mit siRNA-PTPIP51 behandelt wurden. Maßstabsleisten: 10 μm und 2 μm (erweiterte Bilder). (C) ORP5-PTPIP51 und ORP8-PTPIP51 PLA-Bilder in Kontroll- und HeLa-Zellen, die mit siRNA PTPIP51 behandelt wurden. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beispiele für 3D-Rekonstruktionen zur Lokalisierung des ORP5-ORP8-PLA-Komplexes an ER-PM- und ER-Mitochondrien-LD-Kontakten. (A) Konfokales Bild und entsprechende 3D-Rekonstitution einer HeLa-Zelle mit ORP5-ORP8 PLA, dargestellt durch die grünen Flecken, dem mit PHPLCd-RFP markierten PM, dargestellt durch das rote Blutkörperchen, und den mit Mito-BFP markierten Mitochondrien, dargestellt durch blaue Oberflächen. Bild links und Mitte: Darstellung der gesamten HeLa-Zelle. Rechtes Bild: Darstellung eines gezoomten Bereichs innerhalb der Zelle. (B) Konfokales Bild und entsprechende 3D-Rekonstitution einer vergrößerten Region einer HeLa-Zelle mit ORP5-ORP8 PLA, dargestellt durch die grünen Flecken, LDs, markiert mit mCherry-PLN1, dargestellt durch die roten Oberflächen, und Mito-BFP, dargestellt durch die blauen Oberflächen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um interorganelle Protein-PLA-Interaktionen an MCSs, insbesondere an MERCS, zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Neuheit des Protokolls besteht darin, dass es PLA mit der Markierung mehrerer Organellen, konfokaler Mikroskopie und 3D-Bildanalyse kombiniert, um PLA-Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen zu lokalisieren und zu quantifizieren, die sich in derselben Membran befinden, in diesem Fall innerhalb der ER-Membran in unmittelbarer Nähe der Membran der Mitochondrien (MAM) oder gleichzeitig mit den MAM und LDs. Dieses Protokoll kann als Werkzeug zur Validierung von Proteinen verwendet werden, die möglicherweise an bestimmten MERCS, aber auch an anderen MCS lokalisiert sind.

Seit seiner Entwicklung im Jahr 2006 wird PLA zwischen einem ER und einem mitochondrialen Protein häufig zur Quantifizierung von MERCS 7,9,10,11 verwendet. Die Verwendung von PLA als Indikator für die Häufigkeit von MERCS in Zellen muss jedoch sorgfältig durch hochauflösende Ansätze verifiziert werden. Zum Beispiel verändert die Ablation von SAM50, einem mitochondrialen Protein, das die Häufigkeit von MERCS (quantifiziert durch Elektronenmikroskopie)15 nicht beeinflusst, auch nicht die PLA-Wechselwirkungen zwischen dem ER-Protein ORP8 und dem mitochondrialen Protein TOM20, aber sie reduziert die PLA-Wechselwirkungen zwischen ORP8 und dem mitochondrialen Protein Metaxin2, ohne deren Expressionsniveaus zu verringern ¹⁵. Diese Ergebnisse zeigen, dass PLA-Wechselwirkungen spezifisch für das im Assay verwendete Proteinpaar sein können und nicht als einziger Parameter zur Beurteilung der Häufigkeit von MERCS verwendet werden können.

Nichtsdestotrotz ist PLA ein bewährter sensitiver Ansatz, um in situ endogene Proteininteraktionen zu detektieren. Im Gegensatz zu anderen auf Fluoreszenzsonden basierenden Detektionsmethoden, einschließlich Split-GFP und FRET, oder hochauflösenden Bildgebungsansätzen erfordert PLA keine Überexpression markierter Proteine, wodurch inhärente experimentelle Artefakte wie die Veränderung der physikalischen Eigenschaften der Zielorganellen vermieden^{werden 15}. Der Nachweis von Proteininteraktionen mittels PLA bietet auch Vorteile gegenüber anderen Immunnachweismethoden, wie z.B. der Co-Immunpräzipitation mit Western Blot. Während PLA die Quantifizierung einzelner Fluoreszenzflecken auf Einzelzellebene ermöglicht, erfordert die Co-Immunpräzipitation eine hohe Menge an biologischem Material und erlaubt nur die relative Quantifizierung des Proteins, das aus einem Pool heterogener Zellen extrahiert wurde, für die eine geeignete Beladungskontrolle schwer zu erreichen ist¹⁵. Der zusätzliche Vorteil der Verwendung von PLA in Kombination mit Organellenfärbung und konfokaler Mikroskopie gegenüber der Co-Immunpräzipitation besteht darin, dass der erste Ansatz die Lokalisierung von Proteininteraktionen auf subzellulärer Ebene ermöglicht.

Auf der anderen Seite sind die markanten Nachteile dieses Protokolls mit dem PLA-Detektionsbereich von etwa 40 nm verbunden, der größer ist als bei MERCS, und mit der maximalen Auflösung, die durch die konfokale Mikroskopie von etwa 250 nm erreicht wird, was die eindeutige Identifizierung von Kontaktstellen erschwert. Hier wurde jedoch ein Schwellenwert von 380 nm verwendet, um die mit Mitochondrienoberflächen assoziierten PLA-Flecken basierend auf der Größe der PLA-Reaktion zu schätzen, einschließlich der Assoziation der primären und sekundären Antikörper (30 nm) plus der Hälfte der FWHM der PLA-Amplifikationssignale (350 nm). Eine weitere Einschränkung von PLA hängt mit der Tatsache zusammen, dass es nur in fixierten Proben verwendet werden kann und der Erwerb eines eindeutigen, spezifischen und quantifizierbaren PLA-Signals die Verfügbarkeit von Antikörpern erfordert, die hochspezifisch für das interessierende Protein sind¹⁵. Darüber hinaus erfordert die 3D-Bildanalyse zur Entfernungsschätzung eine spezielle Software, die möglicherweise nicht in allen Laboren verfügbar ist.

Insbesondere einige der oben genannten Nachteile können durch den Einsatz kürzlich verfügbarer Technologien behoben werden. So kann beispielsweise die konventionelle konfokale Mikroskopie durch bildgebende Verfahren mit höherer Auflösung wie Airyscan oder strukturierte Lichtmikroskopie (SIM)¹⁷ ersetzt werden, und der Mangel an guten Primärantikörpern für die interessierenden Proteine kann durch die stabile Markierung endogener Proteine mit der CRISPR-Cas9-Technologie überwunden^{werden 18}. Schließlich kann die Qualität und Spezifität der Antikörper und PLA-Signale mit den folgenden Kontrollen überprüft werden: 1) Testen der Primärantikörper durch Immunfluoreszenz und Western Blot in Kontrollzellen und in Zellen, in denen das interessierende Protein erschöpft oder überexprimiert wurde; 2) Durchführung von PLA in Zellen, in denen eines oder beide Proteine von Interesse erschöpft sind; 3) Durchführung von PLA in Zellen, die die interessierenden Proteine co-exprimieren; 4) Durchführung von PLA unter Weglassen beider Antikörper für die interessierenden Proteine; 5) Durchführung von PLA unter Verwendung von nur einem der beiden Antikörper für die Proteine von Interesse; 6) Durchführung von PLA mit Inkubation mit demselben IgG wie die Spezies, aus der die primären Antikörper erzeugt wurden. Um ihre Spezifität zu bewerten, wurden die in diesem Protokoll verwendeten Antikörper mittels Immunfluoreszenz und Western Blot in Kontrollzellen und in Zellen getestet, die mit siRNA behandelt wurden, die auf ORP5 15, ORP8 15 oder PTPIP51 abzielt (Abbildung 3B und Guyard et ^al.17). Darüber hinaus wurde die Anti-ORP5- und Anti-ORP8-Spezifität in Zellen untersucht, die EGFP-markiertes ORP5 oder ORP8 exprimieren, indem der Pearson-Koeffizient zwischen dem Antikörper-Detektionssignal und dem EGFP-Signal¹⁵ ausgewertet wurde. Die Spezifitäten der Anti-ORP5 15, Anti-ORP8¹⁵ und Anti-PTPIP51 Antikörper (Abbildung 1 und Abbildung 3C) wurden in Zellen, in denen diese Proteine erschöpft waren, weiter analysiert, was zu einer Abnahme der PLA-Signale führte. Zu beachten ist, dass die Antikörperkonzentration, die für die Immunfluoreszenzfärbung geeignet ist, in der Regel auch für PLA geeignet ist; Abhängig von den verwendeten Antikörpern können jedoch einige Anpassungen in der Blockierungslösung und/oder an den Antikörperkonzentrationen vorgenommen werden, um die PLA-Färbung zu verbessern. Die ORP5-ORP8- und ORP8-PTPIP51-PLA-Färbung wurde nach Anpassung der Blockierungslösung verbessert. Um eine qualitativ hochwertige Mitochondrien- und PLA-Färbung zu erhalten, ist es wichtig, qualitativ hochwertige konfokale Bilder mit geringen Hintergrundsignalen zu erhalten, die wichtig sind, um die 3D-Modulation zu erleichtern. Zum Beispiel beeinflussen konfokale Bilder mit hoher Hintergrundeinwirkungsschwelle die Genauigkeit der 3D-Modulation des mitochondrialen Netzwerks oder PLA.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier vorgestellte Protokoll die Lokalisierung und Quantifizierung von PLA-Proteininteraktionen an spezifischen MERCS-Subdomänen (Interaktionen zwischen Proteinen, die in cis innerhalb derselben Membran lokalisiert sind, die an MCS beteiligt sind, oder zwischen Proteinen, die in trans lokalisiert sind, innerhalb der nebeneinander liegenden Membranen) ermöglicht, indem multizelluläre Organellenmarkierung verwendet und Abstandskarten in 3D-rekonstruierten konfokalen Bildern erstellt werden. Obwohl die hier beschriebenen Verfahren technisch einfach und im Vergleich zu anderen Methoden zum Nachweis von Proteininteraktionen an MERCs relativ schnell sind, sind die gewonnenen Daten in hohem Maße reproduzierbar. Darüber hinaus ist dieses Protokoll so vielseitig wie die verfügbaren Antikörper für die interessierenden Proteine und die verfügbaren Marker zur Färbung der Organellen. Daher kann es auf eine Vielzahl von Proteinpaaren und mehrere Organellen und MCS angewendet werden.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Diese Arbeit wurde unterstützt von der ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), dem ATIP-Avenir-Programm, der Fondation pour la Recherche Medicale (Nr. 206548) und der Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences).