Visualizzazione e quantificazione delle interazioni proteiche endogene intra-organelli nei siti di contatto ER-mitocondri mediante saggi di legatura di prossimità

La necessità di nuovi approcci per studiare i siti di contatto di membrana (MCS) è cresciuta a causa del crescente interesse per lo studio di queste strutture cellulari e dei loro componenti. Qui, presentiamo un protocollo che integra tecnologie di microscopia precedentemente disponibili per identificare e quantificare i complessi proteici intra-organello e inter-organello che risiedono nelle MCS.

I siti di contatto con la membrana (MCS) sono aree di stretta vicinanza della membrana che consentono e regolano lo scambio dinamico di diverse biomolecole (ad esempio, calcio e lipidi) tra gli organelli giustapposti senza coinvolgere la fusione della membrana. Le MCS sono essenziali per l'omeostasi cellulare e le loro funzioni sono assicurate dai componenti residenti, che spesso esistono come complessi proteici multimerici. Le MCS spesso coinvolgono il reticolo endoplasmatico (ER), un importante sito di sintesi lipidica e di accumulo cellulare di calcio, e sono particolarmente importanti per gli organelli, come i mitocondri, che sono esclusi dalle classiche vie di trasporto vescicolare. Negli ultimi anni, le MCS tra l'ER e i mitocondri sono state ampiamente studiate, poiché le loro funzioni hanno un forte impatto sul metabolismo cellulare/bioenergetica. Diverse proteine hanno iniziato a essere identificate in questi siti di contatto, tra cui i legami di membrana, i canali del calcio e le proteine di trasferimento lipidico, sollevando così la necessità di nuove metodologie e approcci tecnici per studiare questi componenti MCS. Qui, descriviamo un protocollo costituito da approcci tecnici combinati, che includono il saggio di legatura di prossimità (PLA), la colorazione dei mitocondri e la segmentazione dell'imaging 3D, che consente il rilevamento di proteine che sono fisicamente vicine (>40 nm) tra loro e che risiedono sulla stessa membrana a MCS dei mitocondri ER. Ad esempio, abbiamo utilizzato due proteine di trasferimento lipidico ancorate al reticolo endoplasmatico, ORP5 e ORP8, che hanno precedentemente dimostrato di interagire e localizzarsi nei mitocondri del reticolo endoplasmatico e negli MCS della membrana plasmatica del reticolo endoplasmatico. Associando il PLA ORP5-ORP8 con l'analisi del software di imaging cellulare, è stato possibile stimare la distanza del complesso ORP5-ORP8 dalla superficie mitocondriale e determinare che circa il 50% dell'interazione PLA ORP5-ORP8 si verifica nei sottodomini ER in prossimità dei mitocondri.

La comunicazione tra gli organelli è una caratteristica distintiva delle cellule eucariotiche. Un modo in cui gli organelli comunicano è la formazione di siti di contatto di membrana (MCS), che sono strette opposizioni di membrana tra due organelli che sono mantenute da proteine strutturali e funzionali, come i legami, le proteine di trasferimento lipidico e i canali del calcio¹. Le MCS possono essere stabilite tra organelli simili o diversi e mediano lo scambio di componenti cellulari, che è importante per mantenere l'omeostasi cellulare. Ad oggi, sono stati identificati diversi MCS, tra cui il reticolo endoplasmatico (ER)-mitocondri, i contatti ER-membrana plasmatica (PM) e ER-goccioline lipidiche (LD)¹. Tra questi, quelli che si formano tra l'ER e i mitocondri (MERCS) sono tra i più studiati in quanto coinvolti nella regolazione di diverse funzioni cellulari, tra cui l'omeostasi lipidica e del calcio². Poiché i mitocondri sono in gran parte esclusi dalle classiche vie di trasporto vescicolare, si affidano a MERCS e ai loro costituenti molecolari per importare lipidi chiave o precursori lipidici dal reticolo endoplasmatico. Il trasporto non vescicolare di questi lipidi attraverso i MERCS garantisce il mantenimento di una corretta composizione lipidica mitocondriale, nonché la loro integrità funzionale e strutturale³.

Dato il coinvolgimento cruciale delle MCS in varie funzioni cellulari, l'interesse nel fornire una comprensione più profonda dei loro componenti molecolari è notevolmente aumentato negli ultimi anni. Diversi tipi di approcci basati sull'imaging sono stati utilizzati per far progredire le conoscenze sugli MCS. Tra questi, il saggio di legatura di prossimità (PLA) basato su sonda di fluorescenza è stato ampiamente utilizzato come indicatore dell'abbondanza di MCS rilevando le interazioni proteina-proteina inter-organello (in un intervallo di rilevamento di 40 nm) a livelli endogeni⁴. Ad esempio, i MERCS sono stati visualizzati e quantificati utilizzando il PLA tra diverse coppie di proteine mitocondri-ER, tra cui VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 e PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Sebbene questa tecnologia sia stata utilizzata per rilevare e quantificare le interazioni proteina-proteina inter-organello presenti a MCS 5,7,9,10,11^, la maggior parte degli studi non ha combinato il PLA con la colorazione degli organelli. Di conseguenza, non è stato ancora sviluppato un metodo quantitativo che consenta di misurare la prossimità tra le interazioni del PLA e gli organelli associati. Così, finora, nel caso delle proteine ER, la loro interazione all'interno dei sottodomini di membrana a contatto con altri organelli non è stata distinta dalla loro interazione all'interno della rete ER ampiamente distribuita.

Qui, descriviamo un protocollo per rilevare le interazioni del PLA tra proteine che risiedono nella membrana dello stesso organello e per analizzare la loro vicinanza alla membrana dell'organello partner al MCS. Questo protocollo è stato sviluppato sulla base di due premesse: 1) studi precedenti che dimostrano che, in condizioni di sovraespressione, le proteine di trasferimento lipidico ER ORP5 e ORP8 co-localizzano e interagiscono a livello dei mitocondri ER e dei MCS 12,13,14,15 dell'ER-PM e che ORP5 si localizza ai contatti ER-LD^16,17; 2) tecnologie esistenti, tra cui PLA, microscopia confocale, marcatura di organelli e analisi di imaging 3D.

1. Colorazione mitocondriale e saggio di legatura di prossimità (PLA)

1. Piastra 0,5 x 10 5-2 x 10 5 cellule HeLa, mantenute in terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di aminoacidi non essenziali a 37 °C con il 5% di CO₂ , in vetrini coprioggetti da 13 mm in piastre da^1,5 in 24 pozzetti a una diluizione che consente la confluenza cellulare del 75%-90% il giorno della procedura.
   NOTA: Da notare che le cellule HeLa possono essere sottoposte a trattamenti aggiuntivi, come il trattamento con siRNA e/o la trasfezione plasmidica del DNA, prima della colorazione mitocondriale e del PLA.
2. Colorazione mitocondriale
   1. Lavare le cellule una volta in un terreno privo di siero preriscaldato a 37 °C. Incubare le cellule con terreno privo di siero preriscaldato per 10 minuti a 37 °C con il 5% di CO₂ .
   2. Preparare 1 μM di marcatore mitocondriale rosso in terreno privo di siero preriscaldato.
   3. Incubare le cellule con 500 μL di soluzione di marcatori mitocondriali per 30 minuti a 37 °C con il 5% di CO₂ . Durante il trattamento con marcatori mitocondriali e le fasi successive del protocollo, tenere le cellule sui vetrini coprioggetti il più possibile al riparo dalla luce.
   4. Dopo l'incubazione, lavare le cellule 1 volta in terreno privo di siero preriscaldato e 2 volte in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Eseguire questo passaggio il più rapidamente possibile poiché lunghe fasi di lavaggio prima della fissazione possono influenzare la morfologia mitocondriale.
   5. Rimuovere il PBS 1x dai vetrini coprioggetti e fissare le cellule incubandole in PFA al 4% appena preparato (in 1x PBS) per 30 minuti a temperatura ambiente (al buio) sotto la cappa chimica. Lavare 3 volte per 2 minuti in 500 μL di 1x PBS (utilizzando pipette usa e getta o un sistema di aspirazione collegato a una pompa).
   6. Rimuovere il PBS 1x e incubare i vetrini coprioggetti con 500 μL di 50mM NH₄Cl per 15 minuti a temperatura ambiente (al buio). Lavare 1 volta per 2 minuti in 500 μL di 1x PSB utilizzando un sistema sottovuoto.
   7. Lavare 3 volte per 2 minuti in 500 μL di tampone bloccante 1 (BB1, 1%BSA, 0,1% saponina in 1x PBS) per il PLA ORP5-ORP8 o tampone bloccante 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% siero di capra normale, 0,1 saponine in 1x PBS) per il PLA ORP8-PTPIP51.
   8. Trasferire i vetrini coprioggetti dalla piastra a 24 pozzetti in una camera di umidità. Dopo aver trasferito i vetrini coprioggetti nella camera, aggiungere 100 μL di BB (BB1 o BB2, a seconda delle coppie di anticorpi utilizzati) per evitare la secchezza.
      NOTA: Una camera di umidità protetta dalla luce può essere ottenuta facilmente e rapidamente avvolgendo una capsula di Petri (plastica o vetro) in un foglio di alluminio e aggiungendo alcuni pezzi di carta assorbente bagnata alla periferia della capsula di Petri.
3. Saggio di legatura di prossimità (PLA)
   NOTA: Il protocollo PLA segue le istruzioni del produttore con lievi modifiche.
   1. Incubazione di anticorpi primari
      1. Preparare la soluzione di lavoro dell'anticorpo primario. Diluire l'anti-ORP5 di coniglio (1:150) più l'anti-ORP8 di topo (1:200) in BB1, l'anti-ORP8 di topo (1:200) più l'anti-PTPIP51 di coniglio (1:200) in BB2 e l'anti-ORP5 di coniglio (1:150) più l'anti-PTPIP51 di topo (1:200) in BB1. Preparare (almeno) 40 μL di soluzione di anticorpi primari per vetrino coprioggetto (ad esempio, 0,27 μL di anti-ORP5 di coniglio, 0,2 μL di anti-ORP8 di topo, 39,53 μL di BB1).
      2. Rimuovere il movimento centrale dal lavaggio precedente (passaggio 1.2.8) utilizzando un sistema a vuoto e aggiungere 40 μL di soluzione anticorpale primaria ai vetrini coprioggetti. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una camera di umidità al riparo dalla luce.
   2. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte per 5 minuti con 100 μL del BB corrispondente utilizzando il sistema sottovuoto.
   3. Incubazione della sonda PLA
      1. Preparare la soluzione di lavoro delle sonde PLA. Diluire le sonde PLA PLUS di coniglio (1:5) e di topo MINUS (1:5) in BB e mescolare. Per ogni vetrino coprioggetto, preparare (almeno) 40 μL di soluzione per sonda PLA (ad es. 8 μL di sonda PLUS PLA rabbit, 8 μL di sonda MINUS PLA per topo, 24 μL di BB). Lasciare riposare la soluzione della sonda PLA per 20 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso.
      2. Rimuovere il movimento centrale dai vetrini coprioggetti (dal punto 1.3.2) utilizzando un sistema a vuoto e aggiungere 40 μL di soluzione per sonde PLA ai vetrini coprioggetti. Incubare per 1 ora a 37°C in una camera di umidità al riparo dalla luce.
   4. Lavare i vetrini coprioggetti 2 volte per 5 minuti in 100 μL di 1x tampone di lavaggio A a temperatura ambiente.
   5. Legatura
      1. Diluire il tampone di legatura 5x a 1:5 in acqua ultrapura e mescolare. Per ogni vetrino coprioggetto, preparare (almeno) 40 μL di soluzione di legatura (8 μL di tampone di legatura 5x, 31 μL di acqua ultrapura).
      2. Aggiungere la ligasi (1 U/μL, fornita nel kit PLA) al tampone di legatura 1x preparato nella fase precedente a una diluizione di 1:40 e mescolare.
      3. Rimuovere 1x tampone di lavaggio A dai vetrini coprioggetti (dal punto 1.3.4) utilizzando un sistema a vuoto, aggiungere 40 μL di soluzione di ligasi ai vetrini coprioggetti e incubare per 30 minuti a 37 °C in una camera di umidità protetta dalla luce.
   6. Lavare i vetrini coprioggetti 2 volte per 2 minuti in 100 μL di 1x tampone di lavaggio A a temperatura ambiente utilizzando il sistema sottovuoto.
   7. Polimerizzazione
      1. Diluire il tampone di amplificazione 5x 1:5 in acqua ultrapura e mescolare. Per ogni vetrino coprioggetto, preparare (almeno) 40 μL di soluzione di amplificazione (8 μL di tampone di amplificazione 5x, 31,5 μL di acqua ultrapura).
      2. Aggiungere la polimerasi (10 U/μL, fornita nel kit PLA) al tampone di polimerizzazione 1x preparato nella fase precedente a una diluizione di 1:80 e mescolare.
      3. Rimuovere 1x tampone di lavaggio A dai vetrini coprioggetti (dal punto 1.3.6) utilizzando un sistema a vuoto, aggiungere 40 μL di soluzione di polimerasi ai vetrini coprioggetti e incubare per 1 ora e 40 minuti a 37 °C in una camera di umidità protetta dalla luce.
   8. Rimuovere la soluzione di polimerasi dai vetrini coprioggetti e lavare 2 volte per 10 minuti in 100 μL di 1 tampone di lavaggio B a temperatura ambiente in una camera di umidità protetta dalla luce.
   9. Lavare i vetrini coprioggetti 1 volta per 1 minuto in 100 μL di tampone di lavaggio B 0,001x a temperatura ambiente in una camera di umidità protetta dalla luce.
   10. Montare i vetrini coprioggetti su vetrini per microscopia utilizzando un mezzo di montaggio con DAPI (concentrazione compresa tra 1,6-0,4 μg/mL). Sigillare con lo smalto.

2. Acquisizione delle immagini

1. Osservare i risultati del PLA e acquisire immagini utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza con un obiettivo a immersione in olio 63x utilizzando il software in dotazione.
2. Impostare l'eccitazione della fluorescenza utilizzando un diodo laser da 405 nm o un laser a luce bianca e raccogliere le finestre spettrali con PMT GaAsP o rivelatori ibridi. Su ciascun piano focale (che si estende su 300 nm), acquisiscono i segnali di fluorescenza per PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) e mitocondri (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).

3. Elaborazione delle immagini e valutazione delle macchie di PLA associate ai mitocondri

1. Elabora le immagini confocali utilizzando un software per l'analisi delle immagini che genera mappe di distanza tra i componenti cellulari. Seguire i passaggi seguenti per generare ricostituzioni 3D degli spot PLA e della rete mitocondriale e per accedere alla distanza tra di loro utilizzando il software di imaging cellulare (Figura 1).
2. Installazione dell'estensione della mappa delle distanze 3D
   1. Installare sia il pacchetto software per l'analisi delle celle con l'opzione XT che il software MATLAB o solo un runtime del compilatore MATLAB (MRC), che può essere scaricato gratuitamente dal sito web.
   2. Impostare il software di analisi cellulare per avviare MATLAB all'avvio di una XTension come segue: dall'opzione Imaris (Mac OS X) o dal menu Modifica (Windows), selezionare Preferenze, passare al pannello Strumenti personalizzati , quindi impostare il percorso:
      C:\Programmi\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe per Windows o/Applicazioni/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab per Mac OS X.
3. Importare le immagini nel software
   1. Convertire le immagini dello stack confocale in un file . IMS, direttamente tramite la sezione Arena o utilizzando il convertitore di file autonomo che consente la conversione in batch.
   2. Dopo l'importazione, verificare che le immagini rimangano calibrate correttamente. Fare clic su Modifica > Proprietà dell'immagine > Geometria dell'immagine e verificare che la dimensione del voxel corrisponda in X e Y alla dimensione dei pixel prevista per l'immagine effettiva (vedere la calibrazione dell'immagine nel software di acquisizione) e che la dimensione del voxel in Z corrisponda al passo applicato dal microscopio per generare lo Z-stack. Se i valori non sono corretti, modificarli per garantire una corretta stima delle distanze nei passaggi successivi.
   3. Regolare il contrasto dei diversi canali nel menu Regolazione del display facendo clic su Modifica > Mostra regolazione del display. Regola ogni canale in modo indipendente per ottimizzare la visualizzazione di ciascun colore. Questo passaggio non influisce direttamente sui valori dell'immagine, ma è essenziale per impostare soglie precise o rilevare oggetti deboli.
   4. Limita l'analisi a una singola cella ritagliando l'immagine utilizzando le opzioni Modifica > Ritaglia 3D. Per analizzare un'altra cella nello stesso campo visivo, aprite di nuovo la stessa immagine e ritagliatela in modo diverso.
4. Rilevamento spot ORP5-ORP8
   1. Rileva i segnali PLA generati nella posizione dell'interazione ORP5 e ORP8 facendo clic sull'opzione Aggiungi nuovi punti, che crea un nuovo set di oggetti e apre la procedura guidata di rilevamento dei punti.
   2. Selezionare il canale su cui deve essere eseguito il rilevamento spot.
   3. Regolare il diametro XY stimato (l'intervallo deve essere adattato se la dimensione dell'oggetto è diversa) per aiutare l'algoritmo di rilevamento spot a trovare gli oggetti di interesse. Si noti che se il valore scelto è troppo alto, gli oggetti vicini si fonderanno. Se il valore è troppo piccolo, un segnale può essere considerato come più oggetti o possono essere rilevati segnali aberranti.
   4. Fare clic su Sottrazione sfondo per rimuovere lo sfondo dell'immagine prima del rilevamento spot per migliorare il contrasto locale intorno agli oggetti di interesse.
   5. Regolare la soglia di rilevamento del punto mantenendo la qualità (intensità al centro dell'oggetto) come parametro di soglia e la soglia automatica del software, oppure modificare leggermente questo valore per rilevare tutti gli oggetti. Una volta terminato il rilevamento spot, salvare i parametri di rilevamento e riutilizzarli per elaborare altre immagini.
5. Rilevamento della rete mitocondriale
   1. Rilevare la rete mitocondriale per generare un rendering della superficie facendo clic su Aggiungi nuove superfici per creare un nuovo oggetto e aprire la procedura guidata di rilevamento della superficie.
   2. Selezionate il canale su cui deve essere eseguita la creazione della superficie.
   3. Applicare un filtro gaussiano per ottenere una superficie più liscia facendo clic sulla casella di controllo Arrotonda e impostando una soglia che indica i dettagli più piccoli osservabili sulla superficie.
   4. Eseguire una sottrazione di sfondo per migliorare i contrasti locali e per facilitare il passaggio di soglia.
   5. Regolare la soglia per rilevare la rete mitocondriale in base all'intensità del segnale. Se è difficile impostare correttamente la soglia, si consiglia di tornare al passaggio precedente per regolare il grado di uniformità e sottrazione dello sfondo.
   6. Se necessario, applicare un filtro sulla superficie per rimuovere i piccoli residui derivanti dalla soglia. A tale scopo, selezionare il filtro Numero di voxel nella finestra Classifica superficie e giocare con le soglie superiore e inferiore per mantenere solo gli oggetti di interesse. Una volta terminata la creazione della superficie, salvate i parametri di creazione e riutilizzateli per elaborare altre immagini.
6. Generazione della mappa 3D delle distanze intorno ai mitocondri
   1. Generare una mappa di distanza al di fuori della superficie mitocondriale creata in precedenza come segue. Selezionare la superficie dei mitocondri nella casella dell'albero della scena. Fare clic su Elaborazione immagini > Funzione superfici > Trasformazione distanza. Questo chiamerà un Matlab XTension che chiede all'utente di scegliere se la mappa deve essere calcolata all'esterno o all'interno della superficie dell'oggetto.
   2. Selezionare Oggetto superficie esterna per misurare la distanza tra i punti PLA e la superficie dei mitocondri. Una volta generata, la mappa delle distanze viene visualizzata come un nuovo canale nel pannello di regolazione del display. In questo canale, ogni pixel ha un valore corrispondente alla distanza dai mitocondri più vicini.
7. Estrazione delle distanze degli oggetti dal mitocondrio più vicino
   1. Per misurare la distanza da ciascun punto al mitocondrio più vicino e per identificare e visualizzare quelli più vicini, selezionare i punti generati in precedenza nella casella dell'albero della scena.
   2. Nelle statistiche e nel registro dettagliato, selezionare Valori specifici (per ottenere una misurazione per ogni punto). Selezionare Intensità centrale Ch=X (dove X corrisponde al numero del canale della mappa delle distanze). Questo misurerà il valore di ogni centro spot, che corrisponde alla sua distanza dal mitocondrio più vicino, nella mappa delle distanze.
   3. Esportare i dati come file .csv facendo clic sull'icona del disco floppy in basso a sinistra della finestra.
   4. Per estrarre una sottopopolazione di macchie in base alla loro distanza dai mitocondri, selezionare le macchie nell'albero della scena e fare clic sulla scheda Filtri .
   5. In questa finestra, aggiungere un nuovo filtro basato ancora una volta sull'intensità centrale Ch=X ed estrarre i punti a meno di 380 nm di distanza dai mitocondri impostando la soglia inferiore a 0 μm e la soglia superiore a 0,380 μm.
      NOTA: La soglia di 380 nm è stata stimata sulla base di una reazione del PLA che include l'associazione tra gli anticorpi primari e secondari (30 nm) più metà dell'intera larghezza a metà massimo (FWHM) dei segnali di amplificazione del PLA (350 nm).
   6. Per mettere a fuoco i punti selezionati e, ad esempio, assegnare loro un colore distinto, eseguire una fase di duplicazione premendo il pulsante Duplica selezione in nuovi punti .

Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo rilevato i siti di interazione di due proteine di trasferimento lipidico ancorate al reticolo endoplasmatico, ORP5 e ORP8, e valutato la loro presenza nei sottodomini di membrana del reticolo endoplasmatico a contatto con altri organelli, in particolare con i mitocondri. Per questo, la rete mitocondriale nelle cellule HeLa è stata colorata con un marcatore mitocondriale rosso e le macchie verdi del PLA ORP5-ORP8 sono state rilevate dopo la fissazione utilizzando gli anticorpi primari anti-ORP5 e anti-ORP8, la cui specificità è stata precedentemente testata mediante immunofluorescenza¹⁵. Le immagini confocali hanno mostrato che le interazioni endogene ORP5-ORP8 PLA nelle cellule HeLa si sono verificate nel reticolo endoplasmatico, nel reticolo endoplasmatico e nei sottodomini del reticolo endoplasmatico a stretto contatto con i mitocondri, comunemente indicati come membrane ER associate ai mitocondri (MAM; Figura 2A). Al fine di quantificare le interazioni ORP5-ORP8 PLA che si verificano nei MAM, è stata valutata la distanza di ciascun punto PLA dai mitocondri utilizzando l'analisi delle immagini 3D. Utilizzando una soglia di distanza di 380 nm, l'analisi di imaging 3D ha rivelato che circa il 50% delle interazioni endogene ORP5-ORP8 PLA sono state rilevate a livello di MAM (Figura 2A,B). L'altro 50% delle interazioni è stato distribuito tra l'ER¹⁵ corticale e reticolare. Per convalidare la specificità del PLA, sono stati condotti esperimenti sul PLA ORP5-ORP8 in cellule trattate con siRNA mirati a ORP5 e ORP8 (controllo negativo) o in cellule che co-sovraesprimono ORP5 e ORP8 (controllo positivo). La downregulation di ORP5 e ORP8 ha indotto una massiccia diminuzione del numero totale di segnali PLA (a MAM, a livello reticolare e corticale; Figura 2A,C), mentre la loro co-sovraespressione ha determinato un aumento del PLA (Figura 2A,C), confermando la specificità del PLA ORP5-ORP8. Tuttavia, è interessante notare che la percentuale di interazioni ORP5-ORP8 PLA che si verificano a livello di MAM in cellule che co-sovraesprimono ORP5 e ORP8 è simile a quella osservata nelle cellule in cui queste proteine sono espresse a livelli endogeni (Figura 2B), supportando la loro esistenza come complesso a livello di MAM. Per confermare ulteriormente la presenza di ORP5 e ORP8 nei sottodomini di membrana dell'ER a stretto contatto con i mitocondri, sono state effettuate ulteriori analisi quantitative del PLA tra ORP5 o ORP8 e la proteina della membrana mitocondriale esterna PTPIP51, un noto partner di legame di ORP5 e ORP8¹³. I segnali PLA sono stati rilevati sia nelle coppie ORP5-PTPIP51 che ORP8-PTPIP51 e i loro numeri medi erano simili alla coppia PLA ORP5-ORP8, confermando la localizzazione di ORP5 e ORP8 negli MCS ER-mitocondri (Figura 3).

Infine, in recenti lavori del nostro laboratorio, utilizzando un approccio simile in cellule HeLa trasfettate con PHPLCd-RFP o mcherry-PLN1 per marcare rispettivamente il PM o il LD, siamo stati in grado di analizzare l'occorrenza delle interazioni ORP5-ORP8 PLA ai contatti ER-PM e di identificare un sito di contatto a tre vie tra mitocondri, ER e LD (Figura 4)^{15, Ore 17}.

Figura 1: Flusso di lavoro per l'identificazione di segnali PLA in prossimità dei mitocondri. In primo luogo, le pile confocali vengono segmentate per identificare i focolai di PLA (macchie) e la rete mitocondriale (superfici). Quindi, vengono calcolate mappe di distanza 3D verso l'esterno delle superfici (mitocondri), consentendo la misurazione della distanza di ciascun punto dal mitocondrio più vicino. Infine, le macchie di PLA sono classificate in due popolazioni (rossa e verde) in base a una soglia di prossimità di 380 nm stabilita in base alla precisione del sistema di rilevamento. Questa cifra è stata modificata da Monteiro-Cardoso et ^al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative del complesso ORP5-ORP8 espresso a livelli endogeni localizzati a contatto ER-mitocondri. (A) Serie confocali ORP5-ORP8 PLA e rispettive ricostituzioni 3D. Barre della scala: 10 μm e 2 μm (immagini espanse). (B) Quantificazione dei focolai di PLA ORP5-ORP8 a stretto contatto con i mitocondri. Endo, n = 33 cellule, e Overexp ORP5+ORP8, n = 27 cellule. I dati sono presentati come media ± SEM (errore standard della media). Questa immagine è stata modificata da Monteiro-Cardoso et ^al.15. (C) Quantificazione dei focolai totali di PLA ORP5-ORP8. Endo, n = 38 cellule, siORP5+siORP8, n = 38 cellule, e Overexp ORP5+ORP8, n = 35 cellule. I dati sono presentati come media ± SEM (errore standard della media). Questa immagine è stata modificata da Monteiro-Cardoso et ^al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative dei segnali PLA tra ORP5 o ORP8 con la proteina mitocondriale PTPIP51. (A) Le serie confocali sono state utilizzate per generare ricostituzioni 3D e mappe di distanza per confermare che le interazioni del PLA ORPR5 o ORP8 con PTPIP51 si verificano a stretti contatti ER-mitocondri. Barre della scala: 10 μm e 2 μm (immagini espanse). (B) PTPIP51 immagini confocali in immunofluorescenza (piano focale singolo) in cellule di controllo e HeLa trattate con siRNA targeting PTPIP51. Barre della scala: 10 μm e 2 μm (immagini espanse). (C) Immagini confocali ORP5-PTPIP51 e ORP8-PTPIP51 PLA in cellule di controllo e HeLa trattate con PTPIP51 mirati a siRNA. Barra graduata: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempi di ricostruzioni 3D utilizzate per localizzare il complesso PLA ORP5-ORP8 ai contatti ER-PM e ER-mitocondri-LD. (A) Immagine confocale e rispettiva ricostituzione 3D di una cellula HeLa con PLA ORP5-ORP8, rappresentata dalle macchie verdi, il PM marcato con PHPLCd-RFP, rappresentato dal globulo rosso, e i mitocondri marcati con Mito-BFP, rappresentati da superfici blu. Immagini a sinistra e al centro: rappresentazione dell'intera cellula HeLa. Immagine a destra: rappresentazione di una regione ingrandita all'interno della cella. (B) Immagine confocale e rispettiva ricostituzione 3D di una regione ingrandita di una cellula HeLa con PLA ORP5-ORP8, rappresentata dalle macchie verdi, LD marcate con mCherry-PLN1, rappresentate dalle superfici rosse, e Mito-BFP, rappresentate dalle superfici blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo protocollo è stato progettato per identificare e quantificare le interazioni tra le proteine organelle del PLA a livello di MCS, in particolare a livello di MERCS. La novità del protocollo è che combina il PLA con la marcatura di organelli multipli, la microscopia confocale e l'analisi di immagini 3D per localizzare e quantificare le interazioni del PLA tra due proteine che risiedono nella stessa membrana, in questo caso all'interno della membrana ER in stretta prossimità con la membrana dei mitocondri (MAM) o con MAM e LD contemporaneamente. Questo protocollo può essere utilizzato come strumento per convalidare proteine che potenzialmente si localizzano in specifici MERCS ma anche in altri MCS.

Sin dal suo sviluppo nel 2006, il PLA tra un ER e una proteina mitocondriale è stato ampiamente utilizzato per quantificare i MERCS 7,9,10,11. Tuttavia, l'uso del PLA come indicatore dell'abbondanza di MERCS nelle cellule deve essere attentamente verificato con approcci ad alta risoluzione. Ad esempio, l'ablazione di SAM50, una proteina mitocondriale che non influenza l'abbondanza di MERCS (come quantificato al microscopio elettronico)15, non altera le interazioni del PLA tra la proteina ER ORP8 e la proteina mitocondriale TOM20, ma riduce le interazioni del PLA tra ORP8 e la proteina mitocondriale Metaxin2 senza ridurne i livelli di espressione ¹⁵. Questi risultati riflettono che le interazioni del PLA possono essere specifiche per la coppia di proteine utilizzate nel saggio e non possono essere utilizzate come unico parametro per valutare l'abbondanza di MERCS.

Ciononostante, il PLA è un approccio sensibile e collaudato per rilevare le interazioni proteiche endogene in situ . Contrariamente ad altri metodi di rivelazione basati su sonde fluorescenti, tra cui split-GFP e FRET, o approcci di imaging ad alta risoluzione, il PLA non richiede la sovraespressione di proteine marcate, evitando artefatti sperimentali intrinseci, come l'alterazione delle proprietà fisiche degli organelli bersaglio¹⁵. La rilevazione delle interazioni proteiche mediante PLA offre anche vantaggi in relazione ad altri metodi di immunorilevazione, come la co-immunoprecipitazione con western blot. Mentre il PLA consente la quantificazione di singoli punti di fluorescenza a livello di singola cellula, la co-immunoprecipitazione richiede un'elevata quantità di materiale biologico e consente solo la quantificazione relativa della proteina estratta da un pool di cellule eterogenee, per le quali è difficile ottenere un adeguato controllo del carico¹⁵. L'ulteriore vantaggio dell'uso del PLA combinato con la colorazione degli organelli e la microscopia confocale rispetto alla co-immunoprecipitazione è che il primo approccio consente la localizzazione delle interazioni proteiche a livello subcellulare.

D'altra parte, i principali inconvenienti di questo protocollo sono associati al campo di rilevamento del PLA di circa 40 nm, che è più grande dei MERCS, e alla massima risoluzione raggiunta dalla microscopia confocale di circa 250 nm, che rende difficile identificare in modo inequivocabile i siti di contatto. Tuttavia, in questo caso, è stata utilizzata una soglia di 380 nm per stimare le macchie di PLA associate alle superfici dei mitocondri in base alle dimensioni della reazione del PLA, compresa l'associazione degli anticorpi primari e secondari (30 nm) più la metà dell'FWHM dei segnali di amplificazione del PLA (350 nm). Un'altra limitazione del PLA è legata al fatto che può essere utilizzato solo in campioni fissi e l'acquisizione di un segnale PLA distinto, specifico e quantificabile richiede la disponibilità di anticorpi altamente specifici per la proteina di interesse¹⁵. Inoltre, l'analisi delle immagini 3D per la stima della distanza richiede un software specifico che potrebbe non essere prontamente disponibile in tutti i laboratori.

In particolare, alcuni degli svantaggi sopra menzionati possono essere risolti utilizzando tecnologie recentemente disponibili. Ad esempio, la microscopia confocale convenzionale può essere sostituita da tecniche di imaging a un livello di risoluzione più elevato, come Airyscan o la microscopia illuminata strutturata (SIM)¹⁷, e la mancanza di buoni anticorpi primari per le proteine di interesse può essere superata marcando stabilmente le proteine endogene utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9¹⁸. Infine, la qualità e la specificità degli anticorpi e dei segnali del PLA possono essere verificate utilizzando i seguenti controlli: 1) testare gli anticorpi primari mediante immunofluorescenza e western blot nelle cellule di controllo e nelle cellule in cui la proteina di interesse è stata depleta o sovraespressa; 2) esecuzione di PLA in cellule in cui una o entrambe le proteine di interesse sono state esaurite; 3) eseguire il PLA in cellule che co-sovraesprimono le proteine di interesse; 4) eseguire il PLA omettendo entrambi gli anticorpi per le proteine di interesse; 5) eseguire il PLA utilizzando solo uno dei due anticorpi per le proteine di interesse; 6) eseguire PLA con incubazione con le stesse IgG della specie da cui sono stati generati gli anticorpi primari. Per valutare la loro specificità, gli anticorpi utilizzati in questo protocollo sono stati testati mediante immunofluorescenza e western blot in cellule di controllo e in cellule trattate con siRNA mirati a ORP5 15, ORP8¹⁵ o PTPIP51 (Figura 3B e Guyard et al.17). Inoltre, la specificità anti-ORP5 e anti-ORP8 è stata valutata in cellule esprimenti ORP5 o ORP8 marcate con EGFP valutando il coefficiente di Pearson tra il segnale di rilevamento dell'anticorpo e il segnale EGFP¹⁵. Le specificità degli anticorpi anti-ORP5¹⁵, anti-ORP8¹⁵ e anti-PTPIP51 (Figura 1 e Figura 3C) sono state ulteriormente analizzate nelle cellule in cui queste proteine erano esaurite, portando a una diminuzione dei segnali del PLA. Da notare che la concentrazione di anticorpi adatta per la colorazione in immunofluorescenza è solitamente adatta anche per il PLA; tuttavia, a seconda degli anticorpi utilizzati, possono essere apportate alcune modifiche alla soluzione bloccante e/o alle concentrazioni di anticorpi per migliorare la colorazione del PLA. La colorazione del PLA ORP5-ORP8 e ORP8-PTPIP51 è stata migliorata dopo aver regolato la soluzione bloccante. Per ottenere una colorazione mitocondriale e PLA di alta qualità, è essenziale ottenere immagini confocali di alta qualità con bassi segnali di fondo, importanti per facilitare la modulazione 3D. Ad esempio, le immagini confocali con elevate regolazioni della soglia di impatto sullo sfondo e, di conseguenza, influenzano l'accuratezza della modulazione 3D della rete mitocondriale o PLA.

In conclusione, il protocollo qui presentato consente la localizzazione e la quantificazione delle interazioni delle proteine PLA in specifici sottodomini MERCS (interazioni tra proteine localizzate in cis all'interno della stessa membrana impegnata in MCS o tra proteine localizzate in trans all'interno delle membrane giustapposte) utilizzando la marcatura di organelli multicellulari e generando mappe di distanza in immagini confocali ricostruite in 3D. Sebbene le procedure qui descritte siano tecnicamente semplici e relativamente veloci rispetto ad altre metodologie per rilevare le interazioni proteiche nei MERCS, i dati ottenuti sono altamente riproducibili. Inoltre, questo protocollo è tanto versatile quanto gli anticorpi disponibili per le proteine di interesse e come i marcatori disponibili per colorare gli organelli. Pertanto, può essere applicato a un'ampia gamma di coppie di proteine e a diversi organelli e MCS.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dall'ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), dal Programma ATIP-Avenir, dalla Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) e dalla Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences).