Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) sintetiza DNA oligospermia, não só mas também double-stranded do RNA através da atividade da RNA polimerase RNA-dependente. Aqui, descrevemos um ensaio recém-criada para detectar atividade de RNA polimerase RNA-dependente de TERT endógena.

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) é a subunidade catalítica da telomerase, e se alonga o telômero através da atividade da DNA polimerase RNA-dependente. Embora TERT é nomeado como um transcriptase reversa, análises estruturais e filogenéticas de TERT demonstram que TERT é um membro dos polymerases destros e refere-se à polimerase de RNA-dependente do RNA viral (RdRPs) bem como viral transcriptase reversa. Em primeiro lugar identificamos RdRP atividade de TERT humana que gera o RNA complementar suporta um modelo de RNA não-codificante e contribui para RNA silenciar em células cancerosas. Para analisar essa atividade enzimática não-canônicos, nós desenvolvido RdRP ensaio com terc recombinante em 2009, posteriormente, estabelecido em vitro RdRP ensaio para TERT endógena. Este manuscrito, descrevemos o último método. Brevemente, imunocomplexos TERT são isolados de células e incubados com modelo de RNA e rNTPs incluindo rNTP radioativo para reação RdRP. Para eliminar o single-stranded do RNA, produtos de reacção são tratados com RNase I e os produtos finais são analisados com eletroforese em gel de poliacrilamida. Radiolabeled RdRP produtos podem ser detectados por autoradiografia após exposição durante a noite.

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) é conhecido como a subunidade catalítica da telomerase, e se alonga o telômero usando o componente de RNA telomerase (TERC), o RNA específico do modelo¹. Embora TERT polimeriza DNA oligospermia como um componente da telomerase, as análises filogenéticas e estruturais indicam que TERT está intimamente relacionado com a polimerase de RNA-dependente do RNA viral (RdRPs), bem como viral transcriptase reversa e compartilha os domínios com Estes polymerases^2,3,4. RdRP é a enzima que gera a cadeia de RNA complementar para um modelo de RNA. A enzima é codificada não só em vírus, mas também em organismos-modelo, tais como a planta, o fermento e o worm, e síntese de RNA double-stranded por RdRP contribui para transcricional e pós-transcricional silenciamento nestes organismos^5,6 . Embora RdRP humano tinha desaparecido há muito tempo, encontramos a RdRP atividade em TERT humana em 2009⁷.

Nós primeiro confirmou a RdRP atividade de TERT com proteína recombinante⁷, em seguida, estabeleceu um ensaio sensível em vitro para detectar atividade RdRP de endógena TERT⁸. Aqui, demonstramos o em vitro RdRP ensaio (ensaio de IP-RdRP) para TERT endógena. Este método começa com imunoprecipitação (IP) de TERT endógena e é seguido por em vitro RdRP reação, na qual ribonucleotídeos radioactivos são incorporados em vertentes de RNA nascentes.

1. reagente Setup

1. Reagentes utilizados para sincronização do celular
   1. Para gerar médio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) contendo timidina 2,5 mM, dissolva 30,28 mg de timidina por 1 mL de água de grau de cultura de tecidos para preparar timidina 125 mM. Filtra a solução com uma unidade de filtro de seringa 0,22 do μm. Adicione 1 mL do thymidine 125mm recentemente preparada por 50 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal bovino (FBS).
   2. Para gerar DMEM contendo 0,1 μg/mL de nocodazole, dissolva nocodazole em dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar 5 μg/μL nocodazole. Adicionar 1 µ l de 5 µ g / µ l nocodazole por 50 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS.
   3. Para gerar DMEM contendo 0,002% (vol/vol) de DMSO, adicione 1 µ l de DMSO por 50 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS.
2. Reagentes utilizados para o ensaio do IP-RdRP
   1. Prepare-se do lysis buffer r: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) e 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Armazenar o reagente a 4 ° C.
   2. Prepare-se 5 x tampão de acetato: ácido 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic de 50mm (HEPES)-KOH (pH 7,8), acetato de potássio de 500 mM e 20 mM MgCl₂. Armazene os reagentes à temperatura ambiente.
   3. Preparar o tampão de acetato de 1: 1 x de tampão de lavagem, glicerol 10% (vol/vol), 0,1% (vol/vol) Triton x X-100 e 0.06 inibidor da protease cocktail, ácido ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-gratuito. Prepare o tampão de lavagem 1 dia útil ou no dia antes do uso. Armazenar o reagente a 4 ° C.
   4. Preparar a solução AGC: 1x tampão de acetato, glicerol 10% (vol/vol) e 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (CAPS). Armazenar o reagente a 4 ° C.
   5. Para gerar solução AGC contendo 2 mM CaCl₂, adicione 100 µ l de 1 M CaCl₂ por 50 mL da solução AGC. Armazenar o reagente a 4 ° C.
   6. Para gerar AGC solução contendo bis de etileno glicol de 3mm (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA), adicione 375 µ l de 0,4 M EGTA (pH 7,5) por 50 mL da solução AGC. Armazenar o reagente a 4 ° C.
   7. Prepare o tampão de acetato de 2: 1 x de tampão de lavagem e rachaduras de 0,02% (wt/vol). Armazenar o reagente a 4 ° C.
   8. Preparar a solução HMD: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl₂ e 2 mM ditiotreitol (DTT). Armazenar o reagente a-20 ° C.
      Nota: Solução HMD deve ser renovada pelo menos em três meses.
   9. Prepare 2 x buffer de Proteinase K: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de EDTA e 1% (wt/vol) Dodecil sulfato de sódio (SDS). Armazenar o reagente a-20 ° C.
   10. Prepare 2 x tampão de carregamento: 95% (vol/vol) formamida, 20 mM de EDTA e 1% (wt/vol) laranja G. armazenam o reagente a-20 ° C.

2. preparação de células HeLa

Nota: Preparar células HeLa sincronizada na fase mitótica (manipulado) ou dividir de forma assíncrona (unmanipulated). Cultura de células na presença de 5% de CO₂ a 37 ° C.

1. Sincronização de células HeLa em mitose
   1. Placa 1 x 10⁶ células HeLa com 10 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS em um prato de cultura de 10 cm.
   2. Dois dias depois de chapeamento, substitua o médio com 10 mL de DMEM contendo timidina 2,5 mM e 10% (vol/vol) FBS. Cultura de células para 24h.
   3. Lavar as células três vezes com 10ml de soro de tampão fosfato (PBS) (-) e cultura de células com 10 mL de DMEM contendo 10% (vol/vol) FBS para 6 h.
   4. Substituir o médio com 10 mL de DMEM contendo 0,1 µ g/mL de nocodazole e 10% (vol/vol) FBS e cultura de células para 14 h.
   5. Agite o prato de cultura e recuperar o sobrenadante contendo as células mitóticas desanexadas. Conte o número de celular para o ensaio de IP-RdRP.
   6. Centrifugar a amostra a 490 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
      Nota: O centrifugado pode ser armazenado a-80 ° C.
2. Preparação de unmanipulated células HeLa
   1. Placa 1 x 10⁶ células HeLa com 10 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS em um prato de cultura de 10 cm.
   2. Dois dias depois de chapeamento, substitua o médio com 10 mL de DMEM com 10% (vol/vol) FBS. Cultura de células para 30 h.
   3. Substituir o médio com 10 mL de DMEM contendo 0,002% (vol/vol) DMSO e 10% (vol/vol) FBS e cultura de células para 14 h.
   4. Colete as células por tripsinização usando 0,7 mL de tripsina (2,5 g/L), contendo 1 mM EDTA. Conte o número de celular para o ensaio de IP-RdRP.
   5. Centrifugar a amostra a 490 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
      Nota: O centrifugado pode ser armazenado a-80 ° C.

3. IP-RdRP ensaio

1. Preparação de grânulo proteína A-agarose
   1. Transferi 1 mL (cama volume 500 µ l) de resina de afinidade para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Centrifugar a 800 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
   2. Adicionar 800 µ l de tampão de Lise aos talões e misture bem o tubo várias vezes por inversão. Centrifugar a 800 x g durante 3 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes (totais três lavagens).
   3. Adicione a 800 µ l de tampão de Lise aos talões, misture bem o tubo várias vezes por inversão. Gire o tubo durante a noite (ou pelo menos 4 h) a 4 ° C em um agitador rotativo.
   4. Centrifugar o tubo a 800 x g durante 3 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
   5. Adicione 500 µ l de tampão de Lise aos talões e misture bem o tubo várias vezes por inversão. Armazenar os grânulos a 4 ° C.
2. Preparação de lisado celular
   1. (Opcional) Se as células são congeladas no passo 2, coloque e descongelar as células congeladas no gelo até as células tornam-se solto.
   2. Lave as células uma vez com 10 mL de PBS (-). Centrifugar a amostra a 1.450 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
   3. Lise as células com tampão de Lise gelada um (1 mL de tampão de Lise A por 1 x 10⁷ das células) pipetando suave.
   4. Proceda à sonicação a amostra em um tubo de 1,5 mL com as seguintes condições; conjunto de amplificação do sonicador em 25% e proceda à sonicação durante 10 s.
   5. Centrifugar a amostra a 20.400 x g durante 15 min a 4 ° C.
   6. Recolha o sobrenadante. Transferi 1 mL do sobrenadante para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL.
      Atenção: Execute todos os procedimentos em condições de livre de RNase.
3. Imunoprecipitação
   1. Pre-Limpe o lisado de passo 3.2.6 adicionando 40 µ l (grânulo volume 20 µ l) de grânulos de agarose-A proteína lavada por 1 mL do lisado. Misture bem o tubo várias vezes por inversão e girar a amostra por 30 min a 4 ° C.
   2. Centrifugar a amostra a 13.000 x g por 1 min a 4 ° C e recuperar o sobrenadante.
   3. Adicionar 40 µ l (cama volume 20 µ l) de grânulos de proteína lavada A-agarose e 10 µ g de anticorpo TERT anti-humano (clone: 10E9-2)⁸ para o pre-apuradas lisado. Misture bem o tubo várias vezes por inversão e girar a amostra a 4 ° C durante a noite.
   4. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.
   5. Lave os grânulos com tampão de lavagem 1: adicionar 1 mL de tampão de lavagem 1 aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Repita mais três vezes.
   6. Lave os grânulos de uma vez com solução AGC contendo 2 mM CaCl₂: adicionar 1 mL de solução AGC contendo 2 mM CaCl₂ aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.
   7. Tratar os grânulos com nuclease Micrococcal (MNase): prepare a mistura de reação MNase descrita na tabela 1. Resuspenda as contas em 60 µ l da mistura de reação MNase pipetando suave. Agite a amostra (20 a 25 rpm) em uma plataforma giratória de um agitador definido em uma incubadora de Peltier-tipo para min 15 a 25 ° C.
      Nota: É muito importante usar um agitador ondulante e seguir rigorosamente o limite de velocidade nesta etapa. Outro tipo de abanadores, tais como misturadores rotativos, não são recomendados.
   8. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.
   9. Lave os grânulos duas vezes com a solução de AGC 3mm EGTA: adicionar 1 mL de solução AGC contendo 3 mM EGTA aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
   10. Lave os grânulos uma vez com o tampão de lavagem 2: adicionar 1 mL de tampão de lavagem 2aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Manter os grânulos no gelo durante a criação de reação RdRP.
       Atenção: Execute todos os procedimentos em condições de livre de RNase.
4. Reação de RdRP
   1. Prepare uma mistura de reação de RdRP em um novo tubo conforme descrito na tabela 2.
   2. Adicione 6 µ l de [α -³²P] UTP (3.000 Ci/mmol) para a mistura e misture bem por pipetagem.
      Nota: ATP [α -³²P], [α -³²P] CTP ou GTP [α -³²P] pode ser usado para a reação ao invés de [α -³²P] UTP.
   3. Adicionar 1 µ l do modelo de RNA (1 µ g / µ l) para a mistura e misture bem por pipetagem.
      Nota: Para estabelecer o RdRP ensaio, o seguinte modelo de RNA é recomendado: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' ⁹.
   4. Resuspenda as contas com 20 µ l da mistura de reação de RdRP da etapa 3.4.3 pipetando.
   5. Agite a amostra (20 a 25 rpm) em uma plataforma giratória de um agitador definido em uma incubadora de peltier-tipo para h 2 a 32 ° C.
   6. Adicione 5,4 µ l de Proteinase K (20 mg/mL) e 45,4 µ l de tampão de Proteinase K x 2 a mistura de reacção. Misture por pipetagem e shake (rpm de 20 a 25) a amostra em uma plataforma giratória definida em uma incubadora de Peltier-tipo por 30 min a 37 ° C.
   7. Adicione 109,2 µ l de água livre de RNase para a amostra.
   8. Adicione 200 µ l de ácido fenol-clorofórmio para a amostra. Misture bem por vórtice e centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Transferi a fase aquosa para um novo tubo. Repita este passo uma vez.
   9. Adicionar 20 μL de acetato de sódio 3M (pH = 5,2), 4 µ l de transportadora de precipitação e 250 µ l de etanol na fase aquosa. Agitar o tubo bem para misturar e, em seguida, centrifugar a amostra a 21.100 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
   10. Lave o pellet com 300 µ l de álcool etílico (vol/vol) 70% frio armazenado a-20 ° C. Centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 15 min a 4 ° C.
   11. Desprezar o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota.
       Atenção: Execute todos os procedimentos em condições de livre de RNase.
       Nota: A pelota da etapa 3.4.11 pode ser armazenada a-20 ° C durante pelo menos 2 dias.
5. Tratamento de RNase
   1. Resuspenda o pellet de passo 3.4.11 em 20 µ l de água livre de RNase.
   2. Prepare uma mistura de reação de RNase em um novo tubo conforme descrito na tabela 3.
   3. Adicionar 180 µ l da mistura de reação de RNase para a amostra e incubar o tubo para 2 h a 37 ° C.
   4. Adicionar 2,3 µ l de SDS 10% (vol/vol) para a amostra e incube por 15 min a 37 ° C.
   5. Adicionar 2 µ l de Proteinase K (20 mg/mL) para a amostra e incube por 15 min a 37 ° C.
   6. Adicione 205 µ l de ácido fenol-clorofórmio para a amostra. Mistura bem pelo vórtice, centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Transferi a fase aquosa para um novo tubo.
   7. Adicione 20 μL de acetato de sódio 3M (pH 5.2), 4 µ l da transportadora de precipitação e 250 µ l de etanol na fase aquosa. Agitar o tubo bem para misturar e, em seguida, centrifugar a amostra a 21.100 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
   8. Lave o pellet com 300 µ l de álcool etílico (vol/vol) 70% frio armazenado a-20 ° C. Centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 15 min a 4 ° C.
   9. Desprezar o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota.
      Nota: A pelota da etapa 3.5.9 pode ser armazenada a-20 ° C durante pelo menos 2 dias.
6. Autoradiografia e eletroforese em gel
   1. Resuspenda a amostra com 20 µ l de água livre de RNase.
   2. Adicione 20 µ l de 2 x tampão de carregamento.
   3. Ferva a amostra durante 10 minutos a 95 ° C. Esmaga a amostra no gelo.
   4. Funcione o gel. No caso o tamanho do modelo 34 nts (ver também passo 3.4.3), gel de poliacrilamida 7 M ureia - 10% é usado na electroforese do gel de desnaturação.
   5. Seca o gel com um secador de gel.
   6. Expor o filme com o gel seco dentro de uma gaveta de raio-x com uma intensificação da tela a-80 ° C.

Com o modelo recomendado de RNA, radioativo RdRP produtos são observados entre 20 a 30 nucleotídeos (nt), especificamente em células HeLa na fase mitótica após a exposição durante a noite (figura 1A). Normalmente, a intensidade do sinal dos produtos RdRP demonstra dois picos que são posicionados em torno de 25 nt e 30 nt em consonância com a distribuição de tamanho dos produtos confirmado pela próxima geração de sequenciamento⁹. Em contraste com células mitóticas, células HeLa sem sincronização demonstram quase ausência dos produtos radioactivos nt 20 – 30. Oval de sinais, que são colocados abaixo de 20 nt em todas as amostras, são inespecíficas trações.

No caso de que há apenas um produto nt ~ 30 com sinal fraco em células mitóticas HeLa, indica que a reação de RdRP não correu bem. Por exemplo, se MNase tratamento é realizado aproximadamente e inadequadamente, a intensidade de sinal em HeLa mitótica células diminui significativamente (figura 1B). RdRP reação realizada com solução antiga HMD também reduz os produtos (Figura 1).

Figura 1 : Representante RdRP produtos de TERT endógena em células mitóticas HeLa. (A) três resultados representativos do IP-RdRP ensaio em células HeLa tratadocom com nocodazole (manipulado) ou DMSO (unmanipulated). O 34 quimicamente sintetizado nt RNA foi usado como um modelo. (B) IP-RdRP ensaio em células HeLa mitóticas realizadas com tratamento inadequado de MNase. (C) IP-RdRP ensaio em células HeLa mitóticas realizada com solução HMD fresca ou velha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: MNase componente de mistura de reação.

Tabela 2: RdRP componente de mistura de reação.

Tabela 3: Componente de mistura de reação Ribonuclease.

O ensaio de RdRP-IP é um método sensível para detectar atividade RdRP de TERT humana. Proteína TERT é altamente expressa em células mitóticas HeLa, no qual TERT constitui a RdRP complexo^8,9,10. Isto sugere que células mitóticas HeLa são um material ideal para detectar atividade RdRP. O protocolo descrito acima, as células HeLa mitóticas e não-sincronizadas estão incluídas como um positivo e um exemplo negativo, respectivamente. Como mostrado na figura 1A, produtos de ensaio RdRP desde o modelo recomendado de RNA em células mitóticas HeLa mostram sinais radioativos amplos entre 20 a 30 nt. Além de células HeLa, temos realizado o ensaio com diferentes tipos de linhagens celulares e encontrado que o padrão do sinal pode ser alterado na célula diferentes tipos⁹: algumas mostram um sinal forte apenas cerca de 30 nt, alguns mostram um padrão similar com as células HeLa. Nós também ter realizado o ensaio com modelos de RNA que não sejam o 34 nt modelo⁸, curta e longa (~ 300 nt) RNAs com várias sequências e com êxito obtido RdRP produtos desses modelos apesar de haver alguma preferência. Para o primeiro julgamento, no entanto, nós recomendamos usar as células HeLa na fase mitótica e a modelo nt RNA 34. RdRPs pode gerar RNA double-stranded em um primeira demão-dependente e em uma maneira independente da primeira demão de¹¹. Informamos que a TERT preserva esta propriedade como humano RdRP^97,; TERT sintetiza dsRNA de um modelo de RNA com 3'-foldback estrutura através de um mecanismo de costas-ferragem⁷. Para o modelo nt RNA 34, TERT sintetiza costas complementares sem usar primers⁹. Para detectar especificamente a RdRP produtos sintetizados em uma forma independente de cartilha, ou seja, de novo sintetizada RNA produtos, [α -³²P] NTP pode ser substituído com [γ -³²P] NTP na reação RdRP⁹.

MNase tratamento de complexos imunes TERT em grânulos é um passo fundamental para alcançar os resultados desejados. Se o tratamento MNase é executado muito tempo ou com intensa agitação, os produtos RdRP seria reduzidos notavelmente. Para evitar tais problemas, recomendamos fortemente a seguir rigorosamente o protocolo cuidadosamente. Solução HMD é outro fator crítico para o sucesso. Se você encontrar que os sinais são muito fracos, substitua a solução HMD para um recém preparada.

Em todo o protocolo, um deve tomar muito cuidado para evitar a contaminação de RNase. Tratamento de ribonuclease deve ser realizado com equipamento dedicado. Após manipular a Ribonuclease, um deve descartar dicas e tubos com RNase imediatamente, eliminam RNase com solução especializada (por exemplo, RNase quieto) e alterar groves.

TERT interage não só com TERC mas também de muitos tipos de RNAs endógenos, e registramos parte deles⁷. Modificação no ensaio de IP-RdRP, tais como o ensaio de IP-RdRP sem tratamento MNase, irá fornecer uma lista completa de modelos de RNA endógenas para o guia de atividade e bioinformatic RdRP TERT-associado em suas características de sequência. Nós tem aplicado com sucesso este protocolo ao tecido lisado. Porque TERT é expresso em uma variedade de tecidos normais e tumor, este ensaio pode ser útil para investigar a função enzimática não-canônicos de TERT em humanos.

Os autores não têm nada para divulgar.

Este trabalho foi financiado em parte pelo projeto para desenvolvimento de pesquisas inovadoras sobre câncer Therapeutics (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) e o projeto para pesquisa do câncer e evolução terapêutica (P-criar) (16cm 01061150001, K.M.) da agência do Japão para a pesquisa médica e desenvolvimento, AMED; a Fundação de ciência Takeda (Y.M.); Concessão do fundo de pesquisa do câncer de princesa Takamatsu (13-24520, Y.M.); e JSPS KAKENHI Grant número JP16K07133 (Y.M.).