Preparação de Microcápsulas Multifuncionais à Base de Seda Carregadas com Plasmídeos de DNA Codificadores de RNA Aptamers e Riboswitches

O protocolo descreve a formação de microcápsulas carregadas de DNA robustas e biocompatíveis como biossensores in vitro multiplexados capazes de rastrear vários ligantes.

Apresentamos um protocolo para a preparação de microcápsulas de fibroína de seda carregadas de DNA através do método de montagem Layer-by-Layer (LbL) em núcleos esféricos sacrificiais. Após a adsorção de uma camada prima e plasmídeos de DNA, a formação de microcápsulas robustas foi facilitada pela indução de folhas de β na estrutura secundária da seda durante a desidratação aguda de uma única camada de seda. Assim, a estratificação ocorreu via ligações múltiplas de hidrogênio e interações hidrofóbicas. Após a adsorção de cascas multicamadas, as estruturas núcleo-casca podem ser funcionalizadas com nanopartículas de ouro (AuNPs) e/ou anticorpos (IgG) para serem usadas para sensoriamento remoto e/ou entrega direcionada. O ajuste de vários parâmetros-chave durante a deposição sequencial de macromoléculas-chave em núcleos de sílica, como a presença de um primer polimérico, a concentração de DNA e proteína da seda, bem como um número de camadas adsorvidas, resultou em microcápsulas biocompatíveis, carregadas de DNA com permeabilidade variável e cargas de DNA. Após a dissolução dos núcleos de sílica, o protocolo demonstrou a formação de microcápsulas ocas e robustas com plasmídeos de DNA imobilizados na superfície interna da membrana da cápsula. A criação de uma membrana biocompatível seletivamente permeável entre os plasmídeos de DNA e o ambiente externo preservou o DNA durante o armazenamento de longo prazo e desempenhou um papel importante na resposta de saída melhorada de plasmídeos espacialmente confinados. A atividade dos modelos de DNA e sua acessibilidade foram testadas durante reações de transcrição e tradução in vitro (sistemas livres de células). Plasmídeos de DNA que codificam aptâmeros e riboswitches de RNA foram ativados com sucesso com analitos correspondentes, como foi visualizado durante a localização de transcritos de RNA marcados fluorescentemente ou proteína GFPa1 nas membranas da casca.

O campo da biologia sintética oferece oportunidades únicas para desenvolver capacidades de sensoriamento, explorando mecanismos naturais desenvolvidos por microrganismos para monitorar seu ambiente e ameaças potenciais. É importante ressaltar que esses mecanismos de sensoriamento estão tipicamente ligados a uma resposta que protege esses microrganismos da exposição nociva, regulando a expressão gênica para mitigar efeitos negativos ou prevenir a ingestão de materiais tóxicos. Tem havido esforços significativos para projetar esses microrganismos para criar sensores de células inteiras, aproveitando essas respostas naturais, mas redirecionando-os para reconhecer novos alvos e/ou produzir um sinal mensurável que possa ser medido para fins de quantificação (tipicamente fluorescência)^1,2. Atualmente, a preocupação com o uso de microrganismos geneticamente modificados (OGMs), principalmente quando liberados no ambiente ou no corpo humano, devido ao vazamento de células inteiras ou de parte de seu material genético, mesmo que encapsulado em matriz polimérica, sugere que são necessárias formas alternativas de exploração dessas abordagens de^{sensoriamento3}.

Uma abordagem poderosa para explorar os benefícios do sensoriamento baseado em microrganismos sem a preocupação com a implantação de OGMs é o uso de sistemas de transcrição/tradução in vitro (IVTT). Do ponto de vista prático, os sistemas de TIVP consistem em uma mistura contendo a maioria dos componentes celulares em estado ativo que foi "extraída" das células por diferentes meios, incluindo sonicação, batimento de contas ou outros⁴. O produto final deste processo é uma mistura de reação bioquímica já otimizada para realizar transcrição e tradução que pode ser usada para testar diferentes sensores em formato de "vaso aberto", sem as restrições associadas ao uso de células inteiras (difusão de membrana, eficiência de transformação, toxicidade celular, etc.). É importante ressaltar que diferentes componentes do sensor podem ser adicionados quantitativamente, e seu efeito estudado por diferentes técnicas ópticas e espectrométricas, como demonstramos⁵. Tem-se notado que o desempenho dos sistemas IVTT pode ser inconsistente; No entanto, estudos recentes têm mostrado abordagens para padronizar sua preparação e caracterização, o que é de grande ajuda quando se estuda seu desempenho no projeto de^sensores6. Recentemente, muitos exemplos de sistemas de TICV utilizados para criar ensaios baseados em papel através da liofilização de seus componentes em matrizes de papel têm sido demonstrados, incluindo a detecção de íons de metais pesados, drogas, elementos de quorum sensing e outros ^7,8,9. Um espaço de aplicação interessante para sensores baseados em IVTT é seu uso em aplicações de sensoriamento em diferentes tipos de ambientes, incluindo solo, água e corpo humano. Para implantar esses sistemas IVTT nesses ambientes desafiadores, uma abordagem de encapsulamento precisa ser implementada para conter os componentes IVTT e protegê-los da degradação.

As abordagens de encapsulação mais comuns para sistemas de TTIV incluem o uso de cápsulas lipídicas, micelas, polissomas e outros microrecipientes bem fechados^10,11,12. Uma desvantagem dessa abordagem é a necessidade de incorporar mecanismos passivos ou ativos para transportar materiais dentro e fora dos contêineres para permitir a comunicação com o ambiente externo e fornecer recursos de sensoriamento. Para superar algumas dessas questões, o estudo aqui relata um método que fornece uma abordagem simples, mas eficaz, para encapsular os materiais de codificação para diferentes projetos de sensores a serem expressos em sistemas IVTT. Esta abordagem baseia-se no uso da deposição Layer-by-Layer (LbL) de um biopolímero na presença dos plasmídeos de interesse para criar microcápsulas ocas com alta porosidade, o que permite que o material genético protegido interaja com os diferentes componentes da TIDIV de escolha. O estudo demonstrou que plasmídeos encapsulados podem direcionar a transcrição e a tradução quando ativados dentro dessa matriz polimérica, como mostrado com a resposta de um aptâmero codificado por plasmídio e um riboswitch para seus alvos correspondentes. Além disso, este revestimento LbL protege os plasmídeos por meses sem quaisquer condições especiais de armazenamento.

1. Construção do vetor plasmidial.

1. Construir um vetor plasmidial (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) por amplificação da sequência codificante de um riboswitch teofilina (ThyRS) acoplado com GFPa1 do vetor pJ201:23976-RS-GFPa1 (projetado e criado por DNA2.0) e inserção no vetor de expressão de E. coli , pSAL¹³. Utilizar iniciadores forward (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') e reverse (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') para amplificar a sequência codificadora de ThyRS acoplada à GFPa1 e realizar uma reação de PCR em volume de 50 μL utilizando DNA polimerase de acordo com o protocolo do fabricante¹⁴.
2. Preparar um gel de agarose a 1% a partir de 0,5 g de agarose, 50 ml de tampão TAE (40 mM Tris Acetato, 1 mM EDTA, pH 8,0) e 3 μL de corante de ADN.
3. Misturar alíquota de 5 μL do produto amplificado por PCR com 5 μL de água livre de RNase/DNase e 2 μL de corante de carga de gel 6x e analisar por eletroforese em gel de agarose. Carregue uma escada de DNA (0,1-10,0 kb) como referência. Passe o gel a 120 V até que a linha do corante tenha quase atingido o fundo do gel.
4. Visualize os fragmentos de DNA usando um sistema de imagem por transiluminador UV para verificar o tamanho correto do DNA¹⁵.
5. Purificar o produto de PCR usando um kit de purificação de PCR de acordo com o protocolo do fabricante¹⁶.
6. Digerir o produto da PCR e o vetor de expressão do pSAL com as enzimas de restrição KpnI e BlpI em uma reação de 15 μL, contendo 10 μL do produto da PCR ou vetor plasmidial (concentração 20-50 ng/μL), 1,5 μL de tampão enzimático 10x, 1 μL de cada enzima e 1,5 μL de água livre de RNase/DNase, a 37 °C por 2 h.
7. Adicionar 3 μL de corante de carga de gel 6x à mistura de reação e separar os fragmentos digeridos em um gel de agarose a 1%, conforme descrito nas etapas 1.3-1.5.
8. Purificar os fragmentos de DNA utilizando um kit de extração em gel de acordo com o protocolo do fabricante¹⁶.
9. Ligar o produto da PCR digerida em um vetor plasmidial linearizado digerido, pSAL, usando T4 DNA ligase e tampão ligase suplementado em uma reação de 10 μL contendo 3-20 fmol do vetor digerido, 9-60 fmol do produto da PCR digerido, 2 μL de tampão ligase, 1 μL (1 unidade) de T4 DNA Ligase e água livre de DNase/RNase. Incubar a reação de ligadura a 25 °C durante 3 h.
   NOTA: Certifique-se de que o teor total de ADN na mistura de reacção é de 0,01-0,1 μg.
10. Transformar células competentes de E. coli DH5α com 10 ng da mistura de reação de ligadura de acordo com o protocolo do fabricante¹⁷.
11. Cultivar as células transformadas a 37 °C durante a noite em placas de ágar-LB suplementadas com ampicilina (100 μg/mL).
12. Escolher 3-4 colônias bacterianas da placa e transferir assepticamente cada uma delas para 5 mL de meio LB suplementado com ampicilina (100 μg/mL). Cultivar as culturas durante a noite a 37 °C em uma incubadora de agitação a 225 rpm.
13. Pellet as culturas noturnas por centrifugação a 11 x g por 3 min à temperatura ambiente.
14. Utilizar kit purificador para purificação dos plasmídeos de acordo com o protocolo do fabricante¹⁶.
15. Verificar as sequências dos plasmídeos purificados por sequenciamento de DNA. O mapa do plasmídeo e a sequência do construto resultante (pSALv-RS-GFPa1) são mostrados na Figura 1.

2. Purificação do DNA em larga escala.

1. Transformar o vetor plasmidial pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (codificando riboswitch teofilina acoplado ao gene repórter GFPa1) ou pET28c-F30-2xBrócolis (5,4 kb) (codificando aptâmero de brócolis) em células competentes de E. coli DH5α de acordo com o protocolo do fabricante¹⁷.
2. Cultivar as células transformadas a 37 °C durante a noite em placas de ágar-LB suplementadas com ampicilina (100 μg/mL) para células transformadas com pSALv-RS-GFPa1 ou canamicina (50 μg/mL) para células transformadas com brócolis pET28c-F30-2x.
3. Escolher 3-4 colônias bacterianas da placa e transferir assepticamente cada colônia para 5 mL de meio LB suplementado com antibiótico apropriado (100 μg/mL ampicilina ou 50 μg/mL canamicina). Cultivar as culturas durante a noite a 37 °C em uma incubadora de agitação a 225 rpm.
4. Use 3 mL da cultura noturna para inocular em 150 mL de LB suplementado com antibiótico apropriado (100 μg/mL ampicilina ou 50 μg/mL canamicina) e cultivar as culturas durante a noite a 37 °C em uma incubadora de agitação a 225 rpm.
5. Pellet as células por centrifugação a ≥3400 x g durante 10 min a 4 °C.
6. Utilizar kit purificador para purificação dos plasmídeos de acordo com o protocolo do fabricante¹⁶.
7. Eluir o DNA com 0,5 mL de água pura livre de DNase/RNase. Medir a concentração de ADN e preparar 1 ml de soluções de stock de ADN (100 ng/μL). Conservar os tubos com ADN a 4 °C até nova utilização.

3. Extração de fibroína de seda e preparação de materiais iniciais.

1. Preparar uma solução aquosa de proteína reconstituída de fibroína da seda (SF) a partir de casulos de bicho-da-seda Bombyx mori , de acordo com o procedimento descrito em pormenor noutra parte, para representar 10% da solução de Silk-LiBr¹⁸.
2. Determinar a concentração final da solução aquosa de SF. Pipetar 0,5 ml de solução de seda para uma placa de Petri de 60 mm, deixar secar a 60 °C e medir o peso da película de seda seca. Divida o peso seco por 0,5 mL para calcular a porcentagem de peso por volume.
3. Diluir a solução concentrada de seda com água destilada isenta de DNase/RNase, adicionando lentamente água através de pipeta serológica para obter uma concentração final de 1 mg/ml. Conservar a solução a 4 °C para utilização futura.
4. Prepare fibroína de seda fluorescentemente marcada usando um kit de marcação de anticorpos. Utilizar 1 mL de solução de fibroína de seda 2 mg/mL para acoplar os grupos N-terminal α-amino da proteína com um corante derivado ativado por éster do NHS, de acordo com o protocolo do fabricante¹⁹.
5. Preparar 50 mL de solução aquosa de polietilenoimina (PEI) com uma concentração de 6 mg/mL, ajustar o pH para 4 com HCl (1 M). Filtrar a solução através de uma membrana estéril de 0,2 μm. O armazenamento é possível em condições ambientais por meses.
6. Prepare núcleos SiO₂ . Pipetar 300 μL de partículas de SiO 2 para um tubo de microcentrífuga de₂ mL. Lavar as micropartículas duas vezes com 1 mL de água livre de DNase/RNase por centrifugação a 0,2 x g por 1 min.

4. Realizar deposição camada por camada de uma camada primária, plasmídeos de DNA e camadas de seda.

1. Para depositar a camada prima de PEI sobre as micropartículas de SiO₂ , adicione 1 mL de solução de PEI ao pellet girado a partir da etapa 3.6 e agite a mistura em condições ambientais em um termomisturador a 800 rpm por 15 min. Lavar as partículas quatro vezes com 1 mL de água deionizada livre de DNase/RNase por centrifugação a 0,2 x g por 1 min.
2. Para realizar a deposição da camada de DNA, adicionar 1 mL da solução aquosa de plasmídeos de DNA da etapa 2.7 às micropartículas preparadas com PEI e agitar suavemente a mistura a 4 °C em um termomisturador a 800 rpm por 15 min. Para preparar microcápsulas com diferentes cargas de DNA, ajustar a concentração de plasmídeos de DNA de 50-200 ng/μL usando água destilada livre de DNase/RNase e usar 1 mL dessas soluções para depositar o DNA. Coletar as micropartículas por centrifugação a 0,2 x g por 1 min.
3. Marcar os tubos para plasmídeos de DNA que codificam o riboswitch teofilina acoplado com GFPa1 como ThyRS-GFPa1, e plasmídeos de DNA que codificam o aptâmero de Brócolis como BrocApt.
   NOTA: Mantenha os tubos de microcentrífuga com DNA no gelo.
4. Retirar cuidadosamente o sobrenadante e lavar as micropartículas quatro vezes com 1 mL de água destilada sem DNase/RNase, descartando cada vez o sobrenadante após centrifugação a 0,2 x g por 1 min. Realizar todos os experimentos à temperatura ambiente (TR), a menos que seja especificado de outra forma.
5. Para efectuar a deposição da camada de fibroína da seda, adicionar 1 ml da solução aquosa de SF reconstituída do passo 3.3 às micropartículas adsorvidas no ADN, agitar suavemente a mistura a 10 °C no termomisturador a 750 rpm durante 15 minutos. Recolher as micropartículas por centrifugação a 0,2 x g durante 1 min a 4 °C, remover o sobrenadante e, em seguida, lavá-las uma vez com 1 ml de água destilada sem DNase/RNase. Repita a centrifugação e descarte o sobrenadante.
   NOTA: Durante o experimento, manter a solução de seda sobre gelo para evitar gelificação induzida por temperatura.
6. Tratar gradualmente as partículas com metanol para induzir a formação de folhas de β na estrutura da proteína da seda. Primeiro, adicionar 0,5 mL de água destilada de DNase/RNase, agitar o tubo de microcentrífuga e, em seguida, adicionar 0,5 mL de metanol a 100%. Agite suavemente as partículas no termomisturador a 10 °C durante 5 minutos. Recolher as partículas por centrifugação a 0,2 x g durante 1 min. Remova o sobrenadante.
7. Trate as partículas com metanol para promover a formação de folhas de β e garantir uma forte adsorção física da camada de seda. Adicionar 1 mL de metanol a 100%. Agite suavemente as partículas no termomisturador a 750 rpm durante 10 min a 10 °C.
8. Recolher as partículas por centrifugação a 0,2 x g durante 1 min a 4 °C e lavá-las duas vezes com 1 ml de água destilada sem DNase/RNase de cada vez, descartando o sobrenadante e agitando suavemente antes da próxima centrifugação.
9. Repita as etapas 4.5-4.8 20 vezes para obter estruturas de casca de núcleo multicamadas de seda. Para a última etapa de deposição, use seda fluorescentemente marcada da etapa 3.4 (Silk-DyLight550, 1 mL).
10. Realizar a última etapa de lavagem e manter as micropartículas em 1 mL de água destilada livre de DNase/RNase em condições ambientais.
    NOTA: Para evitar a agregação de partículas durante a deposição de camadas de seda, realizar uma inspeção visual da suspensão de partículas e pipetá-la para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 1 mL para promover uma distribuição homogênea de partículas.
11. Calcular o número de cópias plasmidiais de DNA encapsuladas em cada microcápsula, N_DNA usando a Equação 1:
    (1)
    Onde N = 6,769 × 10¹¹ - o número de núcleos SiO₂ usados para encapsulamento. Calculá-lo a partir de uma curva padrão para concentrações conhecidas de partículas de sílica utilizando diluições seriadas e absorção A 320 a λ =₃₂₀ nm;
    C- concentração inicial de DNA utilizada para adsorção
    V - o volume de DNA utilizado para adsorção
    0.8- Eficiência de adsorção de DNA nos núcleos
    M_w- Peso molecular do plasmídeo de DNA
    N_A- Número de Avogadro (6.022 × 10²³)

5. Dissolução de núcleos para obtenção de microcápsulas de seda.

1. Preparar solução de ácido fluorídrico (HF) a 8%, pH 5,5, diluindo a solução-mãe (48%) com água destilada. Adquira um tubo centrífugo de 50 mL. Pipetar cuidadosamente 5 mL de HF e adicionar 25 mL de água destilada para obter solução de HF a 8%.
   CUIDADO: A HC é um ácido altamente corrosivo e pode causar queimaduras graves nos tecidos. Extremo cuidado deve ser tomado durante o manuseio e uso de IC para os experimentos. Aderir ao Procedimento Operacional Padrão (POP) para o uso e manuseio adequado do HF desenvolvido pela organização para evitar acidentes indesejáveis por derramamento. Não utilize recipientes de vidro para diluir o ácido HF. Use a coifa química para realizar esta etapa do protocolo.
2. Dissolver núcleos de SiO₂ adicionando 1,5 mL de solução HF a 8% a micropartículas peletizadas core-shell a partir da etapa 4.10. Vórtice suavemente e deixe os núcleos dissolverem-se durante a noite em condições ambientais com agitação suave a 450 rpm.
   OBS: Para evitar o derramamento de IC, utilizar fita adesiva para vedação do tubo da microcentrífuga. Use uma capa química para realizar esta etapa do protocolo.
3. Prepare um copo de vidro de 2 L preenchido com 2 L de água deionizada. Transfira a solução de microcápsulas para dispositivos de diálise (50 kDa MWCO) e dialise-as contra água deionizada com troca repetida da água a cada 3 h pelos próximos 3 dias.
   OBS: Recolher o sobrenadante durante as três primeiras trocas de água e descartar a solução de acordo com o protocolo estabelecido para resíduos perigosos.
4. Use uma pipeta de 1 mL para transferir a suspensão dos dispositivos de diálise para novos tubos de microcentrífuga de 2 mL para coletar as microcápsulas.
   NOTA: Conservar as soluções aquosas de microcápsulas em condições ambientais durante vários anos.

6. Imagem de microcápsulas de fibroína da seda usando microscópio confocal de varredura a laser (CLSM).

1. Realizar coloração de DNA usando um corante de DNA.
   1. Transfira 300 μL de microcápsulas ocas de fibroína de seda para um tubo fresco de microcentrífuga de 1 mL. Adicionar 500 μL de água destilada isenta de RNase/DNase.
   2. Adicionar 5 μL do corante corante de DNA, brevemente vórtice e incubar em RT por 2 h protegido da luz.
   3. Executar quatro etapas de lavagem por centrifugação a 0,1 x g durante 20 min a 4 °C de cada vez, removendo cuidadosamente 400 μL do sobrenadante e reabastecendo-o com 400 μL de água destilada sem RNase/DNase.
2. Realizar a obtenção de imagens de cápsulas de seda em sistemas confocais invertidos equipados com três lasers principais (405 nm, 488 nm, 561 nm) usando objetiva de imersão em óleo de 100x (NA 1.49). Transfira 100 μL da amostra da cápsula para um único poço de lâminas de vidro com câmara de 8 poços, permita que as cápsulas sedimentem por 20-30 minutos antes da obtenção de imagens.
   NOTA: Os corantes são muito sensíveis ao fotoclareamento. Proteja as amostras cobrindo as lâminas com papel alumínio.

7. Estimativa da permeabilidade de microcápsulas ocas pelo método de corte de peso molecular (MWCO).

1. Preparar 2 mL de cada solução de fluoróforo de dextran marcada com FITC (20 μM, diH 2 O) de diferentes M_w (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa e₂MDa).
2. Pipetar 100 μL da suspensão das cápsulas para um único poço de uma lâmina de vidro com câmara. Analise cada desenho de microcápsula (concentração de PEI, número de plasmídeos de DNA, concentração de fibroína de seda e número de camadas) separadamente.
3. A cada poço, adicione 300 μL da solução específica de fluoróforo a partir do menor M_w até o mais alto, de modo que cada poço corresponda à solução específica de fluoróforo. Misturar pipetando para cima e para baixo e deixar a mistura incubar por 1 h em TR até que a difusão das soluções de fluoróforo atinja o equilíbrio.
4. Transfira a lâmina para um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) e obtenha imagens de cada poço usando objetiva de imersão em óleo de 100x na excitação λ = 488 nm.
   1. Identifique a área de interesse ajustando o plano focal para garantir que as cápsulas apareçam na forma de círculos de maior diâmetro. Isso normalmente acontece ao visualizar as amostras mais próximas do fundo do poço quando as cápsulas sedimentam devido à gravidade.
   2. Coletar várias imagens de amostras de microcápsulas movendo a lâmina na direção XY. Capture imagens para contabilizar até 100-150 cápsulas para cada amostra.
   3. Use o software ImageJ para analisar a permeabilidade da membrana da cápsula em cada solução de fluoróforo M_w , comparando as intensidades de fluorescência dentro e fora das cápsulas. Para isso, desenhe uma região de interesse (ROI) em forma de círculo para delinear a circunferência da cápsula e clique em Analisar/Medir para medir a intensidade da fluorescência em seu interior. Tabular os dados em uma planilha. Execute esta operação para cada microcápsula para um total de 200-300 cápsulas.
   4. Avalie a intensidade da fluorescência externa da mesma forma, delineando a ROI e medindo a intensidade longe das cápsulas. Realizar 3-5 medições para análise estatística.
   5. Para a análise estatística, comparou-se as intensidades de fluorescência dentro e fora das cápsulas usando o teste t pareado (p < 0,05).
   6. Utilizar a Tabela de conversão 2 para estimar a permeabilidade de microcápsulas com base nos raios hidrodinâmicos para FITC-Dextran com variável M_w.

8. Ativação in vitro do riboswitch teofilina sintético em microcápsulas de seda

1. Preparar 1 mL de solução estoque de teofilina (100 mM, DMSO). Preparar o sistema de extrato de E. coli S30 para DNA circular descongelando os componentes no gelo por 40 min.
2. Obter um tubo de microcentrífuga sem DNase/RNase de 0,5 mL. Realizar reação de transcrição/tradução in vitro , combinar os componentes livres de células com uma amostra de microcápsulas na seguinte ordem (volume total de 50 μL): pré-mistura S30 sem aminoácidos (20 μL); Extrato circular de S30 (15 μL); mistura completa de aminoácidos (5 μL); microcápsulas ocas contendo plasmídeos ThyRS-GFPa1 da etapa 4.10 (9 μL); e teofilina, 100 mM DMSO (1 μL).
   NOTA: Depois de adicionar todos os componentes, agite brevemente o tubo e colete a amostra durante uma breve centrifugação a 0,2 × g por alguns segundos.
3. Incubar o tubo a 30 °C durante 4 h e verificar a fluorescência num leitor de placas utilizando excitação a λ = 488 nm e emissão para o filtro GFP/FITC (510 nm ± 20 nm).
4. Obtenha imagens das cápsulas em qualquer sistema LCSM usando lasers de 488 nm e 561 nm. Obtenha imagens da melhor qualidade usando objetiva de imersão em óleo de 100x e lâminas com câmara de 8 poços.

9. Ativação in vitro de aptâmero de brócolis em microcápsulas de seda

1. Preparar 1 ml de solução-mãe de corante DFHBI-1T (30 μM, diH₂O). Prepare o kit de reação do sistema livre de células PURE (síntese de proteínas usando elementos recombinantes) descongelando os componentes no gelo por 40 min.
2. Obter um tubo de microcentrífuga sem DNase/RNase de 0,5 mL. Realizar reação de transcrição in vitro combinando componentes da reação livre de células com uma amostra de microcápsulas na seguinte ordem (volume total de 50 μL): solução A (20 μL); solução B (15 μL); microcápsulas ocas contendo plasmídeos BrocApt da etapa 4.10 (14 μL); e corante DFHBI-1T (1 μL).
   NOTA: Depois de adicionar todos os componentes, agite brevemente o tubo e colete a amostra durante uma breve centrifugação a 0,2 × g por alguns segundos.
3. Incubar o tubo a 37 °C durante 6 h e verificar a fluorescência num leitor de placas utilizando excitação a λ_ex = 470 nm e emissão a λ_em = 510 nm ± 20 nm.
4. Obtenha imagens das cápsulas em qualquer sistema LCSM usando lasers de 488 nm e 561 nm. Obtenha as imagens de melhor qualidade usando objetiva de imersão em óleo de 100x e lâminas com câmara de vidro de 8 poços.

Aqui, o estudo aborda a funcionalidade de modelos de DNA que codificam diferentes designs de sensores (dois tipos de elementos de transcrição/tradução regulados por RNA) após o encapsulamento em cápsulas de proteína de seda. As microcápsulas foram preparadas através da montagem Layer-by-Layer (LbL) dos componentes-chave: uma camada prime, plasmídeos de DNA que codificam desenhos de sensores e biopolímero de fibroína de seda (Figura 2). A deposição de macromoléculas de forma lamelar permite controlar a permeabilidade da membrana da cápsula com base em interações inter e intramoleculares entre as camadas absorvidas e a espessura da casca. A permeabilidade ajustável do sistema ofereceu o potencial de controlar a difusão de moléculas essenciais, limitando a difusão de grandes macromoléculas indesejáveis através da membrana da cápsula²⁰.

Microcápsulas de fibroína de seda homogêneas (4,5 μm) e robustas com espessura de casca de ~500 nm (20 camadas) em estado hidratado podem ser produzidas seguindo adequadamente o protocolo (Figura 3)²¹. A abordagem LbL permitiu ajustar a capacidade de carga de modelos de DNA com base na concentração inicial dos plasmídeos. A carga ótima de DNA pode ser alcançada variando-se a concentração inicial de modelos de DNA de 50-200 ng/μL. A Tabela 1 representa o número de cópias de DNA retidas em uma única microcápsula após a conclusão do encapsulamento de LbL e foi calculada para cada desenho de sensor com base nas concentrações iniciais de DNA e M_w de plasmídeos de DNA de acordo com a Equação 1. A capacidade ótima de carga de DNA foi alcançada com 32 e 20 cópias de DNA para os projetos dos sensores ThyRS e BrocApt, respectivamente. A avaliação da capacidade de carga foi importante para que se tenha uma estimativa precisa das concentrações de DNA encapsulado para poder titulá-la durante a ativação dos sensores de TTIV pela adição de amostras de cápsulas mais concentradas.

A permeabilidade das cápsulas pode ser analisada sistematicamente seguindo o método MWCO. O método estima o tamanho dos poros da membrana com base no peso molecular das moléculas de soluto que não conseguiram penetrar através da membrana da cápsula. Submetendo as microcápsulas a moléculas variáveis de fluoróforo M_w e realizando imagens confocais no plano focal que corresponde ao maior diâmetro em múltiplas cápsulas, a permeabilidade das membranas da casca pode ser avaliada. A análise ImageJ permite estimar as intensidades de fluorescência dentro e fora das cápsulas e identificar membranas totalmente permeáveis (as intensidades externas e internas dos fluoróforos foram comparáveis), parcialmente permeáveis (50%-70% das cápsulas apresentaram menor fluorescência no interior em relação ao exterior) e não permeáveis (a intensidade do fluoróforo interno foi menor em comparação com a intensidade externa) (Figura 4). A conversão de M_w em raio hidrodinâmico para cada fluoróforo permite estimar o tamanho da malha da membrana da cápsula (Tabela 2).

A permeabilidade seletiva das cápsulas proteicas pode ser obtida durante a otimização sistemática do protocolo de deposição de LbL usando concentrações variáveis de uma camada prima (de 0-6 mg/mL), a concentração de uma fibroína de seda (de 0,5-2 mg/mL) e o número de camadas depositadas (de 10-25) até que a permeabilidade ideal seja alcançada. Nesse protocolo, obteve-se ótima permeabilidade entre 25-32 nm com 6 mg/mL de IPE como camada prima e 20 camadas de 1 mg/mL de fibroína de seda depositadas durante a montagem da LbL (Figura 4). Esta faixa de permeabilidade foi ideal para que os componentes do sistema IVTT percolassem através do invólucro da cápsula. Tipicamente, os maiores complexos moleculares de qualquer sistema IVTT são unidades ribossomais procarióticas, 30S e 50S, que, quando ligadas por mRNA em um complexo ribossomal, podem atingir até ~20 nm de tamanho²². A estrutura das conchas de microcápsulas desenvolvidas se assemelha a uma rede altamente entrelaçada de camadas de fibra de seda que são fisicamente reticuladas por blocos de β produzidos durante a montagem de LbL. Essa estrutura de membrana é semipermeável: altamente permeável a pequenas moléculas (por exemplo, íons, aminoácidos, peptídeos, açúcares, etc.) e restrita a moléculas grandes (por exemplo, proteínas de alto peso molecular, glicoproteínas, células, etc.) que só permite a percolação de moléculas com raio hidrodinâmico inferior a 25 nm. Assim, microcápsulas de fibroína de seda com carga de DNA e permeabilidade de membrana ideais podem ser usadas como carreadores de biorreatores para ativação de ITIV.

A atividade transcricional e translacional dos sensores de projeto ThyRS e BrocApt pode ser testada usando sistemas IVTT disponíveis comercialmente. ThyRS requer ativação translacional do gene repórter na presença de ligante teofilina. A ativação do ThyRS sintético envolve várias etapas para iniciar a expressão gênica, incluindo a síntese de RNAm, a mudança conformacional da sequência de RNAm ao se ligar ao analito, a liberação do sítio de ligação do ribossomo e a síntese da proteína GFPa1 repórter. Todas essas etapas requerem a difusão livre dos componentes do TTIV através da membrana da cápsula. O design proposto de microcápsulas de fibroína de seda carregadas de DNA melhorou os parâmetros de ativação de projetos de sensores regulados por RNA: tanto a cinética de expressão quanto a saída de fluorescência foram significativamente maiores em comparação com o DNA livre não imobilizado (Figura 5A). A imagem CLSM também confirmou a ativação bem-sucedida do gene GFPa1 dentro de cápsulas carregadas com plasmídeos de DNA que codificam sequências ThyRS (Figura 5B-D).

Alternativamente, a ativação do projeto do sensor BrocApt foi realizada no sistema IVTT que suporta transcrição/tradução acoplada ao promotor de E. coli T7 na presença do corante DHFBI-1T. A saída de fluorescência foi iniciada após a ligação do corante fluorogênico à sequência de RNAm. É importante ressaltar que o sinal de saída das microcápsulas de seda foi várias vezes maior em comparação com amostras de DNA não encapsuladas de concentrações equivalentes (Figura 6). Assim, microcápsulas de fibroína de seda podem reter a funcionalidade essencial de elementos sensores codificados por DNA, o que pode ser importante para o projeto de novos tipos de plataformas de biossensores in vitro para detecção rápida e sensível de analitos de interesse.

Figura 1: Mapa do plasmídeo e sequência do pSALv-RS-GFPa1. (A) O plasmídeo contém a sequência de riboswitch teofilina (ThyRS) colocada a montante do gene codificador da GFPa1 sob o controle do promotor do ptac, gene codificador da β-lactamase (bla), responsável pela resistência à ampicilina. (B) A sequência do promotor do ptac é mostrada em negrito e sublinhado; A sequência de riboswitch teofilina é mostrada em itálico negrito; A sequência de codificação GFPa1 é mostrada em negrito; As sequências de locais de restrição são sublinhadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão geral da preparação de microcápsulas usando a abordagem Layer-by-Layer. Núcleos de SiO₂ puros foram primeiramente funcionalizados com polímero PEI, seguidos pela deposição sequencial de plasmídeos de DNA codificando diferentes desenhos de sensores e camadas de fibroína de seda até que o número desejado de camadas de proteína da seda tenha sido adsorvido. Microcápsulas ocas e imaculadas contendo vários desenhos de sensores de DNA podem ser produzidas pela dissolução de núcleos de sacrifício. A ativação de cada desenho de biossensor encapsulado na microcápsula pode ser obtida durante as reações de TTIV na presença de ligantes correspondentes. Esta figura foi reimpressa de Drachuk, I. et ^al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Estudos de microscopia para microcápsulas carregadas de DNA. (A) Imagens de microscopia confocal 3D e (B) 3D renderizadas de microcápsulas ocas (SF)₂₀ carregadas com plasmídeos de DNA que codificam ThyRS (32 cópias de DNA/cápsula) e produzidas a partir_{de 6 mg} /mL de núcleos de SiO 2 preparados com PEI. Autofluorescência de cápsulas de fibroína da seda (canal DAPI, azul) e DNA corado (canal FITC, verde) foram aplicadas para identificar a localização dos plasmídeos de DNA e estimar a espessura da membrana da cápsula. Inset in (A) representa perfis de intensidade para DNA e cascas de fibroína de seda ao longo da cápsula. Barra de escala: 2 μm. Inset in (B) representa o perfil de intensidade da proteína da seda em toda a casca da cápsula. A espessura da membrana foi medida como o comprimento no pico de meia intensidade. O processamento das imagens transversais e a renderização 3D foram realizados utilizando o software NIS imaging no sistema Nikon C2⁺ . Esta figura foi reimpressa de Drachuk, I. et ^al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Estimativa da permeabilidade da membrana para microcápsulas de seda utilizando o método MWCO. Imagens fluorescentes representativas do CLSM seletivas de microcápsulas ocas de fibroína de seda submetidas a soluções de FITC-Dextran de vários M_w (20 μM, diH₂O). As cápsulas foram preparadas com diferentes camadas e concentrações de PEI. Um aumento na concentração de uma camada prima leva ao aumento da estabilidade coloidal de microcápsulas com cascas mais permeáveis, enquanto a eliminação da camada prima causa agregação de cápsulas com membranas de casca menos permeáveis. Barra de escala: 5 μm. Esta figura foi reimpressa de Drachuk, I. et ^al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Ativação do design do sensor ThyRS em microcápsulas de fibroína de seda. (A) Cinética para expressão de GFPa1 durante a ativação de ThyRS a partir de plasmídeos de DNA carregados em microcápsulas SF de 20 camadas (linhas de cor vermelha) e controle de DNA não encapsulado (linhas de cor azul). De cima para baixo, as concentrações de DNA em um volume de amostra (50 μL) foram 6,5 ng/μL, 4,5 ng/μL, 2,5 ng/μL e 0 ng/μL e correspondem às mudanças nas intensidades de cor. (B) Imagens CLSM de cápsulas de fibroína de seda carregadas com 32 cópias de DNA por cápsula. Barra de escala: 5 μm. (C) A imagem corresponde a perfis de intensidade transversais correspondentes à imagem (B) em duas cápsulas (linha branca em B). A linha vermelha representa cápsulas de seda, e a linha verde representa GFPa1 expressa em cápsulas. (D) A imagem representa cápsulas de seda 3D renderizadas carregadas com 32 cópias de DNA após incubação no sistema IVTT. A fluorescência verde corresponde ao sinal GFPa1 e a fluorescência vermelha corresponde às camadas de seda marcadas fluorescentemente. Barra de escala: 2 μm. A ativação do ThyRS foi realizada com teofilina (2 mM, DMSO) durante a incubação das microcápsulas no sistema IVTT (extrato S30). Esta figura foi reimpressa de Drachuk, I. et ^al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Ativação do BroccApt em microcápsulas de fibroína de seda. A comparação da cinética de transcrição foi realizada para microcápsulas de seda de 20 camadas carregadas com 30 cópias de DNA por cápsula (linhas de cor vermelha) e DNA controle não encapsulado (linhas de cor azul). De cima para baixo, as concentrações de DNA encapsulado em uma amostra foram: 3,6 ng/μL, 2 ng/μL, 1 ng/μL e 0 ng/μL e correspondem às mudanças nas intensidades de cor. As concentrações de DNA não encapsulado foram: 20 ng/μL, 10 ng/μL, 5 ng/μL e 0 ng/μL e correspondem às mudanças nas intensidades de cor. A ativação foi realizada com DHBFI-1T (100 μM, diH₂O) durante a incubação no sistema PURE cell-free. Esta figura foi reimpressa de Drachuk, I. et ^al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Número de cópias de DNA por cápsula para cada desenho de DNA. O número de cópias foi calculado de acordo com a Equação 1 e foi correlacionado com a concentração inicial de plasmídeos de DNA, afinidade de retenção de sequências de DNA durante o processo de deposição de LbL e o comprimento dos plasmídeos de DNA.

Tabela 2: Propriedades físicas do FITC-dextrans. O raio hidrodinâmico de cada fluoróforo foi utilizado para estimar a permeabilidade das microcápsulas ocas de fibroína de seda.

Microcápsulas de hidrogel seletivamente permeáveis carregadas com vários tipos de projetos de sensores codificados por DNA podem ser preparadas seguindo este protocolo. Uma das características distintivas da abordagem LbL é a capacidade de adaptar a complexidade das microcápsulas durante a montagem de baixo para cima, que geralmente começa com a adsorção de espécies moleculares em moldes de sacrifício. Ajustando cuidadosamente as concentrações dos componentes iniciais, as condições de pH e o número de camadas, microcápsulas com diferentes parâmetros de carregamento de DNA, funcionalidade e permeabilidade ajustável podem ser preparadas²³. A fim de amplificar a versatilidade das cápsulas, uma maior funcionalização da superfície da casca com AuNPs e IgG pode ser alcançada para implementar carreadores de sensores biocompatíveis para diagnósticos in vivo . Ambas as rotas alternativas dependem da estrutura molecular única da fibroína da seda. A redução in situ de íons Au³⁺ pode ser realizada devido à presença de resíduos de tirosina (5,3% mol.) capazes de reduzir íons metálicos na presença de um tampão de redução ótimo. A conjugação de anticorpos específicos à superfície de microcápsulas proteicas funcionalizadas com AuNPs pode ser feita através da implementação da química de ativação da carbodiimida. Ambas as etapas requerem cuidadoso desenvolvimento e otimização do protocolo, a fim de alcançar a funcionalidade adequada das cápsulas de biossensores para futuras aplicações. Por exemplo, para usar essas microcápsulas como sistemas de liberação "inteligentes", nos quais uma carga molecular é liberada sobre estímulos específicos (como pH ou pistas químicas), propriedades específicas dessas cápsulas devem ser caracterizadas e ajustadas, incluindo eficiência de entrega, tempo de retenção, via de administração e tratamentos de modelos de doenças.

As microcápsulas carregadas de DNA foram caracterizadas pela técnica de CLSM e medidas de fluorescência. Entretanto, outros métodos de caracterização, como microscopia de força atômica (AFM), tomografia eletrônica criogênica (CEM) e microscopia de super-resolução de reconstrução estocástica direta (dSTORM), podem ser aplicados para diferenciar estruturas específicas das microcápsulas, incluindo fibras individuais, nanodomínios e localização de plasmídeos de DNA24,25,26.

O protocolo desenvolvido destaca o uso do biopolímero de fibroína da seda como um material de rede biocompatível que preserva a estrutura terciária de plasmídeos de DNA carregados. A estabilidade das sequências de DNA imobilizado dentro da rede de fibroína da seda ocorre via interações hidrofóbicas e/ou ligação de hidrogênio, que fornecem um microambiente protetor contra a inativação, oxidação ou hidrólise do pH²⁷. Além disso, os domínios β-cristalinos da fibroína da seda fornecem uma barreira mecânica única, restringindo o movimento de macromoléculas aprisionadas e impedindo a degradação de plasmídeos de DNA durante o armazenamento em soluções aquosas.

A natureza semipermeável de microcápsulas de fibroína de seda carregadas com moldes de DNA criou condições espaciais e físico-químicas únicas para as reações de ITIV. Aptâmero de RNA ativado transcricional e translacionalmente e riboswitch imobilizado em microcápsulas de fibroína de seda foram capazes de produzir um sinal de saída pelo menos três vezes maior em comparação com sensores livres não imobilizados. Além disso, a imobilização de moldes de DNA em microcápsulas pode aumentar significativamente a atividade de sensores encapsulados além do limite de detecção de sensores não encapsulados. Enquanto os sensores não encapsulados tiveram uma resposta mínima em baixas concentrações de DNA, os sensores encapsulados tiveram uma resposta de saída muito distinta, que pode ser facilmente titulada para refletir as mudanças sutis nas concentrações de DNA. O sinal de resposta melhorado dos repórteres encapsulados foi provavelmente devido à difusão irrestrita dos componentes da maquinaria IVTT e mobilidade reduzida dos plasmídeos de DNA. Vários estudos têm reconhecido que o rendimento da síntese proteica em reações livres de células é dependente do ambiente^{macromolecular28,29}. A imobilização de plasmídeos de DNA em rede de seda proporcionou um ambiente confinado efetivo, restringindo o movimento dos oligonucleotídeos e acelerando as reações do mecanismo de transcrição/tradução, mesmo a partir de várias cópias de DNA²¹.

Enquanto o método LbL fornece uma abordagem muito versátil para construir conjuntos multifuncionais de maneira controlável, o procedimento de fabricação é relativamente demorado e normalmente requer ajustes de processamento para aumentar o rendimento das microcápsulas. Outra consideração na fabricação de microcápsulas à base de biomoléculas é a compatibilidade de qualquer sistema com a necessidade de dissolução do núcleo após a deposição de LbL ser concluída. Até agora, para produzir microcápsulas ocas carregadas de DNA à base de seda homogêneas e robustas, as conchas foram depositadas em moldes de núcleo de sílica de sacrifício (SiO₂), o que exigiu remoção subsequente por condicionamento ácido fluorídrico (HF). O manuseio ou o condicionamento por HF também não são considerados processos biocompatíveis, limitando seu uso generalizado em aplicações práticas. A alternativa aos moldes coloidais inorgânicos de SiO₂ , os núcleos de carbonato são tipicamente inertes na formação de complexos com camadas poliméricas e podem ser dissolvidos sob condições brandas usando ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). No entanto, o ajuste de núcleos sacrificiais pode afetar as propriedades de deposição de multicamadas e a integridade da estrutura da casca, o que requer maior otimização do protocolo.

Em resumo, o protocolo atual permite a preparação de microcápsulas carregadas de DNA à base de seda com diferentes desenhos de sensores. A combinação de um microambiente confinado proporcionado pelo método LbL e o uso de fibroína de seda como material biocompatível melhoraram as propriedades sensoriais do DNA encapsulado. Com o rápido desenvolvimento da tecnologia de aptâmeros de RNA fluorogênico, o uso potencial de microcápsulas de seda carregadas de DNA pode ser estendido para diagnósticos in vitro multiplexados . Recentemente, várias variações de aptâmeros fluorescentes baseados em RNA emergiram como uma poderosa tecnologia livre de fundo para obtenção de imagens de RNA em células vivas com alta sensibilidade da relação sinal-ruído^30,31. Ao aplicar nanotecnologia de RNA sintético para projetar aptâmeros de RNA artificial, as propriedades fluorogênicas de aptâmeros podem ser aproveitadas para detectar ligantes específicos de interesse. Essa tecnologia será especificamente valiosa para monitorar biomarcadores de interesse em diferentes formatos, incluindo sensores à base de papel no ponto de uso, adesivos à base de hidrogel para suor ou fluido intersticial e materiais implantáveis.

Os pontos de vista e opiniões aqui apresentados são dos autores e não representam necessariamente os pontos de vista do DoD ou de seus Componentes

Este trabalho foi apoiado pela bolsa LRIR 16RH3003J do Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea, bem como pelo programa de Pesquisa Aplicada em Biologia Sintética para Ambientes Militares para o Avanço das Prioridades de C&T (ARAP) do Escritório do Subsecretário de Defesa dos EUA para Pesquisa e Engenharia.

A sequência de vetores plasmidiais para ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) foi generosamente fornecida pelo Dr. J. Gallivan. Casulos de bicho-da-seda de Bombyx mori foram generosamente doados pelo Dr. D.L. Kaplan da Tufts University, MA.