Method Article
O protocolo descreve a formação de microcápsulas carregadas de DNA robustas e biocompatíveis como biossensores in vitro multiplexados capazes de rastrear vários ligantes.
Apresentamos um protocolo para a preparação de microcápsulas de fibroína de seda carregadas de DNA através do método de montagem Layer-by-Layer (LbL) em núcleos esféricos sacrificiais. Após a adsorção de uma camada prima e plasmídeos de DNA, a formação de microcápsulas robustas foi facilitada pela indução de folhas de β na estrutura secundária da seda durante a desidratação aguda de uma única camada de seda. Assim, a estratificação ocorreu via ligações múltiplas de hidrogênio e interações hidrofóbicas. Após a adsorção de cascas multicamadas, as estruturas núcleo-casca podem ser funcionalizadas com nanopartículas de ouro (AuNPs) e/ou anticorpos (IgG) para serem usadas para sensoriamento remoto e/ou entrega direcionada. O ajuste de vários parâmetros-chave durante a deposição sequencial de macromoléculas-chave em núcleos de sílica, como a presença de um primer polimérico, a concentração de DNA e proteína da seda, bem como um número de camadas adsorvidas, resultou em microcápsulas biocompatíveis, carregadas de DNA com permeabilidade variável e cargas de DNA. Após a dissolução dos núcleos de sílica, o protocolo demonstrou a formação de microcápsulas ocas e robustas com plasmídeos de DNA imobilizados na superfície interna da membrana da cápsula. A criação de uma membrana biocompatível seletivamente permeável entre os plasmídeos de DNA e o ambiente externo preservou o DNA durante o armazenamento de longo prazo e desempenhou um papel importante na resposta de saída melhorada de plasmídeos espacialmente confinados. A atividade dos modelos de DNA e sua acessibilidade foram testadas durante reações de transcrição e tradução in vitro (sistemas livres de células). Plasmídeos de DNA que codificam aptâmeros e riboswitches de RNA foram ativados com sucesso com analitos correspondentes, como foi visualizado durante a localização de transcritos de RNA marcados fluorescentemente ou proteína GFPa1 nas membranas da casca.
O campo da biologia sintética oferece oportunidades únicas para desenvolver capacidades de sensoriamento, explorando mecanismos naturais desenvolvidos por microrganismos para monitorar seu ambiente e ameaças potenciais. É importante ressaltar que esses mecanismos de sensoriamento estão tipicamente ligados a uma resposta que protege esses microrganismos da exposição nociva, regulando a expressão gênica para mitigar efeitos negativos ou prevenir a ingestão de materiais tóxicos. Tem havido esforços significativos para projetar esses microrganismos para criar sensores de células inteiras, aproveitando essas respostas naturais, mas redirecionando-os para reconhecer novos alvos e/ou produzir um sinal mensurável que possa ser medido para fins de quantificação (tipicamente fluorescência)1,2. Atualmente, a preocupação com o uso de microrganismos geneticamente modificados (OGMs), principalmente quando liberados no ambiente ou no corpo humano, devido ao vazamento de células inteiras ou de parte de seu material genético, mesmo que encapsulado em matriz polimérica, sugere que são necessárias formas alternativas de exploração dessas abordagens desensoriamento3.
Uma abordagem poderosa para explorar os benefícios do sensoriamento baseado em microrganismos sem a preocupação com a implantação de OGMs é o uso de sistemas de transcrição/tradução in vitro (IVTT). Do ponto de vista prático, os sistemas de TIVP consistem em uma mistura contendo a maioria dos componentes celulares em estado ativo que foi "extraída" das células por diferentes meios, incluindo sonicação, batimento de contas ou outros4. O produto final deste processo é uma mistura de reação bioquímica já otimizada para realizar transcrição e tradução que pode ser usada para testar diferentes sensores em formato de "vaso aberto", sem as restrições associadas ao uso de células inteiras (difusão de membrana, eficiência de transformação, toxicidade celular, etc.). É importante ressaltar que diferentes componentes do sensor podem ser adicionados quantitativamente, e seu efeito estudado por diferentes técnicas ópticas e espectrométricas, como demonstramos5. Tem-se notado que o desempenho dos sistemas IVTT pode ser inconsistente; No entanto, estudos recentes têm mostrado abordagens para padronizar sua preparação e caracterização, o que é de grande ajuda quando se estuda seu desempenho no projeto desensores6. Recentemente, muitos exemplos de sistemas de TICV utilizados para criar ensaios baseados em papel através da liofilização de seus componentes em matrizes de papel têm sido demonstrados, incluindo a detecção de íons de metais pesados, drogas, elementos de quorum sensing e outros 7,8,9. Um espaço de aplicação interessante para sensores baseados em IVTT é seu uso em aplicações de sensoriamento em diferentes tipos de ambientes, incluindo solo, água e corpo humano. Para implantar esses sistemas IVTT nesses ambientes desafiadores, uma abordagem de encapsulamento precisa ser implementada para conter os componentes IVTT e protegê-los da degradação.
As abordagens de encapsulação mais comuns para sistemas de TTIV incluem o uso de cápsulas lipídicas, micelas, polissomas e outros microrecipientes bem fechados10,11,12. Uma desvantagem dessa abordagem é a necessidade de incorporar mecanismos passivos ou ativos para transportar materiais dentro e fora dos contêineres para permitir a comunicação com o ambiente externo e fornecer recursos de sensoriamento. Para superar algumas dessas questões, o estudo aqui relata um método que fornece uma abordagem simples, mas eficaz, para encapsular os materiais de codificação para diferentes projetos de sensores a serem expressos em sistemas IVTT. Esta abordagem baseia-se no uso da deposição Layer-by-Layer (LbL) de um biopolímero na presença dos plasmídeos de interesse para criar microcápsulas ocas com alta porosidade, o que permite que o material genético protegido interaja com os diferentes componentes da TIDIV de escolha. O estudo demonstrou que plasmídeos encapsulados podem direcionar a transcrição e a tradução quando ativados dentro dessa matriz polimérica, como mostrado com a resposta de um aptâmero codificado por plasmídio e um riboswitch para seus alvos correspondentes. Além disso, este revestimento LbL protege os plasmídeos por meses sem quaisquer condições especiais de armazenamento.
1. Construção do vetor plasmidial.
2. Purificação do DNA em larga escala.
3. Extração de fibroína de seda e preparação de materiais iniciais.
4. Realizar deposição camada por camada de uma camada primária, plasmídeos de DNA e camadas de seda.
5. Dissolução de núcleos para obtenção de microcápsulas de seda.
6. Imagem de microcápsulas de fibroína da seda usando microscópio confocal de varredura a laser (CLSM).
7. Estimativa da permeabilidade de microcápsulas ocas pelo método de corte de peso molecular (MWCO).
8. Ativação in vitro do riboswitch teofilina sintético em microcápsulas de seda
9. Ativação in vitro de aptâmero de brócolis em microcápsulas de seda
Aqui, o estudo aborda a funcionalidade de modelos de DNA que codificam diferentes designs de sensores (dois tipos de elementos de transcrição/tradução regulados por RNA) após o encapsulamento em cápsulas de proteína de seda. As microcápsulas foram preparadas através da montagem Layer-by-Layer (LbL) dos componentes-chave: uma camada prime, plasmídeos de DNA que codificam desenhos de sensores e biopolímero de fibroína de seda (Figura 2). A deposição de macromoléculas de forma lamelar permite controlar a permeabilidade da membrana da cápsula com base em interações inter e intramoleculares entre as camadas absorvidas e a espessura da casca. A permeabilidade ajustável do sistema ofereceu o potencial de controlar a difusão de moléculas essenciais, limitando a difusão de grandes macromoléculas indesejáveis através da membrana da cápsula20.
Microcápsulas de fibroína de seda homogêneas (4,5 μm) e robustas com espessura de casca de ~500 nm (20 camadas) em estado hidratado podem ser produzidas seguindo adequadamente o protocolo (Figura 3)21. A abordagem LbL permitiu ajustar a capacidade de carga de modelos de DNA com base na concentração inicial dos plasmídeos. A carga ótima de DNA pode ser alcançada variando-se a concentração inicial de modelos de DNA de 50-200 ng/μL. A Tabela 1 representa o número de cópias de DNA retidas em uma única microcápsula após a conclusão do encapsulamento de LbL e foi calculada para cada desenho de sensor com base nas concentrações iniciais de DNA e Mw de plasmídeos de DNA de acordo com a Equação 1. A capacidade ótima de carga de DNA foi alcançada com 32 e 20 cópias de DNA para os projetos dos sensores ThyRS e BrocApt, respectivamente. A avaliação da capacidade de carga foi importante para que se tenha uma estimativa precisa das concentrações de DNA encapsulado para poder titulá-la durante a ativação dos sensores de TTIV pela adição de amostras de cápsulas mais concentradas.
A permeabilidade das cápsulas pode ser analisada sistematicamente seguindo o método MWCO. O método estima o tamanho dos poros da membrana com base no peso molecular das moléculas de soluto que não conseguiram penetrar através da membrana da cápsula. Submetendo as microcápsulas a moléculas variáveis de fluoróforo Mw e realizando imagens confocais no plano focal que corresponde ao maior diâmetro em múltiplas cápsulas, a permeabilidade das membranas da casca pode ser avaliada. A análise ImageJ permite estimar as intensidades de fluorescência dentro e fora das cápsulas e identificar membranas totalmente permeáveis (as intensidades externas e internas dos fluoróforos foram comparáveis), parcialmente permeáveis (50%-70% das cápsulas apresentaram menor fluorescência no interior em relação ao exterior) e não permeáveis (a intensidade do fluoróforo interno foi menor em comparação com a intensidade externa) (Figura 4). A conversão de Mw em raio hidrodinâmico para cada fluoróforo permite estimar o tamanho da malha da membrana da cápsula (Tabela 2).
A permeabilidade seletiva das cápsulas proteicas pode ser obtida durante a otimização sistemática do protocolo de deposição de LbL usando concentrações variáveis de uma camada prima (de 0-6 mg/mL), a concentração de uma fibroína de seda (de 0,5-2 mg/mL) e o número de camadas depositadas (de 10-25) até que a permeabilidade ideal seja alcançada. Nesse protocolo, obteve-se ótima permeabilidade entre 25-32 nm com 6 mg/mL de IPE como camada prima e 20 camadas de 1 mg/mL de fibroína de seda depositadas durante a montagem da LbL (Figura 4). Esta faixa de permeabilidade foi ideal para que os componentes do sistema IVTT percolassem através do invólucro da cápsula. Tipicamente, os maiores complexos moleculares de qualquer sistema IVTT são unidades ribossomais procarióticas, 30S e 50S, que, quando ligadas por mRNA em um complexo ribossomal, podem atingir até ~20 nm de tamanho22. A estrutura das conchas de microcápsulas desenvolvidas se assemelha a uma rede altamente entrelaçada de camadas de fibra de seda que são fisicamente reticuladas por blocos de β produzidos durante a montagem de LbL. Essa estrutura de membrana é semipermeável: altamente permeável a pequenas moléculas (por exemplo, íons, aminoácidos, peptídeos, açúcares, etc.) e restrita a moléculas grandes (por exemplo, proteínas de alto peso molecular, glicoproteínas, células, etc.) que só permite a percolação de moléculas com raio hidrodinâmico inferior a 25 nm. Assim, microcápsulas de fibroína de seda com carga de DNA e permeabilidade de membrana ideais podem ser usadas como carreadores de biorreatores para ativação de ITIV.
A atividade transcricional e translacional dos sensores de projeto ThyRS e BrocApt pode ser testada usando sistemas IVTT disponíveis comercialmente. ThyRS requer ativação translacional do gene repórter na presença de ligante teofilina. A ativação do ThyRS sintético envolve várias etapas para iniciar a expressão gênica, incluindo a síntese de RNAm, a mudança conformacional da sequência de RNAm ao se ligar ao analito, a liberação do sítio de ligação do ribossomo e a síntese da proteína GFPa1 repórter. Todas essas etapas requerem a difusão livre dos componentes do TTIV através da membrana da cápsula. O design proposto de microcápsulas de fibroína de seda carregadas de DNA melhorou os parâmetros de ativação de projetos de sensores regulados por RNA: tanto a cinética de expressão quanto a saída de fluorescência foram significativamente maiores em comparação com o DNA livre não imobilizado (Figura 5A). A imagem CLSM também confirmou a ativação bem-sucedida do gene GFPa1 dentro de cápsulas carregadas com plasmídeos de DNA que codificam sequências ThyRS (Figura 5B-D).
Alternativamente, a ativação do projeto do sensor BrocApt foi realizada no sistema IVTT que suporta transcrição/tradução acoplada ao promotor de E. coli T7 na presença do corante DHFBI-1T. A saída de fluorescência foi iniciada após a ligação do corante fluorogênico à sequência de RNAm. É importante ressaltar que o sinal de saída das microcápsulas de seda foi várias vezes maior em comparação com amostras de DNA não encapsuladas de concentrações equivalentes (Figura 6). Assim, microcápsulas de fibroína de seda podem reter a funcionalidade essencial de elementos sensores codificados por DNA, o que pode ser importante para o projeto de novos tipos de plataformas de biossensores in vitro para detecção rápida e sensível de analitos de interesse.
Figura 1: Mapa do plasmídeo e sequência do pSALv-RS-GFPa1. (A) O plasmídeo contém a sequência de riboswitch teofilina (ThyRS) colocada a montante do gene codificador da GFPa1 sob o controle do promotor do ptac, gene codificador da β-lactamase (bla), responsável pela resistência à ampicilina. (B) A sequência do promotor do ptac é mostrada em negrito e sublinhado; A sequência de riboswitch teofilina é mostrada em itálico negrito; A sequência de codificação GFPa1 é mostrada em negrito; As sequências de locais de restrição são sublinhadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral da preparação de microcápsulas usando a abordagem Layer-by-Layer. Núcleos de SiO2 puros foram primeiramente funcionalizados com polímero PEI, seguidos pela deposição sequencial de plasmídeos de DNA codificando diferentes desenhos de sensores e camadas de fibroína de seda até que o número desejado de camadas de proteína da seda tenha sido adsorvido. Microcápsulas ocas e imaculadas contendo vários desenhos de sensores de DNA podem ser produzidas pela dissolução de núcleos de sacrifício. A ativação de cada desenho de biossensor encapsulado na microcápsula pode ser obtida durante as reações de TTIV na presença de ligantes correspondentes. Esta figura foi reimpressa de Drachuk, I. et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estudos de microscopia para microcápsulas carregadas de DNA. (A) Imagens de microscopia confocal 3D e (B) 3D renderizadas de microcápsulas ocas (SF)20 carregadas com plasmídeos de DNA que codificam ThyRS (32 cópias de DNA/cápsula) e produzidas a partirde 6 mg /mL de núcleos de SiO 2 preparados com PEI. Autofluorescência de cápsulas de fibroína da seda (canal DAPI, azul) e DNA corado (canal FITC, verde) foram aplicadas para identificar a localização dos plasmídeos de DNA e estimar a espessura da membrana da cápsula. Inset in (A) representa perfis de intensidade para DNA e cascas de fibroína de seda ao longo da cápsula. Barra de escala: 2 μm. Inset in (B) representa o perfil de intensidade da proteína da seda em toda a casca da cápsula. A espessura da membrana foi medida como o comprimento no pico de meia intensidade. O processamento das imagens transversais e a renderização 3D foram realizados utilizando o software NIS imaging no sistema Nikon C2+ . Esta figura foi reimpressa de Drachuk, I. et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Estimativa da permeabilidade da membrana para microcápsulas de seda utilizando o método MWCO. Imagens fluorescentes representativas do CLSM seletivas de microcápsulas ocas de fibroína de seda submetidas a soluções de FITC-Dextran de vários Mw (20 μM, diH2O). As cápsulas foram preparadas com diferentes camadas e concentrações de PEI. Um aumento na concentração de uma camada prima leva ao aumento da estabilidade coloidal de microcápsulas com cascas mais permeáveis, enquanto a eliminação da camada prima causa agregação de cápsulas com membranas de casca menos permeáveis. Barra de escala: 5 μm. Esta figura foi reimpressa de Drachuk, I. et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ativação do design do sensor ThyRS em microcápsulas de fibroína de seda. (A) Cinética para expressão de GFPa1 durante a ativação de ThyRS a partir de plasmídeos de DNA carregados em microcápsulas SF de 20 camadas (linhas de cor vermelha) e controle de DNA não encapsulado (linhas de cor azul). De cima para baixo, as concentrações de DNA em um volume de amostra (50 μL) foram 6,5 ng/μL, 4,5 ng/μL, 2,5 ng/μL e 0 ng/μL e correspondem às mudanças nas intensidades de cor. (B) Imagens CLSM de cápsulas de fibroína de seda carregadas com 32 cópias de DNA por cápsula. Barra de escala: 5 μm. (C) A imagem corresponde a perfis de intensidade transversais correspondentes à imagem (B) em duas cápsulas (linha branca em B). A linha vermelha representa cápsulas de seda, e a linha verde representa GFPa1 expressa em cápsulas. (D) A imagem representa cápsulas de seda 3D renderizadas carregadas com 32 cópias de DNA após incubação no sistema IVTT. A fluorescência verde corresponde ao sinal GFPa1 e a fluorescência vermelha corresponde às camadas de seda marcadas fluorescentemente. Barra de escala: 2 μm. A ativação do ThyRS foi realizada com teofilina (2 mM, DMSO) durante a incubação das microcápsulas no sistema IVTT (extrato S30). Esta figura foi reimpressa de Drachuk, I. et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Ativação do BroccApt em microcápsulas de fibroína de seda. A comparação da cinética de transcrição foi realizada para microcápsulas de seda de 20 camadas carregadas com 30 cópias de DNA por cápsula (linhas de cor vermelha) e DNA controle não encapsulado (linhas de cor azul). De cima para baixo, as concentrações de DNA encapsulado em uma amostra foram: 3,6 ng/μL, 2 ng/μL, 1 ng/μL e 0 ng/μL e correspondem às mudanças nas intensidades de cor. As concentrações de DNA não encapsulado foram: 20 ng/μL, 10 ng/μL, 5 ng/μL e 0 ng/μL e correspondem às mudanças nas intensidades de cor. A ativação foi realizada com DHBFI-1T (100 μM, diH2O) durante a incubação no sistema PURE cell-free. Esta figura foi reimpressa de Drachuk, I. et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
DNA Sensor Design | Concentração inicial de DNA (ng/μL) | Número de cópias de DNA por cápsula (DNA/cápsula) |
50 | 16 | |
ThyRS | 100 | 32 |
150 | 48 | |
200 | 64 | |
50 | 10 | |
BrocApt | 100 | 20 |
150 | 30 | |
200 | 40 |
Tabela 1: Número de cópias de DNA por cápsula para cada desenho de DNA. O número de cópias foi calculado de acordo com a Equação 1 e foi correlacionado com a concentração inicial de plasmídeos de DNA, afinidade de retenção de sequências de DNA durante o processo de deposição de LbL e o comprimento dos plasmídeos de DNA.
Mw de FITC-Dextran (kDa) | Raio Hidrodinâmico (nm) |
4 | 1.4 |
20 | 3.3 |
40 | 4.5 |
70 | 6 |
150 | 8.5 |
250 | 10 |
500 | 14 |
2,000 | 18 |
Tabela 2: Propriedades físicas do FITC-dextrans. O raio hidrodinâmico de cada fluoróforo foi utilizado para estimar a permeabilidade das microcápsulas ocas de fibroína de seda.
Microcápsulas de hidrogel seletivamente permeáveis carregadas com vários tipos de projetos de sensores codificados por DNA podem ser preparadas seguindo este protocolo. Uma das características distintivas da abordagem LbL é a capacidade de adaptar a complexidade das microcápsulas durante a montagem de baixo para cima, que geralmente começa com a adsorção de espécies moleculares em moldes de sacrifício. Ajustando cuidadosamente as concentrações dos componentes iniciais, as condições de pH e o número de camadas, microcápsulas com diferentes parâmetros de carregamento de DNA, funcionalidade e permeabilidade ajustável podem ser preparadas23. A fim de amplificar a versatilidade das cápsulas, uma maior funcionalização da superfície da casca com AuNPs e IgG pode ser alcançada para implementar carreadores de sensores biocompatíveis para diagnósticos in vivo . Ambas as rotas alternativas dependem da estrutura molecular única da fibroína da seda. A redução in situ de íons Au3+ pode ser realizada devido à presença de resíduos de tirosina (5,3% mol.) capazes de reduzir íons metálicos na presença de um tampão de redução ótimo. A conjugação de anticorpos específicos à superfície de microcápsulas proteicas funcionalizadas com AuNPs pode ser feita através da implementação da química de ativação da carbodiimida. Ambas as etapas requerem cuidadoso desenvolvimento e otimização do protocolo, a fim de alcançar a funcionalidade adequada das cápsulas de biossensores para futuras aplicações. Por exemplo, para usar essas microcápsulas como sistemas de liberação "inteligentes", nos quais uma carga molecular é liberada sobre estímulos específicos (como pH ou pistas químicas), propriedades específicas dessas cápsulas devem ser caracterizadas e ajustadas, incluindo eficiência de entrega, tempo de retenção, via de administração e tratamentos de modelos de doenças.
As microcápsulas carregadas de DNA foram caracterizadas pela técnica de CLSM e medidas de fluorescência. Entretanto, outros métodos de caracterização, como microscopia de força atômica (AFM), tomografia eletrônica criogênica (CEM) e microscopia de super-resolução de reconstrução estocástica direta (dSTORM), podem ser aplicados para diferenciar estruturas específicas das microcápsulas, incluindo fibras individuais, nanodomínios e localização de plasmídeos de DNA24,25,26.
O protocolo desenvolvido destaca o uso do biopolímero de fibroína da seda como um material de rede biocompatível que preserva a estrutura terciária de plasmídeos de DNA carregados. A estabilidade das sequências de DNA imobilizado dentro da rede de fibroína da seda ocorre via interações hidrofóbicas e/ou ligação de hidrogênio, que fornecem um microambiente protetor contra a inativação, oxidação ou hidrólise do pH27. Além disso, os domínios β-cristalinos da fibroína da seda fornecem uma barreira mecânica única, restringindo o movimento de macromoléculas aprisionadas e impedindo a degradação de plasmídeos de DNA durante o armazenamento em soluções aquosas.
A natureza semipermeável de microcápsulas de fibroína de seda carregadas com moldes de DNA criou condições espaciais e físico-químicas únicas para as reações de ITIV. Aptâmero de RNA ativado transcricional e translacionalmente e riboswitch imobilizado em microcápsulas de fibroína de seda foram capazes de produzir um sinal de saída pelo menos três vezes maior em comparação com sensores livres não imobilizados. Além disso, a imobilização de moldes de DNA em microcápsulas pode aumentar significativamente a atividade de sensores encapsulados além do limite de detecção de sensores não encapsulados. Enquanto os sensores não encapsulados tiveram uma resposta mínima em baixas concentrações de DNA, os sensores encapsulados tiveram uma resposta de saída muito distinta, que pode ser facilmente titulada para refletir as mudanças sutis nas concentrações de DNA. O sinal de resposta melhorado dos repórteres encapsulados foi provavelmente devido à difusão irrestrita dos componentes da maquinaria IVTT e mobilidade reduzida dos plasmídeos de DNA. Vários estudos têm reconhecido que o rendimento da síntese proteica em reações livres de células é dependente do ambientemacromolecular28,29. A imobilização de plasmídeos de DNA em rede de seda proporcionou um ambiente confinado efetivo, restringindo o movimento dos oligonucleotídeos e acelerando as reações do mecanismo de transcrição/tradução, mesmo a partir de várias cópias de DNA21.
Enquanto o método LbL fornece uma abordagem muito versátil para construir conjuntos multifuncionais de maneira controlável, o procedimento de fabricação é relativamente demorado e normalmente requer ajustes de processamento para aumentar o rendimento das microcápsulas. Outra consideração na fabricação de microcápsulas à base de biomoléculas é a compatibilidade de qualquer sistema com a necessidade de dissolução do núcleo após a deposição de LbL ser concluída. Até agora, para produzir microcápsulas ocas carregadas de DNA à base de seda homogêneas e robustas, as conchas foram depositadas em moldes de núcleo de sílica de sacrifício (SiO2), o que exigiu remoção subsequente por condicionamento ácido fluorídrico (HF). O manuseio ou o condicionamento por HF também não são considerados processos biocompatíveis, limitando seu uso generalizado em aplicações práticas. A alternativa aos moldes coloidais inorgânicos de SiO2 , os núcleos de carbonato são tipicamente inertes na formação de complexos com camadas poliméricas e podem ser dissolvidos sob condições brandas usando ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). No entanto, o ajuste de núcleos sacrificiais pode afetar as propriedades de deposição de multicamadas e a integridade da estrutura da casca, o que requer maior otimização do protocolo.
Em resumo, o protocolo atual permite a preparação de microcápsulas carregadas de DNA à base de seda com diferentes desenhos de sensores. A combinação de um microambiente confinado proporcionado pelo método LbL e o uso de fibroína de seda como material biocompatível melhoraram as propriedades sensoriais do DNA encapsulado. Com o rápido desenvolvimento da tecnologia de aptâmeros de RNA fluorogênico, o uso potencial de microcápsulas de seda carregadas de DNA pode ser estendido para diagnósticos in vitro multiplexados . Recentemente, várias variações de aptâmeros fluorescentes baseados em RNA emergiram como uma poderosa tecnologia livre de fundo para obtenção de imagens de RNA em células vivas com alta sensibilidade da relação sinal-ruído30,31. Ao aplicar nanotecnologia de RNA sintético para projetar aptâmeros de RNA artificial, as propriedades fluorogênicas de aptâmeros podem ser aproveitadas para detectar ligantes específicos de interesse. Essa tecnologia será especificamente valiosa para monitorar biomarcadores de interesse em diferentes formatos, incluindo sensores à base de papel no ponto de uso, adesivos à base de hidrogel para suor ou fluido intersticial e materiais implantáveis.
Os pontos de vista e opiniões aqui apresentados são dos autores e não representam necessariamente os pontos de vista do DoD ou de seus Componentes
Este trabalho foi apoiado pela bolsa LRIR 16RH3003J do Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea, bem como pelo programa de Pesquisa Aplicada em Biologia Sintética para Ambientes Militares para o Avanço das Prioridades de C&T (ARAP) do Escritório do Subsecretário de Defesa dos EUA para Pesquisa e Engenharia.
A sequência de vetores plasmidiais para ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) foi generosamente fornecida pelo Dr. J. Gallivan. Casulos de bicho-da-seda de Bombyx mori foram generosamente doados pelo Dr. D.L. Kaplan da Tufts University, MA.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
SiO? silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
Sodium carbonate, Na?CO? | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
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