Preparazione di microcapsule multifunzionali a base di seta caricate con plasmidi di DNA codificanti aptameri e ribointerruttori RNA

Il protocollo descrive la formazione di microcapsule robuste e biocompatibili cariche di DNA come biosensori in vitro multiplex in grado di tracciare diversi ligandi.

Introduciamo un protocollo per la preparazione di microcapsule di fibroina di seta cariche di DNA tramite il metodo di assemblaggio Layer-by-Layer (LbL) su nuclei sferici sacrificali. Dopo l'adsorbimento di uno strato primario e plasmidi di DNA, la formazione di microcapsule robuste è stata facilitata inducendo fogli di β nella struttura secondaria della seta durante la disidratazione acuta di un singolo strato di seta. Quindi, la stratificazione è avvenuta tramite legami idrogeno multipli e interazioni idrofobiche. Dopo l'adsorbimento di gusci multistrato, le strutture del guscio centrale possono essere ulteriormente funzionalizzate con nanoparticelle d'oro (AuNP) e / o anticorpi (IgG) da utilizzare per il telerilevamento e / o la consegna mirata. La regolazione di diversi parametri chiave durante la deposizione sequenziale di macromolecole chiave su nuclei di silice come la presenza di un primer polimerico, la concentrazione di DNA e proteine della seta, nonché un numero di strati adsorbiti ha portato a microcapsule biocompatibili, cariche di DNA con permeabilità e carichi di DNA variabili. Dopo la dissoluzione dei nuclei di silice, il protocollo ha dimostrato la formazione di microcapsule cave e robuste con plasmidi di DNA immobilizzati sulla superficie interna della membrana della capsula. La creazione di una membrana biocompatibile selettivamente permeabile tra i plasmidi del DNA e l'ambiente esterno ha preservato il DNA durante la conservazione a lungo termine e ha svolto un ruolo importante nel miglioramento della risposta di uscita dai plasmidi spazialmente confinati. L'attività dei modelli di DNA e la loro accessibilità sono state testate durante le reazioni di trascrizione e traduzione in vitro (sistemi cell-free). I plasmidi del DNA che codificano aptameri e riboswitch di illuminazione dell'RNA sono stati attivati con successo con analiti corrispondenti, come è stato visualizzato durante la localizzazione di trascritti di RNA marcati con fluorescenza o proteina GFPa1 nelle membrane del guscio.

Il campo della biologia sintetica offre opportunità uniche per sviluppare capacità di rilevamento sfruttando meccanismi naturali evoluti dai microrganismi per monitorare il loro ambiente e le potenziali minacce. È importante sottolineare che questi meccanismi di rilevamento sono tipicamente legati a una risposta che protegge questi microrganismi dall'esposizione dannosa, regolando l'espressione genica per mitigare gli effetti negativi o prevenire l'assunzione di materiali tossici. Ci sono stati sforzi significativi per progettare questi microrganismi per creare sensori a cellule intere sfruttando queste risposte naturali ma reindirizzandoli a riconoscere nuovi bersagli e / o a produrre un segnale misurabile che può essere misurato a fini di quantificazione (tipicamente fluorescenza)^1,2. Attualmente, le preoccupazioni relative all'uso di microrganismi geneticamente modificati (OGM), specialmente quando vengono rilasciati nell'ambiente o nel corpo umano, a causa della fuoriuscita di cellule intere o di parte del loro materiale genetico, anche se incapsulato in una matrice polimerica, suggeriscono che sono necessari modi alternativi per sfruttare questi approcci di rilevamento³.

Un approccio efficace per sfruttare i vantaggi del rilevamento basato su microrganismi senza preoccuparsi della diffusione di OGM è l'uso di sistemi di trascrizione/traduzione in vitro (IVTT). Da un punto di vista pratico, i sistemi IVTT consistono in una miscela contenente la maggior parte dei componenti cellulari in uno stato attivo che è stata "estratta" dalle cellule con diversi mezzi, tra cui sonicazione, battito di perline o altri⁴. Il prodotto finale di questo processo è una miscela di reazione biochimica già ottimizzata per eseguire la trascrizione e la traduzione che può essere utilizzata per testare diversi sensori in un formato "open vessel", senza i vincoli associati all'uso di cellule intere (diffusione di membrana, efficienza di trasformazione, tossicità cellulare, ecc.). È importante sottolineare che diversi componenti del sensore possono essere aggiunti quantitativamente e il loro effetto studiato con diverse tecniche ottiche e spettrometriche, come abbiamo dimostrato⁵. È stato notato che le prestazioni dei sistemi IVTT possono essere incoerenti; Tuttavia, studi recenti hanno mostrato approcci per standardizzare la loro preparazione e caratterizzazione, il che è di grande aiuto quando si studiano le loro prestazioni nella progettazione dei sensori⁶. Recentemente, sono stati dimostrati molti esempi di sistemi IVTT che utilizzano per creare saggi cartacei attraverso la liofilizzazione dei loro componenti in matrici cartacee, tra cui il rilevamento di ioni di metalli pesanti, farmaci, elementi di quorum sensing e altri ^7,8,9. Uno spazio applicativo interessante per i sensori basati su IVTT è il loro utilizzo in applicazioni di rilevamento in diversi tipi di ambienti, tra cui suolo, acqua e corpo umano. Per distribuire questi sistemi IVTT in questi ambienti difficili, è necessario implementare un approccio di incapsulamento per contenere i componenti IVTT e proteggerli dal degrado.

Gli approcci di incapsulamento più comuni per i sistemi IVTT includono l'uso di capsule lipidiche, micelle, polimerisomi e altri microcontenitori strettamente chiusi^10,11,12. Uno svantaggio di questo approccio è la necessità di incorporare meccanismi passivi o attivi per trasportare materiali dentro e fuori i contenitori per consentire la comunicazione con l'ambiente esterno e fornire capacità di rilevamento. Per superare alcuni di questi problemi, lo studio riporta un metodo che fornisce un approccio semplice ma efficace per incapsulare i materiali di codifica per diversi progetti di sensori da esprimere nei sistemi IVTT. Questo approccio si basa sull'utilizzo della deposizione Layer-by-Layer (LbL) di un biopolimero in presenza dei plasmidi di interesse per creare microcapsule cave ad alta porosità, che consente al materiale genetico protetto di interagire con i diversi componenti dell'IVTT di scelta. Lo studio ha dimostrato che i plasmidi incapsulati potrebbero dirigere la trascrizione e la traduzione quando attivati all'interno di questa matrice polimerica, come mostrato con la risposta di un aptamero codificato da plasmide e di un riboswitch ai loro bersagli corrispondenti. Inoltre, questo rivestimento LbL protegge i plasmidi per mesi senza particolari condizioni di conservazione.

1. Costruzione del vettore plasmide.

1. Costruire un vettore plasmidico (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) mediante amplificazione della sequenza codificante di un riboswitch teofillina (ThyRS) accoppiato con GFPa1 dal vettore pJ201:23976-RS-GFPa1 (progettato e creato da DNA2.0) e inserimento nel vettore di espressione di E. coli , pSAL¹³. Utilizzare primer diretti (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') e inversi (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') per amplificare la sequenza codificante di ThyRS accoppiato con GFPa1 ed eseguire una reazione PCR in volume di 50 μL utilizzando DNA polimerasi secondo il protocollo¹⁴ del produttore.
2. Preparare un gel di agarosio all'1% da 0,5 g di agarosio, 50 ml di tampone TAE (40 mM Tris acetato, 1 mM EDTA, pH 8,0) e 3 μL di colorazione del DNA.
3. Miscelare 5 μL di aliquota del prodotto amplificato con PCR con 5 μL di acqua priva di RNasi/DNasi e 2 μL di colorante caricante gel 6x e analizzare mediante elettroforesi su gel di agarosio. Caricare una scala del DNA (0,1-10,0 kb) come riferimento. Eseguire il gel a 120 V fino a quando la linea di colorante ha quasi raggiunto il fondo del gel.
4. Visualizza i frammenti di DNA utilizzando un sistema di imaging transilluminatore UV per verificare la dimensione corretta del DNA¹⁵.
5. Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione PCR secondo il protocollo del produttore¹⁶.
6. Digerire il prodotto PCR e il vettore di espressione pSAL con enzimi di restrizione KpnI e BlpI in una reazione da 15 μL, contenente 10 μL di prodotto PCR o vettore plasmidico (concentrazione 20-50 ng/μL), 1,5 μL di tampone enzimatico 10x, 1 μL di ciascun enzima e 1,5 μL di acqua priva di RNasi/DNasi, a 37 °C per 2 ore.
7. Aggiungere 3 μL di colorante caricante gel 6x alla miscela di reazione e separare i frammenti digeriti su un gel di agarosio all'1% come descritto nei passaggi 1.3-1.5.
8. Purificare i frammenti di DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo il protocollo del produttore¹⁶.
9. Collegare il prodotto PCR digerito in un vettore plasmidico linearizzato digerito, pSAL, utilizzando T4 DNA ligasi e tampone ligasi integrato in una reazione da 10 μL contenente 3-20 fmol del vettore digerito, 9-60 fmol del prodotto PCR digerito, 2 μL di tampone ligasi, 1 μL (1 unità) di T4 DNA ligasi e acqua priva di DNasi/RNasi. Incubare la reazione di legatura a 25 °C per 3 ore.
   NOTA: Assicurarsi che il contenuto totale di DNA nella miscela di reazione sia 0,01-0,1 μg.
10. Trasformare le cellule competenti di E. coli DH5α con 10 ng della miscela di reazione di legatura secondo il protocollo¹⁷ del produttore.
11. Far crescere le cellule trasformate a 37 °C durante la notte su piastre di agar LB integrate con ampicillina (100 μg/mL).
12. Prelevare 3-4 colonie batteriche dalla piastra e trasferire asetticamente ciascuna di esse in 5 ml di mezzi LB integrati con ampicillina (100 μg/mL). Coltivare le colture durante la notte a 37 °C in un'incubatrice a 225 giri/min.
13. Pellettare le colture durante la notte mediante centrifugazione a 11 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
14. Utilizzare un kit di purificazione per purificare i plasmidi secondo il protocollo del produttore¹⁶.
15. Verificare le sequenze dei plasmidi purificati mediante sequenziamento del DNA. La mappa plasmidica e la sequenza del costrutto risultante (pSALv-RS-GFPa1) sono mostrate nella Figura 1.

2. Purificazione del DNA su larga scala.

1. Trasformare il vettore plasmidico pSALv-RS-GFPa1 (3.4 kb) (che codifica per il riboswitch teofillina accoppiato con il gene reporter GFPa1) o pET28c-F30-2xBroccoli (5.4 kb) (codificante per l'aptamero di Broccoli) in cellule competenti per E. coli DH5α secondo il protocollo¹⁷ del produttore.
2. Far crescere le cellule trasformate a 37 °C durante la notte su piastre di agar LB integrate con ampicillina (100 μg/mL) per cellule trasformate con pSALv-RS-GFPa1 o kanamicina (50 μg/mL) per cellule trasformate con broccoli pET28c-F30-2x.
3. Prelevare 3-4 colonie batteriche dalla piastra e trasferire asetticamente ogni colonia in 5 ml di terreno LB integrato con antibiotico appropriato (100 μg/mL di ampicillina o 50 μg/mL di kanamicina). Coltivare le colture durante la notte a 37 °C in un'incubatrice a 225 giri/min.
4. Utilizzare 3 ml di coltura overnight da inoculare in 150 mL di LB integrata con antibiotico appropriato (100 μg/mL di ampicillina o 50 μg/mL di kanamicina) e far crescere le colture per una notte a 37 °C in un incubatore agitatore a 225 giri/min.
5. Pellettare le celle mediante centrifugazione a ≥3400 x g per 10 minuti a 4 °C.
6. Utilizzare un kit di purificazione per purificare i plasmidi secondo il protocollo del produttore¹⁶.
7. Eluire il DNA con 0,5 mL di acqua pura priva di DNasi/RNasi. Misurare la concentrazione di DNA e preparare 1 mL di soluzioni madre di DNA (100 ng/μL). Conservare le provette con DNA a 4 °C fino a ulteriore utilizzo.

3. Estrazione della fibroina di seta e preparazione dei materiali iniziali.

1. Preparare una soluzione acquosa di proteina ricostituita di fibroina della seta (SF) dai bozzoli del baco da seta Bombyx mori secondo la procedura descritta in dettaglio altrove per rappresentare il 10% della soluzione di Silk-LiBr¹⁸.
2. Determinare la concentrazione finale della soluzione acquosa di SF. Pipettare 0,5 mL di soluzione di seta su una capsula di Petri da 60 mm, lasciarla asciugare a 60 °C e misurare il peso della pellicola di seta asciutta. Dividere il peso secco per 0,5 ml per calcolare la percentuale di peso per volume.
3. Diluire la soluzione concentrata di seta con acqua distillata priva di DNasi/RNasi aggiungendo lentamente acqua tramite pipetta sierologica per ottenere una concentrazione finale di 1 mg/ml. Conservare la soluzione a 4 °C per un uso futuro.
4. Preparare fibroina di seta marcata con fluorescenza utilizzando un kit di etichettatura anticorpale. Utilizzare 1 mL di soluzione di fibroina di seta da 2 mg/ml per accoppiare i gruppi N-terminali α-amminico della proteina con un colorante derivato attivato con estere del NHS secondo il protocollo¹⁹ del produttore.
5. Preparare 50 mL di soluzione acquosa di polietilenimmina (PEI) con una concentrazione di 6 mg/ml, regolare il pH a 4 con HCl (1 M). Filtrare la soluzione attraverso una membrana sterile da 0,2 μm. Lo stoccaggio è possibile in condizioni ambientali per mesi.
6. Preparare i core SiO₂ . Pipettare 300 μL di particelle di SiO 2 in una provetta da microcentrifuga da₂ ml. Lavare le microparticelle due volte con 1 mL di acqua priva di DNasi/RNasi mediante centrifugazione a 0,2 x g per 1 minuto.

4. Eseguire la deposizione strato per strato di uno strato primo, plasmidi di DNA e strati di seta.

1. Per depositare lo strato primario PEI sulle microparticelle di SiO₂ , aggiungere 1 mL di soluzione PEI al pellet filato dal punto 3.6 e agitare la miscela in condizioni ambientali su un termomiscelatore a 800 giri / min per 15 minuti. Lavare le particelle quattro volte con 1 mL di acqua deionizzata priva di DNasi/RNasi mediante centrifugazione a 0,2 x g per 1 minuto.
2. Per eseguire la deposizione dello strato di DNA, aggiungere 1 mL della soluzione acquosa di plasmidi di DNA dal punto 2.7 alle microparticelle innescate PEI e agitare delicatamente la miscela a 4 °C su un termomiscelatore a 800 giri / min per 15 minuti. Per preparare microcapsule con diversi carichi di DNA, regolare la concentrazione di plasmidi di DNA da 50-200 ng/μL utilizzando acqua distillata priva di DNasi/RNasi e utilizzare 1 mL di queste soluzioni per depositare il DNA. Raccogliere le microparticelle mediante centrifugazione a 0,2 x g per 1 minuto.
3. Contrassegnare i tubi per plasmidi di DNA che codificano per il riboswitch teofillina accoppiato con GFPa1 come ThyRS-GFPa1 e i plasmidi del DNA che codificano per l'aptamero di Broccoli come BrocApt.
   NOTA: Tenere le provette della microcentrifuga con il DNA sul ghiaccio.
4. Rimuovere con cautela il surnatante e lavare le microparticelle quattro volte con 1 mL di acqua distillata priva di DNasi/RNasi, scartando ogni volta il surnatante dopo centrifugazione a 0,2 x g per 1 minuto. Eseguire tutti gli esperimenti a temperatura ambiente (RT) se non diversamente specificato.
5. Per eseguire la deposizione dello strato di fibroina di seta aggiungere 1 mL della soluzione acquosa ricostituita di SF dal punto 3.3 alle microparticelle adsorbite di DNA, vortice delicatamente e agitare la miscela a 10 °C sul termomiscelatore a 750 giri / min per 15 minuti. Raccogliere le microparticelle mediante centrifugazione a 0,2 x g per 1 minuto a 4 °C, rimuovere il surnatante e quindi lavarle una volta con 1 mL di acqua distillata priva di DNasi/RNasi. Ripetere la centrifugazione ed eliminare il surnatante.
   NOTA: Durante l'esperimento, tenere la soluzione di seta sul ghiaccio per evitare gelificazioni indotte dalla temperatura.
6. Trattare gradualmente le particelle con metanolo per indurre la formazione di fogli di β nella struttura proteica della seta. In primo luogo, aggiungere 0,5 ml di acqua distillata DNasi / RNasi, vortice il tubo della microcentrifuga, quindi aggiungere 0,5 ml di metanolo al 100%. Agitare delicatamente le particelle sul termomiscelatore a 10 °C per 5 minuti. Raccogliere le particelle mediante centrifugazione a 0,2 x g per 1 min. Rimuovere il surnatante.
7. Trattare le particelle con metanolo per favorire la formazione di fogli di β e garantire un forte assorbimento fisico dello strato di seta. Aggiungere 1 mL di metanolo al 100%. Agitare delicatamente le particelle sul termomiscelatore a 750 giri/min per 10 minuti a 10 °C.
8. Raccogliere le particelle mediante centrifugazione a 0,2 x g per 1 minuto a 4 °C e lavarle due volte con 1 ml di acqua distillata priva di DNasi/RNasi ogni volta, scartando il surnatante e vorticando delicatamente prima della centrifugazione successiva.
9. Ripetere i passaggi 4,5-4,8 20 volte per ottenere strutture di guscio multistrato di seta. Per l'ultima fase di deposizione, utilizzare seta etichettata con fluorescenza dal punto 3.4 (Silk-DyLight550, 1 mL).
10. Eseguire l'ultima fase di lavaggio e mantenere le microparticelle in 1 mL di acqua distillata priva di DNasi/RNasi in condizioni ambientali.
    NOTA: Per evitare l'aggregazione di particelle durante la deposizione di strati di seta, eseguire un'ispezione visiva della sospensione delle particelle e pipettarla su e giù utilizzando una punta della pipetta da 1 mL per promuovere una distribuzione omogenea delle particelle.
11. Calcolare il numero di copie del plasmide del DNA incapsulate in ogni microcapsula, N_DNA utilizzando l'equazione 1:
    (1)
    Dove N = 6,769 × 10¹¹ - il numero di core SiO₂ utilizzati per l'incapsulamento. Calcolarlo da una curva standard per le concentrazioni note di particelle di silice usando diluizioni seriali e assorbimento A 320 a λ =₃₂₀ nm;
    C- concentrazione iniziale di DNA utilizzato per l'adsorbimento
    V- il volume di DNA utilizzato per l'adsorbimento
    0.8- Efficienza di adsorbimento del DNA sui nuclei
    M_w- Peso molecolare del plasmide del DNA
    N_A- Numero di Avogadro (6.022 × 10²³)

5. Dissoluzione dei nuclei per ottenere microcapsule di seta.

1. Preparare una soluzione di acido fluoridrico (HF) all'8%, pH 5,5, diluendo la soluzione madre (48%) con acqua distillata. Acquistare una provetta da centrifuga da 50 ml. Pipettare accuratamente 5 mL di HF e aggiungere 25 mL di acqua distillata per ottenere una soluzione HF all'8%.
   ATTENZIONE: L'HF è un acido altamente corrosivo e può causare gravi ustioni ai tessuti. Estrema cautela deve essere presa durante la manipolazione e l'uso di HF per gli esperimenti. Aderire alla procedura operativa standard (SOP) per il corretto utilizzo e gestione dell'HF sviluppata dall'organizzazione per evitare incidenti indesiderati da fuoriuscita. Non utilizzare contenitori di vetro per diluire l'acido HF. Utilizzare la cappa chimica per eseguire questo passaggio del protocollo.
2. Sciogliere i nuclei di SiO₂ aggiungendo 1,5 ml di soluzione HF all'8% alle microparticelle pellettate del guscio del nucleo dal punto 4.10. Vortice delicatamente e lasciare che i nuclei si dissolvano durante la notte in condizioni ambientali con un leggero scuotimento a 450 giri / min.
   NOTA: Per evitare fuoriuscite di HF, utilizzare nastro adesivo per sigillare la provetta della microcentrifuga. Utilizzare una cappa chimica per eseguire questo passaggio del protocollo.
3. Preparare un bicchiere di vetro da 2 L riempito con 2 L di acqua deionizzata. Trasferire la soluzione di microcapsule ai dispositivi di dialisi (50 kDa MWCO) e dializzarle contro l'acqua deionizzata con un cambio ripetuto dell'acqua ogni 3 ore per i successivi 3 giorni.
   NOTA: Raccogliere il surnatante durante i primi tre scambi di acqua e scartare la soluzione secondo il protocollo stabilito per i materiali di scarto pericolosi.
4. Utilizzare una pipetta da 1 mL per trasferire la sospensione dai dispositivi di dialisi in nuove provette da microcentrifuga da 2 mL per raccogliere le microcapsule.
   NOTA: Conservare le soluzioni acquose delle microcapsule in condizioni ambientali per diversi anni.

6. Imaging di microcapsule di fibroina di seta mediante microscopio laser a scansione confocale (CLSM).

1. Eseguire la colorazione del DNA utilizzando un colorante del DNA.
   1. Trasferire 300 μL di microcapsule di fibroina di seta cava in una provetta fresca da 1 mL di microcentrifuga. Aggiungere 500 μL di acqua distillata priva di RNasi/DNasi.
   2. Aggiungere 5 μL del colorante colorante del DNA, brevemente vortice, e incubare a RT per 2 ore al riparo dalla luce.
   3. Eseguire quattro fasi di lavaggio mediante centrifugazione a 0,1 x g per 20 minuti a 4 °C ogni volta, rimuovendo con cura 400 μL di surnatante e reintegrandolo con 400 μL di acqua distillata priva di RNasi/DNasi.
2. Eseguire l'imaging di capsule di seta su sistemi confocali invertiti dotati di tre laser principali (405 nm, 488 nm, 561 nm) utilizzando l'obiettivo 100x oil-immersion (NA 1.49). Trasferire 100 μL del campione di capsula in un singolo pozzetto di vetrini a 8 pozzetti camerati, lasciare sedimentare le capsule per 20-30 minuti prima dell'imaging.
   NOTA: I coloranti sono molto sensibili al fotosbiancamento. Proteggere i campioni coprendo i vetrini con un foglio di alluminio.

7. Stima della permeabilità di microcapsule cave mediante il metodo MWCO (molecular weight cut-off).

1. Preparare 2 mL ciascuna di soluzioni di destrano fluoroforo marcate con FITC (20 μM, diH 2 O)_{di M w} diverso (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa e₂MDa).
2. Pipettare 100 μL della sospensione di capsule in un singolo pozzetto di un vetrino camerato. Analizzare separatamente ogni progetto di microcapsula (concentrazione di PEI, numero di carico di plasmidi di DNA, concentrazione di fibroina di seta e numero di strati).
3. Ad ogni pozzetto, aggiungere 300 μL della soluzione specifica di fluoroforo partendo_{dal M w} più basso fino al più alto, in modo che ogni pozzetto corrisponda alla soluzione specifica di fluoroforo. Mescolare pipettando su e giù e lasciare incubare la miscela per 1 ora a RT fino a quando la diffusione delle soluzioni di fluorofori raggiunge l'equilibrio.
4. Trasferire il vetrino su un microscopio a scansione laser confocale (CLSM) e visualizzare ogni pozzetto utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 100x all'eccitazione λ = 488 nm.
   1. Identificare l'area di interesse regolando il piano focale per assicurarsi che le capsule appaiano sotto forma di cerchi del diametro maggiore. Ciò accade in genere quando si osservano i campioni più vicini al fondo del pozzo quando le capsule sedimentano a causa della gravità.
   2. Raccogliere diverse immagini di campioni di microcapsule spostando la diapositiva in direzione XY. Cattura immagini per rappresentare fino a 100-150 capsule per ogni campione.
   3. Utilizzare il software ImageJ per analizzare la permeabilità della membrana della capsula in ciascuna soluzione di fluoroforo M_w confrontando le intensità di fluorescenza all'interno e all'esterno delle capsule. Per questo, disegna una regione di interesse (ROI) sotto forma di un cerchio per delineare la circonferenza della capsula e fai clic su Analizza / Misura per misurare l'intensità della fluorescenza all'interno. Tabulare i dati in un foglio di calcolo. Eseguire questa operazione per ogni microcapsula per un totale di 200-300 capsule.
   4. Valutare l'intensità della fluorescenza esterna allo stesso modo delineando il ROI e misurando l'intensità lontano dalle capsule. Eseguire 3-5 misurazioni per l'analisi statistica.
   5. Per eseguire analisi statistiche, confrontare le intensità di fluorescenza all'interno e all'esterno delle capsule utilizzando il t-test accoppiato (p < 0,05).
   6. Utilizzare la tabella di conversione 2 per stimare la permeabilità delle microcapsule in base ai raggi idrodinamici per FITC-Dextran con M w variabile.

8. Attivazione in vitro di teofillina sintetica riboswitch in microcapsule di seta

1. Preparare 1 mL di soluzione madre di teofillina (100 mM, DMSO). Preparare il sistema di estrazione di E. coli S30 per il DNA circolare scongelando i componenti sul ghiaccio per 40 minuti.
2. Ottenere una provetta da microcentrifuga priva di DNasi/RNasi da 0,5 ml. Eseguire una reazione di trascrizione/traduzione in vitro , combinare i componenti cell-free con un campione di microcapsule nel seguente ordine (volume totale 50 μL): S30 premiscela senza amminoacidi (20 μL); Estratto di S30, circolare (15 μL); miscela completa di aminoacidi (5 μL); microcapsule cave contenenti plasmidi ThyRS-GFPa1 dal punto 4.10 (9 μL); e teofillina, 100 mM DMSO (1 μL).
   NOTA: Dopo aver aggiunto tutti i componenti, ruotare brevemente la provetta e raccogliere il campione durante una breve centrifugazione a 0,2 × g per un paio di secondi.
3. Incubare il tubo a 30 °C per 4 ore e controllare la fluorescenza su un lettore di piastre utilizzando eccitazione a λ = 488 nm ed emissione per filtro GFP/FITC (510 nm ± 20 nm).
4. Immagini delle capsule su qualsiasi sistema LCSM utilizzando laser a 488 nm e 561 nm. Ottieni immagini della migliore qualità utilizzando l'obiettivo ad immersione in olio 100x e 8 diapositive ben camerate.

9. Attivazione in vitro dell'aptamero dei broccoli in microcapsule di seta

1. Preparare 1 mL di soluzione madre di colorante DFHBI-1T (30 μM, diH₂O). Preparare il kit di reazione del sistema privo di cellule PURE (sintesi proteica con elementi ricombinanti) scongelando i componenti sul ghiaccio per 40 minuti.
2. Ottenere una provetta da microcentrifuga priva di DNasi/RNasi da 0,5 ml. Eseguire la reazione di trascrizione in vitro combinando componenti di reazione cell-free con un campione di microcapsule nel seguente ordine (volume totale 50 μL): soluzione A (20 μL); soluzione B (15 μL); microcapsule cave contenenti plasmidi BrocApt dal punto 4.10 (14 μL); e colorante DFHBI-1T (1 μL).
   NOTA: Dopo aver aggiunto tutti i componenti, ruotare brevemente la provetta e raccogliere il campione durante una breve centrifugazione a 0,2 × g per un paio di secondi.
3. Incubare il tubo a 37 °C per 6 ore e controllare la fluorescenza su un lettore di piastre usando eccitazione a λ_ex = 470 nm ed emissione a λ_em = 510 nm ± 20 nm.
4. Immagini delle capsule su qualsiasi sistema LCSM utilizzando laser a 488 nm e 561 nm. Ottieni immagini della migliore qualità utilizzando l'obiettivo ad immersione in olio 100x e le diapositive camerate in vetro con copertura a 8 pozzetti.

Qui, lo studio affronta la funzionalità dei modelli di DNA che codificano diversi design di sensori (due tipi di elementi di trascrizione/traduzione regolati dall'RNA) dopo l'incapsulamento in capsule proteiche della seta. Le microcapsule sono state preparate tramite un assemblaggio Layer-by-Layer (LbL) modellato dei componenti chiave: uno strato primo, plasmidi di DNA che codificano i progetti dei sensori e biopolimero di fibroina di seta (Figura 2). La deposizione di macromolecole in modo stratificato consente di controllare la permeabilità della membrana della capsula in base alle interazioni inter- e intramolecolari tra gli strati assorbiti e lo spessore del guscio. La permeabilità sintonizzabile del sistema offriva il potenziale per controllare la diffusione di molecole essenziali limitando la diffusione di grandi macromolecole indesiderate attraverso la membrana della capsula²⁰.

Microcapsule di fibroina di seta di dimensioni omogenee (4,5 μm) e robuste con uno spessore del guscio di ~ 500 nm (20 strati) in uno stato idratato possono essere prodotte seguendo correttamente il protocollo (Figura 3) ²¹. L'approccio LbL ha permesso di sintonizzare la capacità di carico dei modelli di DNA in base alla concentrazione iniziale dei plasmidi. Il carico ottimale del DNA può essere ottenuto variando la concentrazione iniziale di modelli di DNA da 50-200 ng / μL. La Tabella 1 rappresenta il numero di copie di DNA conservate in una singola microcapsula al completamento dell'incapsulamento di LbL ed è stata calcolata per ciascun progetto di sensore in base alle concentrazioni iniziali di DNA e M_w dei plasmidi di DNA secondo l'equazione 1. La capacità di caricamento ottimale del DNA è stata raggiunta con 32 e 20 copie di DNA rispettivamente per i progetti di sensori ThyRS e BrocApt. La valutazione della capacità di carico era importante per avere una stima accurata delle concentrazioni di DNA incapsulato per poterlo titolare durante l'attivazione IVTT dei sensori aggiungendo campioni di capsule più concentrati.

La permeabilità dei gusci delle capsule può essere analizzata sistematicamente seguendo il metodo MWCO. Il metodo stima la dimensione dei pori della membrana in base al peso molecolare delle molecole di soluto che non potrebbero penetrare attraverso la membrana della capsula. Sottoponendo le microcapsule a molecole di fluoroforo M_w variabili ed eseguendo l'imaging confocale nel piano focale corrispondente al diametro maggiore tra più capsule, è possibile valutare la permeabilità delle membrane del guscio. L'analisi ImageJ consente di stimare le intensità di fluorescenza all'interno e all'esterno delle capsule e identificare membrane completamente permeabili (le intensità dei fluorofori all'esterno e all'interno erano comparabili), parzialmente permeabili (il 50%-70% delle capsule aveva una fluorescenza inferiore all'interno rispetto all'esterno) e non permeabili (l'intensità del fluoroforo interno era inferiore rispetto all'intensità esterna) (Figura 4). La conversione di M_w in raggio idrodinamico per ciascun fluoroforo consente di stimare la dimensione delle maglie della membrana della capsula (Tabella 2).

La permeabilità selettiva delle capsule proteiche può essere raggiunta durante l'ottimizzazione sistematica del protocollo di deposizione di LbL utilizzando concentrazioni variabili di uno strato primario (da 0-6 mg/ml), la concentrazione di una fibroina di seta (da 0,5-2 mg/ml) e il numero di strati depositati (da 10-25) fino a raggiungere una permeabilità ottimale. In questo protocollo, è stata raggiunta una permeabilità ottimale tra 25-32 nm con 6 mg/ml di PEI come strato primario e 20 strati di 1 mg/ml di fibroina di seta depositati durante l'assemblaggio di LbL (Figura 4). Questa gamma di permeabilità era ideale per consentire ai componenti del sistema IVTT di percolare attraverso l'involucro della capsula. Tipicamente, i più grandi complessi molecolari di qualsiasi sistema IVTT sono unità ribosomiali procariotiche, 30S e 50S, che, quando legate dall'mRNA in un complesso ribosomiale, possono raggiungere fino a ~ 20 nm in dimensione²². La struttura dei gusci delle microcapsule sviluppate assomiglia a una rete altamente intrecciata di strati di fibra di seta che sono fisicamente reticolati da blocchi di β fogli prodotti durante l'assemblaggio di LbL. Questa struttura di membrana è semipermeabile: altamente permeabile a piccole molecole (ad esempio, ioni, amminoacidi, peptidi, zuccheri, ecc.) e limitata a grandi molecole (ad esempio, proteine ad alto peso molecolare, glicoproteine, cellule, ecc.) che consente solo la percolazione di molecole con un raggio idrodinamico inferiore a 25 nm. Quindi, le microcapsule di fibroina di seta con carico ottimale del DNA e permeabilità della membrana possono essere utilizzate come vettori di bioreattori per l'attivazione IVTT.

L'attività trascrizionale e traslazionale dei sensori di progettazione ThyRS e BrocApt può essere testata utilizzando sistemi IVTT disponibili in commercio. ThyRS richiede l'attivazione traslazionale del gene reporter in presenza di ligando teofillina. L'attivazione del ThyRS sintetico comporta diversi passaggi per avviare l'espressione genica, tra cui la sintesi dell'mRNA, il cambiamento conformazionale della sequenza di mRNA dopo il legame all'analita, il rilascio del sito di legame del ribosoma e la sintesi della proteina GFPa1 reporter. Tutti questi passaggi richiedono la libera diffusione dei componenti IVTT attraverso la membrana della capsula. Il progetto proposto di microcapsule di fibroina di seta cariche di DNA ha migliorato i parametri di attivazione dei progetti di sensori regolati dall'RNA: sia la cinetica di espressione che l'output di fluorescenza erano significativamente più alti rispetto al DNA libero non immobilizzato (Figura 5A). L'imaging CLSM ha anche confermato il successo dell'attivazione del gene GFPa1 all'interno di capsule caricate con plasmidi di DNA che codificano sequenze ThyRS (Figura 5B-D).

In alternativa, l'attivazione del design del sensore BrocApt è stata effettuata nel sistema IVTT che supporta la trascrizione/traduzione accoppiata del promotore T7 E. coli in presenza di colorante DHFBI-1T. L'output di fluorescenza è stato avviato legando il colorante fluorogenico alla sequenza di mRNA. È importante sottolineare che il segnale di uscita dalle microcapsule di seta era parecchie volte superiore rispetto ai campioni di DNA non incapsulati di concentrazioni equivalenti (Figura 6). Pertanto, le microcapsule di fibroina di seta possono mantenere la funzionalità essenziale degli elementi del sensore codificati dal DNA, che possono essere importanti per la progettazione di nuovi tipi di piattaforme di biosensori in vitro per il rilevamento rapido e sensibile degli analiti di interesse.

Figura 1: Mappa dei plasmidi e sequenza di pSALv-RS-GFPa1 . (A) Il plasmide contiene la sequenza di riboswitch teofillina (ThyRS) posta a monte del gene codificante per GFPa1 sotto il controllo del promotore PTAC, il gene codificante per la β-lattamasi (bla), responsabile della resistenza all'ampicillina. (B) La sequenza del promotore ptac è mostrata in grassetto e sottolineata; La sequenza di riboswitch teofillina è mostrata in grassetto corsivo; La sequenza di codifica GFPa1 è mostrata in grassetto; Le sequenze dei siti di restrizione sono sottolineate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Panoramica della preparazione delle microcapsule utilizzando l'approccio Layer-by-Layer. I nuclei di SiO₂ incontaminati sono stati prima funzionalizzati con polimero PEI, seguito dalla deposizione sequenziale di plasmidi di DNA che codificano diversi design di sensori e strati di fibroina di seta fino a quando il numero desiderato di strati di proteine della seta è stato adsorbito. Microcapsule incontaminate cave contenenti vari progetti di sensori di DNA possono essere prodotte dissolvendo nuclei sacrificali. L'attivazione di ciascun progetto di biosensore incapsulato nella microcapsula può essere ottenuta durante le reazioni IVTT in presenza di ligandi corrispondenti. Questa figura è stata ristampata da Drachuk, I. et ^al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Studi di microscopia per microcapsule caricate con DNA. (A) Sezione trasversale 2D e (B) Immagini di microscopia confocale 3D renderizzate di microcapsule cave (SF)₂₀ caricate con plasmidi di DNA codificanti ThyRS (32 copie di DNA/capsula) e prodotte da 6 mg/mL di nuclei di SiO₂ innescati da PEI. L'autofluorescenza da capsule di fibroina di seta (canale DAPI, blu) e DNA colorato (canale FITC, verde) sono state applicate per identificare la localizzazione dei plasmidi del DNA e stimare lo spessore della membrana della capsula. L'inserto in (A) rappresenta i profili di intensità per il DNA e i gusci di fibroina di seta attraverso la capsula. Barra scala: 2 μm. L'inserto in (B) rappresenta il profilo di intensità per le proteine della seta attraverso l'involucro della capsula. Lo spessore della membrana è stato misurato come lunghezza a metà intensità di picco. L'elaborazione delle immagini in sezione trasversale e del rendering 3D è stata eseguita utilizzando il software di imaging NIS sul sistema Nikon C2⁺ . Questa figura è stata ristampata da Drachuk, I. et ^al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Stima della permeabilità della membrana per microcapsule di seta utilizzando il metodo MWCO. Immagini fluorescenti rappresentative CLSM selettive di microcapsule di fibroina di seta cava sottoposte a soluzioni FITC-Dextran di vari M_w (20 μM, diH₂O). Le capsule sono state preparate con un diverso numero di strati e concentrazioni di PEI. Un aumento della concentrazione di uno strato primario porta ad una maggiore stabilità colloidale delle microcapsule con gusci più permeabili, mentre l'eliminazione dello strato primario provoca l'aggregazione di capsule con membrane del guscio meno permeabili. Barra scala: 5 μm. Questa figura è stata ristampata da Drachuk, I. et ^al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Attivazione del design del sensore ThyRS in microcapsule di fibroina di seta. (A) Cinetica per l'espressione di GFPa1 durante l'attivazione di ThyRS da plasmidi di DNA caricati in microcapsule SF a 20 strati (linee di colore rosso) e controllo del DNA non incapsulato (linee di colore blu). Dall'alto verso il basso, le concentrazioni di DNA in un volume di campione (50 μL) erano 6,5 ng / μL, 4,5 ng / μL, 2,5 ng / μL e 0 ng / μL e corrispondono ai cambiamenti nelle intensità del colore. (B) Immagini CLSM di capsule di fibroina di seta caricate con 32 copie di DNA per capsula. Barra di scala: 5 μm. (C) L'immagine corrisponde ai profili di intensità della sezione trasversale corrispondenti all'immagine (B) su due capsule (linea bianca in B). La linea rossa rappresenta le capsule di seta e la linea verde rappresenta GFPa1 espressa in capsule. (D) L'immagine rappresenta capsule di seta 3D renderizzate caricate con 32 copie di DNA dopo l'incubazione nel sistema IVTT. La fluorescenza verde corrisponde al segnale GFPa1 e la fluorescenza rossa corrisponde agli strati di seta marcati con fluorescenza. Barra scala: 2 μm. L'attivazione di ThyRS è stata eseguita con teofillina (2 mM, DMSO) durante l'incubazione di microcapsule nel sistema IVTT (estratto S30). Questa figura è stata ristampata da Drachuk, I. et ^al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Attivazione di BroccApt in microcapsule di fibroina di seta. Il confronto della cinetica di trascrizione è stato eseguito per microcapsule di seta a 20 strati caricate con 30 copie di DNA per capsula (linee di colore rosso) e DNA di controllo non incapsulato (linee di colore blu). Dall'alto verso il basso, le concentrazioni di DNA incapsulato in un campione erano: 3,6 ng / μL, 2 ng / μL, 1 ng / μL e 0 ng / μL e corrispondono ai cambiamenti nelle intensità del colore. Le concentrazioni di DNA non incapsulato erano: 20 ng / μL, 10 ng / μL, 5 ng / μL e 0 ng / μL e corrispondono ai cambiamenti nelle intensità del colore. L'attivazione è stata eseguita con DHBFI-1T (100 μM, diH₂O) durante l'incubazione nel sistema PURE cell-free. Questa figura è stata ristampata da Drachuk, I. et ^al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Numero di copie del DNA per capsula per ciascun disegno del DNA. Il numero di copie è stato calcolato secondo l'equazione 1 ed è stato correlato alla concentrazione iniziale di plasmidi di DNA, all'affinità di ritenzione delle sequenze di DNA durante il processo di deposizione di LbL e alla lunghezza dei plasmidi di DNA.

Tabella 2: Proprietà fisiche dei fitc-destrani. Il raggio idrodinamico per ciascun fluoroforo è stato utilizzato per stimare la permeabilità delle microcapsule di fibroina di seta cava.

Le microcapsule di idrogel selettivamente permeabili caricate con vari tipi di sensori codificati dal DNA possono essere preparate seguendo questo protocollo. Una delle caratteristiche distintive dell'approccio LbL è la capacità di adattare la complessità delle microcapsule durante l'assemblaggio bottom-up, che di solito inizia con l'adsorbimento di specie molecolari su modelli sacrificali. Regolando attentamente le concentrazioni dei componenti iniziali, le condizioni di pH e il numero di strati, è possibile preparare microcapsule con diversi parametri di carico del DNA, funzionalità e permeabilità sintonizzabile²³. Al fine di amplificare la versatilità delle capsule, è possibile ottenere un'ulteriore funzionalizzazione della superficie del guscio con AuNP e IgG per implementare portatori di sensori biocompatibili per la diagnostica in vivo . Entrambi questi percorsi alternativi si basano sulla struttura molecolare unica della fibroina di seta. La riduzione in situ degli ioni Au³⁺ può essere ottenuta grazie alla presenza di residui di tirosina (5,3% mol.) in grado di ridurre gli ioni metallici in presenza di un tampone di riduzione ottimale. La coniugazione di anticorpi specifici alla superficie di microcapsule proteiche funzionalizzate da AuNPs può essere effettuata tramite l'implementazione della chimica di attivazione della carbodiimide. Entrambi questi passaggi richiedono un attento sviluppo e ottimizzazione del protocollo al fine di ottenere la corretta funzionalità delle capsule biosensore per applicazioni future. Ad esempio, per utilizzare queste microcapsule come sistemi di consegna "intelligenti", in cui un carico molecolare viene consegnato su stimoli specifici (come pH o segnali chimici), le proprietà specifiche di queste capsule dovrebbero essere caratterizzate e regolate, compresa l'efficienza di consegna, il tempo di ritenzione, la via di somministrazione e i trattamenti del modello di malattia.

Le microcapsule caricate con DNA sono state caratterizzate dalla tecnica CLSM e dalle misurazioni della fluorescenza. Tuttavia, altri metodi di caratterizzazione come la microscopia a forza atomica (AFM), la tomografia elettronica criogenica (CEM) e la microscopia a super-risoluzione a ricostruzione stocastica diretta (dSTORM) possono essere applicati per differenziare strutture specifiche delle microcapsule, comprese singole fibre, nanodomini e localizzazione dei plasmidi del DNA^24,25,26.

Il protocollo sviluppato evidenzia l'uso del biopolimero di fibroina di seta come materiale di rete biocompatibile che preserva la struttura terziaria dei plasmidi di DNA caricati. La stabilità delle sequenze di DNA immobilizzato all'interno della rete di fibroina della seta avviene tramite interazioni idrofobiche e/o legami idrogeno, che forniscono un microambiente protettivo contro l'inattivazione del pH, l'ossidazione o l'idrolisi²⁷. Inoltre, i domini β-cristallini della fibroina della seta forniscono una barriera meccanica unica, limitando il movimento delle macromolecole intrappolate e impedendo ai plasmidi del DNA di degradarsi durante lo stoccaggio in soluzioni acquose.

La natura semipermeabile delle microcapsule di fibroina di seta caricate con modelli di DNA ha creato condizioni spaziali e fisico-chimiche uniche per le reazioni IVTT. L'aptamero e il riboswitch dell'RNA attivati trascrizionalmente e traslazionalmente immobilizzati in microcapsule di fibroina di seta sono stati in grado di produrre un segnale di uscita almeno tre volte superiore rispetto ai sensori liberi non immobilizzati. Inoltre, l'immobilizzazione dei modelli di DNA in microcapsule può migliorare significativamente l'attività dei sensori incapsulati oltre il limite di rilevamento di quelli non incapsulati. Mentre i sensori non incapsulati avevano una risposta minima a basse concentrazioni di DNA, i sensori incapsulati avevano una risposta di output molto distinta, che può essere facilmente titolata per riflettere i sottili cambiamenti nelle concentrazioni di DNA. Il miglioramento del segnale di risposta dei reporter incapsulati era probabilmente dovuto alla diffusione illimitata dei componenti del macchinario IVTT e alla ridotta mobilità dei plasmidi del DNA. Diversi studi hanno riconosciuto che la resa della sintesi proteica nelle reazioni libere da cellule dipende dall'ambiente macromolecolare^28,29. L'immobilizzazione dei plasmidi del DNA nella rete della seta ha fornito un ambiente confinato efficace limitando il movimento degli oligonucleotidi e accelerando le reazioni del meccanismo di trascrizione / traduzione anche da diverse copie del DNA²¹.

Mentre il metodo LbL fornisce un approccio molto versatile per costruire assemblaggi multifunzionali in modo controllabile, la procedura di fabbricazione richiede relativamente tempo e in genere richiede aggiustamenti di elaborazione per aumentare la resa delle microcapsule. Un'altra considerazione nella realizzazione di microcapsule a base di biomolecole è la compatibilità di un dato sistema con il requisito per la dissoluzione del nucleo dopo che la deposizione di LbL è completata. Finora, per produrre microcapsule cariche di DNA a base di seta cave omogenee e robuste, i gusci sono stati depositati su modelli di nucleo di silice sacrificale (SiO₂), che hanno richiesto la successiva rimozione mediante incisione con acido fluoridrico (HF). Né la manipolazione o l'incisione HF sono considerati processi biocompatibili, limitando il loro uso diffuso in applicazioni pratiche. L'alternativa ai modelli colloidali inorganici di SiO₂ , i nuclei di carbonato sono tipicamente inerti nella formazione di complessi con strati polimerici e possono essere sciolti in condizioni miti utilizzando acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Tuttavia, la regolazione dei core sacrificali può influire sulle proprietà di deposizione dei multistrati e sull'integrità della struttura del guscio, che richiede un'ulteriore ottimizzazione del protocollo.

In sintesi, l'attuale protocollo consente la preparazione di microcapsule cariche di DNA a base di seta con diversi design di sensori. La combinazione di un microambiente confinato fornito dal metodo LbL e l'uso della fibroina di seta come materiale biocompatibile ha migliorato le proprietà sensoriali del DNA incapsulato. Con il rapido sviluppo della tecnologia dell'aptamero di RNA fluorogenico, il potenziale uso di microcapsule di seta cariche di DNA può essere esteso alla diagnostica in vitro multiplexata. Recentemente, diverse varianti di aptameri fluorescenti basati su RNA sono emerse come potente tecnologia priva di fondo per l'imaging dell'RNA in cellule vive con elevata sensibilità al rapporto segnale-rumore^30,31. Applicando la nanotecnologia dell'RNA sintetico per progettare aptameri di RNA artificiale, le proprietà fluorogeniche degli aptameri possono essere sfruttate per rilevare specifici ligandi di interesse. Questa tecnologia sarà particolarmente preziosa per monitorare i biomarcatori di interesse in diversi formati, tra cui sensori cartacei per punti di utilizzo, cerotti a base di idrogel per il sudore o il liquido interstiziale e materiali impiantabili.

I punti di vista e le opinioni qui presentati sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente i punti di vista del DoD o dei suoi componenti.

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione LRIR 16RH3003J dell'Air Force Office of Scientific Research, nonché dal programma Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) dell'Ufficio del Sottosegretario alla Difesa degli Stati Uniti per la Ricerca e l'Ingegneria.

La sequenza del vettore plasmidico per ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) è stata generosamente fornita dal Dr. J. Gallivan. I bozzoli del baco da seta di Bombyx mori sono stati generosamente donati dal Dr. D.L. Kaplan della Tufts University, MA.