Method Article
يصف البروتوكول تكوين كبسولات دقيقة قوية ومتوافقة حيويا محملة بالحمض النووي على أنها أجهزة استشعار حيوية متعددة الإرسال في المختبر قادرة على تتبع العديد من الروابط.
نقدم بروتوكولا لإعداد كبسولات فيبروين الحريرية المحملة بالحمض النووي عبر طريقة التجميع طبقة تلو الأخرى (LbL) على النوى الكروية القربانية. بعد امتصاص الطبقة الأولية وبلازميدات الحمض النووي ، تم تسهيل تكوين كبسولات دقيقة قوية عن طريق تحفيز صفائح β في بنية ثانوية من الحرير أثناء الجفاف الحاد لطبقة حرير واحدة. ومن ثم ، حدثت الطبقات عن طريق روابط هيدروجينية متعددة وتفاعلات كارهة للماء. عند امتزاز الأصداف متعددة الطبقات ، يمكن زيادة تشغيل هياكل القشرة الأساسية باستخدام جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) و / أو الأجسام المضادة (IgG) لاستخدامها في الاستشعار عن بعد و / أو التسليم المستهدف. أدى ضبط العديد من المعلمات الرئيسية أثناء الترسيب المتسلسل للجزيئات الرئيسية على نوى السيليكا مثل وجود برايمر بوليمر ، وتركيز الحمض النووي وبروتين الحرير ، بالإضافة إلى عدد من الطبقات الممتصة إلى كبسولات دقيقة متوافقة حيويا ومحملة بالحمض النووي مع نفاذية متغيرة وتحميل الحمض النووي. عند انحلال نوى السيليكا ، أظهر البروتوكول تكوين كبسولات دقيقة مجوفة وقوية مع بلازميدات الحمض النووي يجمد على السطح الداخلي لغشاء الكبسولة. أدى إنشاء غشاء متوافق حيويا قابل للنفاذ بشكل انتقائي بين بلازميدات الحمض النووي والبيئة الخارجية إلى الحفاظ على الحمض النووي أثناء التخزين طويل الأجل ولعب دورا مهما في تحسين استجابة الإخراج من البلازميدات المحصورة مكانيا. تم اختبار نشاط قوالب الحمض النووي وإمكانية الوصول إليها أثناء تفاعلات النسخ والترجمة في المختبر (الأنظمة الخالية من الخلايا). تم تنشيط بلازميدات الحمض النووي التي تشفر أبتامير إضاءة الحمض النووي الريبي ومفاتيح الريبوسويتشات بنجاح مع التحليلات المقابلة ، كما تم تصوره أثناء توطين نسخ الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت أو بروتين GFPa1 في أغشية القشرة.
يوفر مجال البيولوجيا التركيبية فرصا فريدة لتطوير قدرات الاستشعار من خلال استغلال الآليات الطبيعية التي تطورها الكائنات الحية الدقيقة لرصد بيئتها والتهديدات المحتملة. الأهم من ذلك ، ترتبط آليات الاستشعار هذه عادة باستجابة تحمي هذه الكائنات الحية الدقيقة من التعرض الضار ، وتنظم التعبير الجيني للتخفيف من الآثار السلبية أو منع تناول المواد السامة. كانت هناك جهود كبيرة لهندسة هذه الكائنات الحية الدقيقة لإنشاء أجهزة استشعار خلية كاملة تستفيد من هذه الاستجابات الطبيعية ولكن إعادة توجيهها للتعرف على أهداف جديدة و / أو لإنتاج إشارة قابلة للقياس يمكن قياسها لأغراض القياس الكمي (عادة مضان)1,2. في الوقت الحالي ، تشير المخاوف المتعلقة باستخدام الكائنات الحية الدقيقة المعدلة وراثيا (GMOs) ، خاصة عند إطلاقها في البيئة أو جسم الإنسان ، بسبب تسرب خلايا كاملة أو بعض موادها الوراثية ، حتى لو كانت مغلفة في مصفوفة بوليمر ، إلى أن هناك حاجة إلى طرق بديلة لاستغلال أساليب الاستشعار هذه3.
نهج قوي لاستغلال فوائد الاستشعار القائم على الكائنات الحية الدقيقة دون القلق بشأن نشر الكائنات المعدلة وراثيا هو استخدام أنظمة النسخ / الترجمة في المختبر (IVTT). من منظور عملي ، تتكون أنظمة IVTT من خليط يحتوي على معظم مكونات الخلية في حالة نشطة تم "استخراجها" من الخلايا بوسائل مختلفة ، بما في ذلك صوتنة ، ضرب حبة ، أو غيرها4. المنتج النهائي لهذه العملية هو خليط تفاعل كيميائي حيوي تم تحسينه بالفعل لإجراء النسخ والترجمة التي يمكن استخدامها لاختبار أجهزة استشعار مختلفة بتنسيق "وعاء مفتوح" ، دون القيود المرتبطة باستخدام خلايا كاملة (انتشار الغشاء ، كفاءة التحويل ، سمية الخلية ، إلخ). الأهم من ذلك ، يمكن إضافة مكونات استشعار مختلفة كميا ، ودراسة تأثيرها بواسطة تقنيات بصرية ومطيفية مختلفة ، كما أوضحنا5. وقد لوحظ أن أداء أنظمة IVTT يمكن أن يكون غير متسق. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة مناهج لتوحيد إعدادها وتوصيفها ، وهو أمر مفيد للغاية عند دراسة أدائها في تصميم أجهزة الاستشعار6. في الآونة الأخيرة ، تم عرض العديد من الأمثلة على أنظمة IVTT المستخدمة لإنشاء مقايسات ورقية من خلال التجفيد لمكوناتها في مصفوفات الورق ، بما في ذلك الكشف عن أيونات المعادن الثقيلة والأدوية وعناصر استشعار النصاب وغيرها7،8،9. مساحة تطبيق مثيرة لأجهزة الاستشعار المستندة إلى IVTT هي استخدامها في تطبيقات الاستشعار في أنواع مختلفة من البيئات ، بما في ذلك التربة والمياه وجسم الإنسان. من أجل نشر أنظمة IVTT هذه في هذه البيئات الصعبة ، يجب تنفيذ نهج تغليف لاحتواء مكونات IVTT وحمايتها من التدهور.
تشمل طرق التغليف الأكثر شيوعا لأنظمة IVTT استخدام كبسولات الدهون والمذيلات والبوليميرات وغيرها من الحاويات الدقيقة المغلقةبإحكام 10،11،12. ويتمثل أحد عيوب هذا النهج في الحاجة إلى إدماج آليات سلبية أو إيجابية لنقل المواد داخل الحاويات وخارجها للسماح بالاتصال بالبيئة الخارجية وتوفير قدرات الاستشعار. للتغلب على بعض هذه المشكلات ، تشير الدراسة هنا إلى طريقة توفر نهجا بسيطا ولكنه فعال لتغليف مواد التشفير لتصميمات أجهزة الاستشعار المختلفة التي سيتم التعبير عنها في أنظمة IVTT. يعتمد هذا النهج على استخدام ترسب طبقة تلو الأخرى (LbL) للبوليمر الحيوي في وجود البلازميدات ذات الأهمية لإنشاء كبسولات دقيقة مجوفة ذات مسامية عالية ، مما يسمح للمادة الوراثية المحمية بالتفاعل مع المكونات المختلفة ل IVTT المختار. أظهرت الدراسة أن البلازميدات المغلفة يمكن أن توجه النسخ والترجمة عند تنشيطها داخل هذه المصفوفة البوليمرية ، كما هو موضح مع استجابة الأبتامير المشفر بالبلازميد والريبوسويتش إلى أهدافهما المقابلة. بالإضافة إلى ذلك ، يحمي طلاء LbL هذا البلازميدات لعدة أشهر دون أي ظروف تخزين خاصة.
1. بناء ناقلات البلازميد.
2. تنقية الحمض النووي على نطاق واسع.
3. استخراج الحرير فيبروين وإعداد المواد الأولية.
4. قم بإجراء ترسب طبقة تلو الأخرى للطبقة الأولية وبلازميدات الحمض النووي وطبقات الحرير.
5. حل النوى للحصول على كبسولات الحرير الدقيقة.
6. تصوير كبسولات فيبروين الحرير الدقيقة باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM).
7. تقدير نفاذية الكبسولات الدقيقة المجوفة بطريقة قطع الوزن الجزيئي (MWCO).
8. في المختبر تفعيل ريبوسويتش الثيوفيلين الاصطناعية في كبسولات الحرير الدقيقة
9. في المختبر تفعيل البروكلي أبتامير في كبسولات الحرير الدقيقة
هنا ، تتناول الدراسة وظائف قوالب الحمض النووي التي تشفر تصميمات أجهزة استشعار مختلفة (نوعان من عناصر النسخ / الترجمة التي ينظمها الحمض النووي الريبي) بعد التغليف في كبسولات بروتين الحرير. تم تحضير الكبسولات الدقيقة من خلال تجميع نموذجي طبقة تلو الأخرى (LbL) للمكونات الرئيسية: طبقة أولية ، وتصميمات مستشعر تشفير بلازميدات الحمض النووي ، والبوليمر الحيوي للفيبروين الحريري (الشكل 2). يسمح ترسب الجزيئات الكبيرة بطريقة الطبقات بالتحكم في نفاذية غشاء الكبسولة بناء على التفاعلات بين الجزيئات وداخلها بين الطبقات الممتصة وسمك القشرة. أتاحت نفاذية النظام القابلة للضبط إمكانية التحكم في انتشار الجزيئات الأساسية مع الحد من انتشار الجزيئات الكبيرة غير المرغوب فيها عبر غشاءالكبسولة 20.
متجانسة في الحجم (4.5 ميكرومتر) وكبسولات فيبروين حريرية قوية بسمك قشرة ~ 500 نانومتر (20 طبقة) في حالة رطبة يمكن إنتاجها عند اتباع البروتوكول بشكل صحيح (الشكل 3)21. سمح نهج LbL بضبط قدرة تحميل قوالب الحمض النووي بناء على التركيز الأولي للبلازميدات. يمكن تحقيق التحميل الأمثل للحمض النووي عن طريق تغيير التركيز الأولي لقوالب الحمض النووي من 50-200 نانوغرام / ميكرولتر. يمثل الجدول 1 عدد نسخ الحمض النووي المحتفظ بها في كبسولة دقيقة واحدة عند الانتهاء من تغليف LbL وتم حسابه لكل تصميم مستشعر بناء على تركيزات الحمض النووي الأولية و Mw من بلازميدات الحمض النووي وفقا للمعادلة 1. تم تحقيق القدرة المثلى لتحميل الحمض النووي مع 32 و 20 نسخة من الحمض النووي لتصميمات مستشعر ThyRS و BrocApt ، على التوالي. كان تقييم قدرة التحميل مهما للحصول على تقدير دقيق لتركيزات الحمض النووي المغلفة لتكون قادرة على معايرتها أثناء تنشيط IVTT لأجهزة الاستشعار عن طريق إضافة عينات كبسولة أكثر تركيزا.
يمكن تحليل نفاذية قذائف الكبسولة بشكل منهجي باتباع طريقة MWCO. تقدر الطريقة حجم مسام الغشاء بناء على الوزن الجزيئي لجزيئات المذاب التي لا يمكنها اختراق غشاء الكبسولة. من خلال إخضاع الكبسولات الدقيقة لجزيئات Mw fluorophore المتغيرة وإجراء تصوير متحد البؤر في المستوى البؤري الذي يتوافق مع أكبر قطر عبر كبسولات متعددة ، يمكن تقييم نفاذية أغشية القشرة. يسمح تحليل ImageJ بتقدير شدة التألق داخل وخارج الكبسولات وتحديد الأغشية القابلة للنفاذ بالكامل (كانت شدة الفلوروفور الخارجية والداخلية قابلة للمقارنة) ، ونفاذية جزئيا (50٪ -70٪ من الكبسولات كانت مضان أقل في الداخل مقارنة بالخارج) ، وغير منفذة (كانت كثافة الفلوروفور الداخلية أقل مقارنة بالكثافة الخارجية) أغشية (الشكل 4). يسمح تحويل Mw إلى نصف قطر هيدروديناميكي لكل فلوروفور بتقدير حجم شبكة غشاء الكبسولة (الجدول 2).
يمكن تحقيق النفاذية الانتقائية لكبسولات البروتين أثناء التحسين المنهجي لبروتوكول ترسيب LbL باستخدام تركيزات متغيرة للطبقة الأولية (من 0-6 مجم / مل) ، وتركيز فيبروين الحرير (من 0.5-2 مجم / مل) وعدد الطبقات المترسبة (من 10-25) حتى يتم تحقيق النفاذية المثلى. في هذا البروتوكول ، تم تحقيق النفاذية المثلى بين 25-32 نانومتر مع 6 مجم / مل من PEI كطبقة أولية و 20 طبقة من 1 مجم / مل من فيبروين الحرير المترسب أثناء تجميع LbL (الشكل 4). كان نطاق النفاذية هذا مثاليا لمكونات نظام IVTT للتسرب من خلال غلاف الكبسولة. عادة ما تكون أكبر المجمعات الجزيئية لأي نظام IVTT هي وحدات الريبوسوم بدائية النواة ، 30S و 50S ، والتي ، عند ربطها بواسطة mRNA في مجمع الريبوسوم ، يمكن أن تصل إلى ~ 20 نانومتر في الحجم22. يشبه هيكل قذائف الكبسولات الدقيقة المطورة شبكة متشابكة للغاية من طبقات ألياف الحرير المتشابكة ماديا بواسطة كتل β صفائح يتم إنتاجها أثناء تجميع LbL. هيكل الغشاء هذا شبه منفذ: عالي النفاذية للجزيئات الصغيرة (مثل الأيونات والأحماض الأمينية والببتيدات والسكريات وما إلى ذلك) ويقتصر على الجزيئات الكبيرة (على سبيل المثال ، البروتينات عالية الوزن الجزيئي ، البروتينات السكرية ، الخلايا ، إلخ) التي تسمح فقط بترشيح الجزيئات ذات نصف القطر الهيدروديناميكي أقل من 25 نانومتر. وبالتالي ، يمكن استخدام كبسولات فيبروين الحرير الدقيقة مع التحميل الأمثل للحمض النووي ونفاذية الغشاء كحاملات مفاعل حيوي لتنشيط IVTT.
يمكن اختبار النشاط النسخي والانتقالي لأجهزة استشعار تصميم ThyRS و BrocApt باستخدام أنظمة IVTT المتاحة تجاريا. يتطلب ThyRS تنشيطا متعديا لجين المراسل في وجود ليجند الثيوفيلين. يتضمن تنشيط ThyRS الاصطناعي عدة خطوات لبدء التعبير الجيني ، بما في ذلك تخليق mRNA ، والتغيير التوافقي لتسلسل mRNA عند الارتباط بالمادة المراد تحليلها ، وإطلاق موقع ربط الريبوسوم ، وتوليف بروتين GFPa1 المراسل. كل هذه الخطوات تتطلب الانتشار الحر لمكونات IVTT من خلال غشاء الكبسولة. أدى التصميم المقترح للكبسولات الدقيقة المصنوعة من الفيبروين الحريري المحمل بالحمض النووي إلى تحسين معلمات التنشيط لتصميمات أجهزة الاستشعار المنظمة بواسطة الحمض النووي الريبي: كان كل من حركية التعبير وناتج التألق أعلى بكثير مقارنة بالحمض النووي الحر غير المتجمد (الشكل 5 أ). أكد تصوير CLSM أيضا نجاح تنشيط جين GFPa1 داخل كبسولات محملة ببلازميدات الحمض النووي التي تشفر تسلسلات ThyRS (الشكل 5B-D).
بدلا من ذلك ، تم تنشيط تصميم مستشعر BrocApt في نظام IVTT الذي يدعم النسخ / الترجمة المقترنة بمروج T7 E. coli في وجود صبغة DHFBI-1T. بدأ ناتج التألق عند ربط الصبغة الفلورية بتسلسل mRNA. الأهم من ذلك ، كانت إشارة الخرج من الكبسولات الدقيقة الحريرية أعلى بعدة أضعاف مقارنة بعينات الحمض النووي غير المغلفة ذات التركيزات المكافئة (الشكل 6). وبالتالي ، يمكن أن تحتفظ كبسولات فيبروين الدقيقة الحريرية بالوظائف الأساسية لعناصر الاستشعار المشفرة بالحمض النووي ، والتي يمكن أن تكون مهمة لتصميم أنواع جديدة من منصات الاستشعار الحيوي في المختبر للكشف السريع والحساس عن التحليلات ذات الأهمية.
الشكل 1: خريطة البلازميد وتسلسل pSALv-RS-GFPa1. (أ) يحتوي البلازميد على تسلسل الثيوفيلين ريبوسويتش (ThyRS) الموضوع في المنبع من جين تشفير GFPa1 تحت سيطرة مروج ptac ، جين تشفير β-lactamase (bla) المسؤول عن مقاومة الأمبيسلين. (ب) يظهر تسلسل مروج ptac بالخط العريض وتحته خط ؛ يظهر تسلسل الثيوفيلين ريبوسويتش بخط مائل غامق. يظهر تسلسل ترميز GFPa1 بالخط العريض ؛ يتم وضع خط تحت تسلسلات مواقع التقييد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة على تحضير الكبسولات الدقيقة باستخدام نهج طبقة تلو الأخرى. تم تشغيل نوى SiO2 البكر أولا باستخدام بوليمر PEI ، متبوعا بالترسب المتسلسل لبلازميدات الحمض النووي التي تشفر تصميمات أجهزة استشعار مختلفة وطبقات فيبروين حريرية حتى يتم امتصاص العدد المطلوب من طبقات بروتين الحرير. يمكن إنتاج كبسولات دقيقة مجوفة نقية تحتوي على تصميمات مختلفة لأجهزة استشعار الحمض النووي عن طريق إذابة النوى القربانية. يمكن تحقيق تنشيط كل تصميم مستشعر حيوي مغلف في الكبسولة الدقيقة أثناء تفاعلات IVTT في وجود الروابط المقابلة. أعيد طبع هذا الرقم من Drachuk, I. et al.21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: دراسات الفحص المجهري للكبسولات الدقيقة المحملة بالحمض النووي. (أ) المقطع العرضي 2D و (ب) صور مجهرية متحدة البؤر ثلاثية الأبعاد لكبسولات مجوفة (SF) 20 دقيقة محملة ببلازميدات الحمض النووي التي تشفر ThyRS (32 نسخة / كبسولة من الحمض النووي) ويتم إنتاجها من نوى SiO2 المحضرة ب 6 مجم / مل من PEI. تم تطبيق التألق التلقائي من كبسولات فيبروين الحرير (قناة DAPI ، الأزرق) والحمض النووي الملون (قناة FITC ، الأخضر) لتحديد توطين بلازميدات الحمض النووي وتقدير سمك غشاء الكبسولة. يمثل الجزء الداخلي في (A) ملامح شدة الحمض النووي وأغلفة الفبروين الحريرية عبر الكبسولة. شريط المقياس: 2 ميكرومتر. يمثل الجزء الداخلي في (B) ملف تعريف كثافة بروتين الحرير عبر غلاف الكبسولة. تم قياس سمك الغشاء على أنه الطول عند ذروة نصف الشدة. تم إجراء معالجة الصور المقطعية والعرض ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج تصوير NIS على نظام Nikon C2 +. أعيد طبع هذا الرقم من Drachuk, I. et al.21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تقدير نفاذية الغشاء للكبسولات الحريرية الدقيقة باستخدام طريقة MWCO. صور فلورية انتقائية تمثيلية CLSM لكبسولات فيبروين حريرية مجوفة معرضة لمحاليل FITC-Dextran من Mw مختلفة (20 μM ، diH2O). تم تحضير الكبسولات بعدد مختلف من الطبقات وتركيزات جزيرة الأمير إدوارد. تؤدي الزيادة في تركيز الطبقة الأولية إلى زيادة الاستقرار الغروي للكبسولات الدقيقة ذات الأصداف الأكثر نفاذية ، بينما يؤدي التخلص من الطبقة الأولية إلى تجميع الكبسولات ذات أغشية القشرة الأقل نفاذية. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. أعيد طبع هذا الرقم من Drachuk, I. et al.21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تنشيط تصميم مستشعر ThyRS في كبسولات فيبروين الحرير. (أ) حركية تعبير GFPa1 أثناء تنشيط ThyRS من بلازميدات الحمض النووي المحملة في كبسولات SF الدقيقة المكونة من 20 طبقة (خطوط حمراء اللون) والتحكم في الحمض النووي غير المغلف (خطوط زرقاء اللون). من أعلى إلى أسفل ، كانت تركيزات الحمض النووي في حجم العينة (50 ميكرولتر) 6.5 نانوغرام / ميكرولتر ، 4.5 نانوغرام / ميكرولتر ، 2.5 نانوغرام / ميكرولتر ، و 0 نانوغرام / ميكرولتر وتتوافق مع التغيرات في شدة اللون. (ب) صور CLSM لكبسولات فيبروين حريرية محملة ب 32 نسخة من الحمض النووي (DNA) لكل كبسولة. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. (C) تتوافق الصورة مع ملفات تعريف شدة المقطع العرضي المقابلة للصورة (B) عبر كبسولتين (خط أبيض في B). يمثل الخط الأحمر كبسولات الحرير ، ويمثل الخط الأخضر GFPa1 معبرا عنه في كبسولات. (د) تمثل الصورة كبسولات حرير ثلاثية الأبعاد محملة ب 32 نسخة من الحمض النووي بعد الحضانة في نظام IVTT. يتوافق التألق الأخضر مع إشارة GFPa1 ، ويتوافق التألق الأحمر مع طبقات الحرير ذات العلامات الفلورية. شريط المقياس: 2 ميكرومتر. تم إجراء تنشيط ThyRS باستخدام الثيوفيلين (2 mM ، DMSO) أثناء حضانة الكبسولات الدقيقة في نظام IVTT (مستخلص S30). أعيد طبع هذا الرقم من Drachuk, I. et al.21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تنشيط البروكيت في كبسولات فيبروين الحرير. تم إجراء مقارنة بين حركية النسخ للكبسولات الدقيقة الحريرية المكونة من 20 طبقة محملة ب 30 نسخة من الحمض النووي لكل كبسولة (خطوط حمراء اللون) والتحكم في الحمض النووي غير المغلف (خطوط زرقاء اللون). من أعلى إلى أسفل ، كانت تركيزات الحمض النووي المغلف في العينة: 3.6 نانوغرام / ميكرولتر ، 2 نانوغرام / ميكرولتر ، 1 نانوغرام / ميكرولتر و 0 نانوغرام / ميكرولتر وتتوافق مع التغيرات في كثافة اللون. كانت تركيزات الحمض النووي غير المغلف: 20 نانوغرام / ميكرولتر ، 10 نانوغرام / ميكرولتر ، 5 نانوغرام / ميكرولتر و 0 نانوغرام / ميكرولتر وتتوافق مع التغيرات في شدة اللون. تم إجراء التنشيط باستخدام DHBFI-1T (100 ميكرومتر ، diH2O) أثناء الحضانة في نظام PURE الخالي من الخلايا. أعيد طبع هذا الرقم من Drachuk, I. et al.21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تصميم مستشعر الحمض النووي | تركيز الحمض النووي الأولي (نانوغرام / ميكرولتر) | عدد نسخ الحمض النووي لكل كبسولة (الحمض النووي / الكبسولة) |
50 | 16 | |
ثيرس | 100 | 32 |
150 | 48 | |
200 | 64 | |
50 | 10 | |
بروك أبت | 100 | 20 |
150 | 30 | |
200 | 40 |
الجدول 1: عدد نسخ الحمض النووي لكل كبسولة لكل تصميم الحمض النووي. تم حساب رقم النسخة وفقا للمعادلة 1 وكان مرتبطا بالتركيز الأولي لبلازميدات الحمض النووي ، وتقارب الاحتفاظ بتسلسل الحمض النووي أثناء عملية ترسيب LbL ، وطول بلازميدات الحمض النووي.
ميغاواط من FITC-ديكستران (kDa) | نصف القطر الهيدروديناميكي (نانومتر) |
4 | 1.4 |
20 | 3.3 |
40 | 4.5 |
70 | 6 |
150 | 8.5 |
250 | 10 |
500 | 14 |
2,000 | 18 |
الجدول 2: الخصائص الفيزيائية ل FITC-dextrans. تم استخدام نصف القطر الهيدروديناميكي لكل فلوروفور لتقدير نفاذية كبسولات فيبروين الحرير المجوفة.
يمكن تحضير كبسولات هيدروجيل دقيقة قابلة للنفاذ بشكل انتقائي محملة بأنواع مختلفة من تصميمات أجهزة الاستشعار المشفرة بالحمض النووي باتباع هذا البروتوكول. تتمثل إحدى السمات المميزة لنهج LbL في القدرة على تكييف تعقيد الكبسولات الدقيقة أثناء التجميع من أسفل إلى أعلى ، والذي يبدأ عادة بامتصاص الأنواع الجزيئية على قوالب القرابين. من خلال ضبط تركيزات المكونات الأولية بعناية ، وظروف الأس الهيدروجيني ، وعدد الطبقات ، يمكن تحضير كبسولات دقيقة ذات معلمات تحميل DNA مختلفة ، ووظائف ، ونفاذية قابلة للضبط23. من أجل تضخيم تعدد استخدامات الكبسولات ، يمكن تحقيق مزيد من الأداء الوظيفي لسطح القشرة باستخدام AuNPs و IgG لتنفيذ ناقلات أجهزة استشعار متوافقة حيويا للتشخيصات في الجسم الحي . يعتمد كلا هذين الطريقين البديلين على التركيب الجزيئي الفريد للفيبروين الحريري. يمكن تحقيق الاختزال في الموقع لأيونات Au3+ بسبب وجود بقايا التيروزين (5.3٪ مول) قادرة على تقليل أيونات المعادن في وجود مخزن مؤقت مثالي للاختزال. يمكن إجراء اقتران أجسام مضادة محددة على سطح كبسولات البروتين الدقيقة الوظيفية AuNPs عن طريق تنفيذ كيمياء تنشيط الكربوديميد. تتطلب هاتان الخطوتان تطويرا دقيقا وتحسين البروتوكول من أجل تحقيق الوظائف المناسبة لكبسولات المستشعر الحيوي للتطبيقات المستقبلية. على سبيل المثال ، لاستخدام هذه الكبسولات الدقيقة كأنظمة توصيل "ذكية" ، حيث يتم تسليم شحنة جزيئية بناء على محفزات محددة (مثل الأس الهيدروجيني أو الإشارات الكيميائية) ، يجب تمييز الخصائص المحددة لهذه الكبسولات وضبطها ، بما في ذلك كفاءة التسليم ووقت الاحتفاظ وطريقة الإعطاء وعلاجات نموذج المرض.
تميزت الكبسولات الدقيقة المحملة بالحمض النووي بتقنية CLSM وقياسات مضان. ومع ذلك ، يمكن تطبيق طرق توصيف أخرى مثل مجهر القوة الذرية (AFM) ، والتصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (CEM) ، والمجهر فائق الدقة لإعادة البناء العشوائي المباشر (dSTORM) للتمييز بين هياكل محددة من الكبسولات الدقيقة ، بما في ذلك الألياف الفردية ، والمجالات النانوية ، وتوطين بلازميدات الحمض النووي24،25،26.
يسلط البروتوكول المطور الضوء على استخدام البوليمر الحيوي للفيبروين الحريري كمادة شبكة متوافقة حيويا تحافظ على البنية الثلاثية لبلازميدات الحمض النووي المحملة. يحدث استقرار تسلسل الحمض النووي المتجمد داخل شبكة فيبروين الحرير عن طريق التفاعلات الكارهة للماء و / أو الترابط الهيدروجيني ، والتي توفر بيئة دقيقة واقية ضد تعطيل الأس الهيدروجيني أو الأكسدة أو التحلل المائي27. بالإضافة إلى ذلك ، توفر المجالات β البلورية للفيبروين الحريري حاجزا ميكانيكيا فريدا ، مما يقيد حركة الجزيئات الكبيرة المحاصرة ، ويمنع بلازميدات الحمض النووي من التدهور أثناء التخزين في المحاليل المائية.
خلقت الطبيعة شبه المنفذة للكبسولات الدقيقة المصنوعة من فيبروين الحرير المحملة بقوالب الحمض النووي ظروفا مكانية وفيزيائية كيميائية فريدة لتفاعلات IVTT. تمكن أبتامر الحمض النووي الريبي المنشط نسخيا ومتعديا وريبو سويتش المجمدة في كبسولات فيبروين الدقيقة الحريرية من إنتاج إشارة خرج كانت أعلى بثلاثة أضعاف على الأقل مقارنة بأجهزة الاستشعار الحرة غير المجمودة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تجميد قوالب الحمض النووي في الكبسولات الدقيقة إلى تعزيز نشاط أجهزة الاستشعار المغلفة بشكل كبير بما يتجاوز حد الكشف عن تلك غير المغلفة. في حين أن المستشعرات غير المغلفة لديها استجابة ضئيلة عند تركيزات منخفضة من الحمض النووي ، فإن المستشعرات المغلفة لها استجابة خرج مميزة للغاية ، والتي يمكن معايرتها بسهولة لتعكس التغيرات الطفيفة في تركيزات الحمض النووي. من المحتمل أن تكون إشارة الاستجابة المحسنة للمراسلين المغلفين بسبب الانتشار غير المقيد لمكونات آلية IVTT وانخفاض حركة بلازميدات الحمض النووي. وقد اعترفت العديد من الدراسات بأن غلة تخليق البروتين في التفاعلات الخالية من الخلايا تعتمد على البيئة الجزيئية28,29. وفر تجميد بلازميدات الحمض النووي في شبكة الحرير بيئة محصورة فعالة تقيد حركة قليل النوكليوتيدات وتسريع تفاعلات آلية النسخ / الترجمة حتى من عدة نسخ من الحمض النووي21.
بينما توفر طريقة LbL نهجا متعدد الاستخدامات للغاية لبناء تجميعات متعددة الوظائف بطريقة يمكن التحكم فيها ، فإن إجراء التصنيع يستغرق وقتا طويلا نسبيا ويتطلب عادة تعديلات معالجة لزيادة إنتاجية الكبسولات الدقيقة. هناك اعتبار آخر في صنع كبسولات دقيقة قائمة على الجزيئات الحيوية وهو توافق أي نظام معين مع متطلبات الذوبان الأساسي بعد اكتمال ترسب LbL. حتى الآن ، لإنتاج كبسولات دقيقة متجانسة الحجم وقوية محملة بالحمض النووي من الحرير المجوف ، تم ترسيب الأصداف على قوالب أساسية من السيليكا القربانية (SiO2) ، والتي تتطلب إزالتها لاحقا عن طريق حفر حمض الهيدروفلوريك (HF). كما أن مناولة الموجات الديكامترية (HF) أو النقش لا تعتبر عمليات متوافقة أحيائيا، مما يحد من استخدامها على نطاق واسع في التطبيقات العملية. البديل للقوالب الغروية غير العضوية SiO2 ، عادة ما تكون نوى الكربونات خاملة في تكوين معقدات بطبقات بوليمر ويمكن إذابتها في ظل ظروف معتدلة باستخدام حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA). ومع ذلك ، قد يؤثر ضبط النوى القربانية على خصائص ترسيب الطبقات المتعددة وسلامة هيكل القشرة ، الأمر الذي يتطلب مزيدا من التحسين للبروتوكول.
باختصار ، يسمح البروتوكول الحالي بإعداد كبسولات دقيقة محملة بالحمض النووي تعتمد على الحرير بتصميمات أجهزة استشعار مختلفة. أدى الجمع بين البيئة المكروية المحصورة التي توفرها طريقة LbL واستخدام فيبروين الحرير كمادة متوافقة حيويا إلى تحسين خصائص الاستشعار للحمض النووي المغلف. مع التطور السريع لتقنية أبتامر الحمض النووي الريبي الفلورية ، يمكن توسيع الاستخدام المحتمل للكبسولات الدقيقة الحريرية المحملة بالحمض النووي لتشمل التشخيص المختبري المتعدد. في الآونة الأخيرة ، ظهرت العديد من الاختلافات في أبتامير الفلورسنت القائمة على الحمض النووي الريبي كتقنية قوية خالية من الخلفية لتصوير الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية ذات حساسية عالية لنسبة الإشارة إلى الضوضاء30,31. من خلال تطبيق تقنية النانو RNA الاصطناعية لتصميم أبتامير الحمض النووي الريبي الاصطناعي ، يمكن تسخير الخصائص الفلورية للأبتامير للكشف عن روابط محددة ذات أهمية. ستكون هذه التقنية ذات قيمة خاصة لمراقبة المؤشرات الحيوية ذات الأهمية بتنسيقات مختلفة ، بما في ذلك أجهزة الاستشعار الورقية في نقاط الاستخدام ، والبقع القائمة على الهيدروجيل للعرق أو السائل الخلالي ، والمواد القابلة للزرع.
الآراء ووجهات النظر الواردة هنا هي آراء المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر دائرة الدفاع أو مكوناتها
تم دعم هذا العمل من خلال منحة LRIR 16RH3003J من مكتب البحث العلمي التابع للقوات الجوية ، بالإضافة إلى برنامج البيولوجيا التركيبية للبحوث التطبيقية للبيئات العسكرية للنهوض بأولويات العلوم والتكنولوجيا (ARAP) التابع لمكتب وكيل وزارة الدفاع الأمريكي للبحوث والهندسة.
تم توفير تسلسل ناقل البلازميد ل ThyRS (pSALv-RS-GFPa1 ، 3.4 كيلو بايت) بسخاء من قبل الدكتور ج. جاليفان. تم التبرع بشرانق دودة القز من Bombyx mori بسخاء من قبل الدكتور D.L. كابلان من جامعة تافتس ، ماساتشوستس.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
SiO? silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
Sodium carbonate, Na?CO? | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved