テロメラーゼ逆転写酵素蛋白質の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性の半定量的な検出

テロメラーゼ逆転写酵素 (TERT) は、テロメア DNA だけでなく、RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ活性を二本鎖 RNA を合成します。ここでは、内因性の TERT の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性を検出する新しく設立されたアッセイについて述べる。

テロメラーゼ逆転写酵素 (TERT) は、テロメラーゼの触媒サブユニットとそれは RNA 依存性 DNA ポリメラーゼ活性を介してテロメアを伸長します。TERT は逆転写酵素として示されて、TERT の構造と系統解析 TERT は右利きのポリメラーゼのメンバーであり、ウイルス逆転写酵素だけでなく、ウイルスの RNA 依存した RNA ポリメラーゼ (RdRPs) に関連していることを示しています。まず相補的な RNA を生成する人間の TERT の活動、非コード RNA テンプレートに立ち上がってがん細胞における RNA サイレンシングに寄与する酵素を同定しました。この非正規の酵素活性を分析するには、は、2009 年の組換え TERT と酵素アッセイを開発、その後内因性 TERT の体外酵素アッセイを設立しました。本稿では、後者の方法をについて説明します。簡単に言えば、TERT 免疫複合体は、細胞から隔離され、テンプレート RNA と酵素反応の放射性 rNTP を含む rNTPs 培養します。一本鎖 RNA をなくすため、反応生成物は、および最終製品はポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した RNase と扱われます。一晩放置後オートラジオグラフィによる標識酵素製品を検出できます。

テロメラーゼ逆転写酵素 (TERT) は、テロメラーゼの触媒サブユニットとしてよく知られている、それはテロメラーゼ RNA コンポーネント (陸)、特定の RNA テンプレート¹を使用してテロメアを伸長します。TERT はテロメラーゼの部品としてテロメア DNA を重合が構造および系統学的解析ことを示し TERT はウイルスの逆転写酵素と同様に、ウイルスの RNA 依存した RNA ポリメラーゼ (RdRPs) と密接に関連を持つドメインを共有これらのポリメラーゼ^2,3,4。RdRP は、テンプレート RNA に相補的な RNA 鎖を生成する酵素であります。ウイルスだけでなく、植物、酵母、ワーム、等のモデル生物でも、酵素はエンコードされ、二本鎖 RNA 合成酵素の転写と転写後の遺伝子サイレンシングこれら生物^{5,6 に貢献}.人間の酵素は長い間行方不明になっていた、我々 RdRP 活動 2009 年⁷で人間 TERT に発見します。

組換え蛋白質の⁷TERT の RdRP アクティビティを確認まず、内因性の TERT⁸の酵素活性を検出する高感度の in vitroアッセイを確立に。ここでは、体外酵素アッセイ (IP 酵素試金) 内因性 TERT の紹介します。このメソッドは、内因性 TERT の免疫沈降 (IP) を開始し、初期の RNA 鎖に組み込まれている放射性リボヌクレオチドの酵素反応体外が続きます。

1. 試薬のセットアップ

1. セルの同期に使用される試薬
   1. ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 2.5 mM チミジンを含む、生成するには、125 mM チミジンを準備する組織培養グレードの水の 1 mL あたりチミジンの 30.28 mg を溶解します。0.22 μ m シリンジ フィルター ユニットを備えたソリューションをろ液します。作りたての 125 mM チミジン (巻/巻) 10% 牛胎児血清 (FBS) を DMEM の 50 mL あたりの 1 つの mL を追加します。
   2. ノコダゾールを 0.1 μ g/mL を含む DMEM を生成するには、ノコダゾール ジメチルスルホキシド (DMSO) 5 μ g/μ L ノコダゾールを準備するを溶解します。10% (巻/巻) FBS 添加 DMEM の 50 mL あたり μ L ノコダゾール/5 μ g の 1 μ L を追加します。
   3. DMSO の 0.002% (巻/巻) を含む DMEM を生成、DMSO 50 mL の 10% (巻/巻) FBS DMEM のあたり 1 μ L を追加します。
2. IP 酵素アッセイ用試薬
   1. 換散バッファー a: 150 mM の NaCl、20 mM トリス-HCl (pH 7.4) の準備と 0.5% (巻/巻) ノニデット P-40 (NP-40)。4 ° C で試薬を格納します。
   2. 酢酸緩衝液 × 5 を準備: 50 ミリメートル 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic 酸 (HEPES)-島 (pH 7.8)、酢酸カリウム 500 mM と 20 mM の MgCl₂。室温で試薬を格納します。
   3. 洗浄バッファー 1:1 x 酢酸緩衝液、10% (巻/巻) グリセロール、0.1% (巻/巻) トリトン X-100 と 0.06 倍プロテアーゼ抑制剤のカクテル、ethylenediamenetetraacetic 酸 (EDTA) の準備-無料。使用日または使用する前に日に洗浄バッファー 1 を準備します。4 ° C で試薬を格納します。
   4. AGC ソリューションを準備: 酢酸緩衝液、10% (巻/巻) グリセロール、0.02% (重量/巻) 3 [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio x 1]-1-propanesulfonat (チャップス)。4 ° C で試薬を格納します。
   5. AGC 溶液 2 mM CaCl₂を生成するには、AGC ソリューション 50 mL 当たり 1 M CaCl₂の 100 μ L を追加します。4 ° C で試薬を格納します。
   6. 3 mM エチレングリコールビス (b aminoethylether) を含む AGC ソリューションを生成する-N, N, N', N'-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、AGC 溶液 50 mL あたり 0.4 m グリコールエーテルジアミン四酢酸 (pH 7.5) 375 μ L を追加。4 ° C で試薬を格納します。
   7. 洗浄バッファー 2:1 x 酢酸と 0.02% (重量/巻) チャップスを準備します。4 ° C で試薬を格納します。
   8. HMD のソリューションの準備: 0.2 MgCl₂ 40 mM と 2 mM ジチオトレイトール (DTT) M HEPES 島 (pH 7.8)。-20 ° C で試薬を格納します。
      注: HMD のソリューションは、3 カ月で少なくとも書き換える必要があります。
   9. プロティナーゼ K バッファー x 2 の準備: 20 mM トリス-HCl (pH 7.6)、20 ミリメートルの EDTA および 1% (重量/巻) ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS)。-20 ° C で試薬を格納します。
   10. バッファー x 2 の準備: 95% (巻/巻) ホルムアミド、20 ミリメートルの EDTA および 1% (重量/巻) オレンジ g. 保存-20 ° C で試薬

2. HeLa 細胞の調製

注: 準備 HeLa 細胞分裂期 (操作) または非同期的に分割することで同期 (たがる)。37 ° C で 5% CO₂の存在下での細胞を培養します。

1. 有糸分裂の HeLa 細胞の同期
   1. 10% (巻/巻) 10 cm の培養皿で FBS DMEM の 10 mL で 1 × 10⁶の HeLa 細胞をプレートします。
   2. メッキ後、2 日間は、10 ml の 2.5 mM チミジンおよび 10% (巻/巻) FBS を含む DMEM の媒体を交換します。24 h の細胞を培養します。
   3. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (-)、10 mL で 3 回細胞を洗浄し、10 ml の 10% (巻/巻) FBS 6 h を含む DMEM の細胞の培養します。
   4. 10 mL を 0.1 μ g/mL ノコダゾールと 10% (巻/巻)、政府短期証券を含む DMEM 培地に置き換えるし、14 時間の細胞の培養します。
   5. 培養皿を振盪し、上清戸の分裂期の細胞を含むを取得します。IP 酵素試金のためのセル数をカウントします。
   6. 490 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、上澄みを廃棄します。
      注意: 細胞ペレットは-80 ° C で保存することができます。
2. 非操作 HeLa 細胞の調製
   1. 10% (巻/巻) 10 cm の培養皿で FBS DMEM の 10 mL で 1 × 10⁶の HeLa 細胞をプレートします。
   2. メッキ後、2 日間は 10% (巻/巻) FBS を含む DMEM の 10 mL で媒体を交換します。30 h の細胞を培養します。
   3. 0.002% (巻/巻) DMSO および 10% (集集)、FBS を含む DMEM の 10 mL で媒体を交換し、14 時間の細胞の培養します。
   4. トリプシン (2.5 g/L) 1 mM EDTA を含む 0.7 ml trypsinization によって細胞を収集します。IP 酵素試金のためのセル数をカウントします。
   5. 490 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、上澄みを廃棄します。
      注意: 細胞ペレットは-80 ° C で保存することができます。

3. IP 酵素アッセイ

1. タンパク質 A アガロース ビーズ準備
   1. 親和性の樹脂の 1.5 mL 遠心チューブに 1 mL (ベッド ボリューム 500 μ L) を転送します。4 ° C で 5 分間 800 × gで遠心分離し、上澄みを廃棄します。
   2. 、ビーズに換散バッファー A の 800 μ L を追加し、チューブを数回反転でよく混ぜます。4 ° C で 3 分間 800 × gで遠心分離し、上澄みを廃棄します。2 回 (合計 3 つ洗浄) この手順を繰り返します。
   3. ビーズに換散バッファー A の 800 μ L を追加、数回チューブを反転でよく混ぜます。シェーカーに 4 ° c のチューブを回転させて一晩 (または、少なくとも 4 時間のため)。
   4. 4 ° C で 3 分間 800 x gでチューブを遠心し、上澄みを廃棄します。
   5. 、ビーズに換散バッファー A の 500 μ L を追加し、チューブを数回反転でよく混ぜます。4 ° C でビーズを格納します。
2. 細胞ライセートの調製
   1. (省略可能)手順 2 でセルが固定されている場合、セルがルーズになるまで氷の上凍結細胞を解凍を置き。
   2. 10 mL の PBS (-) で一度セルを洗浄します。1,450 × g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心分離し、上澄みを廃棄します。
   3. 穏やかなピペッティングで冷たいの換散バッファー (1 mL あたり 1 x 10 の⁷セルの換散バッファー A の) 細胞を溶解させます。
   4. 次の条件を 1.5 mL チューブにサンプルを超音波照射します。25% で、超音波発生装置の増幅を設定し、10 の超音波 s。
   5. 4 ° C で 15 分間 20,400 x gでサンプルを遠心分離します。
   6. 上清を収集します。1.5 mL 遠心チューブに上清 1 mL を移します。
      注意: は、RNase フリーの条件下ですべての手順を実行します。
3. 免疫沈降
   1. 事前に回避ステップ 3.2.6 から溶解液 40 μ L (ビーズ ボリューム 20 μ L) を追加することによって液の 1 mL あたりウォッシュ蛋白質 A アガロース ビーズの。数回チューブを反転でよく混ぜるし、4 ° C で 30 分間サンプルを回転させる
   2. 4 ° C で 1 分 13,000 x gでサンプルを遠心し、上清を回復します。
   3. 洗ってあるタンパク質 A アガロース ビーズと TERT の抗ひと抗体の 10 μ g の 40 μ L (ベッド ボリューム 20 μ L) を追加 (クローン: 10E9 2)⁸中古オフに溶解。数回チューブを反転でよく混ぜるし、一晩で 4 ° C サンプルを回転させます。
   4. 3,300 x gで 4 ° C、0.5 分でサンプルを遠心し、上清を除去します。
   5. 洗浄バッファー 1 でビーズを洗う: ビーズに 1 mL の洗浄バッファー 1 を追加、チューブを反転でよく混ぜるし、4 ° C で 5 分間サンプルを回転させる3,300 x gで 4 ° C、0.5 分でサンプルを遠心し、上清を除去します。追加 3 回この手順を繰り返します。
   6. AGC 溶液 2 mM CaCl₂でビーズを 1 回洗浄: AGC 溶液 2 mM のビーズに CaCl₂ 1 mL を追加し、チューブを反転でよく混ぜるし、4 ° C で 5 分間サンプルを回転させる3,300 x gで 4 ° C、0.5 分でサンプルを遠心し、上清を除去します。
   7. ミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) とビーズを扱う:表 1に示す MNase 反応混合物を準備します。穏やかなピペッティングによる MNase 反応混合物の 60 μ L でビーズを再懸濁します。25 ° C で 15 分間ペルチェ型インキュベーターにシェーカーのターン テーブルに優しく (20 に 25 rpm) のサンプルを振る
      注: それは非常に起伏のあるシェーカーを使用して、この手順では制限速度を厳密に従ってくださいすることが重要です。シェーカー、回転ミキサーなどの他のタイプはお勧めしません。
   8. 3,300 x gで 4 ° C、0.5 分でサンプルを遠心し、上清を除去します。
   9. AGC 溶液 3 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸二度とビーズを洗う: AGC 溶液ビーズに 3 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 1 mL を追加し、チューブを反転でよく混ぜるし、4 ° C で 5 分間サンプルを回転させる3,300 x gで 4 ° C、0.5 分でサンプルを遠心し、上清を除去します。この手順をもう一度繰り返します。
   10. 洗浄バッファー 2 回ビード洗浄しなさい: 1 mL の洗浄バッファー 2 を追加ビーズ、チューブを反転でよく混ぜる 4 ° C で 5 分間サンプルを回転し、3,300 x gで 4 ° C、0.5 分でサンプルを遠心し、上清を除去します。酵素反応を設定しながら氷のビーズをしてください。
       注意: は、RNase フリーの条件下ですべての手順を実行します。
4. 酵素反応
   1. 表 2に説明されているように新しいチューブ内の酵素反応混合物を準備します。
   2. [Α-³²P] を 6 μ l 添加 UTP (3,000 Ci/モル) 混合し、ピペッティングで混ぜる。
      注: [α-³²P] ATP、[α-³²P] CTP、または [α-³²P] GTP が [α-³²P] 代わりに反応に使用することができます UTP。
   3. 追加テンプレート RNA の 1 μ L (1 μ g/μ L)、混合し、ピペッティングで混ぜる。
      注: 酵素試金を確立する次の RNA テンプレートは推奨: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' ⁹。
   4. ピペッティングでステップ 3.4.3 から酵素反応混合物の 20 μ L でビーズを再懸濁します。
   5. 32 ° C で 2 h のペルチェ型インキュベーターにシェーカーのターン テーブルに優しく (20 に 25 rpm) のサンプルを振る
   6. プロティナーゼ K (20 mg/mL) の 5.4 μ L と 2 x プロティナーゼ K バッファーの 45.4 μ L を反応混合物に追加します。ピペッティングで混ぜるし、37 ° C で 30 分間ペルチェ型インキュベーターでターン テーブルのサンプル (20 に 25 rpm) を振る
   7. RNase フリー水の 109.2 μ L をサンプルに追加します。
   8. 酸フェノール-クロロホルムの 200 μ L をサンプルに追加します。渦でよく混ぜるし、室温で 5 分間 21,100 x gでサンプルを遠心分離します。水相を新しいチューブに転送します。この手順をもう一度繰り返します。
   9. 追加 20 μ L の 3 M 酢酸ナトリウム (pH = 5.2)、4 μ L 沈キャリアと水相へのエタノール 250 μ L の。よく混合するため管を振るし、遠心分離機の 4 ° C で 20 分間 21,100 x gでサンプル上清を捨てます。
   10. -20 ° C で保存されている寒さの 70% (巻/巻) エタノールを 300 μ l 添加の餌を洗浄します。4 ° C で 15 分間 21,100 x gでサンプルを遠心分離します。
   11. 上澄みを廃棄し、ペレットを風乾します。
       注意: は、RNase フリーの条件下ですべての手順を実行します。
       注: ステップ 3.4.11 からペレットは-20 ° C で、少なくとも 2 日間保存できます。
5. RNase 処理
   1. RNase フリーのステップ 3.4.11 で 20 μ L からペレットを再懸濁します。
   2. 表 3で説明した、新しいチューブに RNase の反応混合物を準備します。
   3. サンプルに RNase 反応混合物の 180 μ L を追加し、37 ° C で 2 h のチューブを孵化させなさい
   4. サンプルに 10% (巻/巻) SDS の 2.3 μ L を追加し、37 ° C で 15 分間インキュベート
   5. サンプルにプロティナーゼ K (20 mg/mL) の 2 μ L を追加し、37 ° C で 15 分間インキュベート
   6. 酸フェノール-クロロホルムの 205 μ L をサンプルに追加します。渦によってよくミックスは、室温で 5 分間 21,100 x gでサンプルを遠心分離します。水相を新しいチューブに転送します。
   7. 20 μ L の 3 M 酢酸ナトリウム (pH が 5.2)、沈キャリアの 4 μ L と水相へのエタノール 250 μ L を追加します。よく混合するため管を振るし、遠心分離機の 4 ° C で 20 分間 21,100 x gでサンプル上清を捨てます。
   8. -20 ° C で保存されている寒さの 70% (巻/巻) エタノールを 300 μ l 添加の餌を洗浄します。4 ° C で 15 分間 21,100 x gでサンプルを遠心分離します。
   9. 上澄みを廃棄し、ペレットを風乾します。
      注: ステップ 3.5.9 からペレットは-20 ° C で、少なくとも 2 日間保存できます。
6. ゲルの電気泳動およびオートラジオグラフィー
   1. RNase フリー水の 20 μ L のサンプルを再懸濁します。
   2. バッファー x 2 の 20 μ L を追加します。
   3. 95 ° C で 10 分間のサンプルを沸騰します。氷のサンプルをつぶします。
   4. ゲルを実行します。に備えてテンプレートのサイズは、(また見なさいステップ 3.4.3) 34 国税庁は、7 M 尿素 10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動を変化させる使用されます。
   5. ゲルのドライヤーのゲルを乾燥させます。
   6. -80 ° C で激化画面で x 線カセット内乾燥ゲルにフィルムを公開します。

推奨される RNA テンプレートで、放射性 RdRP 製品が一晩暴露 (図 1 a) 後分裂期では HeLa 細胞で特に 20 に 30 ヌクレオチド (nt) の間観察されます。通常、酵素製品の信号強度が 25 前後に配置された 2 つのピークを示します次世代シーケンス⁹製品のサイズ分布と和音で nt を確認した nt と 30。分裂細胞と対照をなして同期せず HeLa 細胞は 20-30 nt 放射性製品のほとんどがない場合を示しています。楕円形の信号、20 以下に配置されているすべてのサンプルで nt が非特異的なドリフト。

場合に細胞分裂の HeLa 細胞で弱い信号で 〜 30 nt 製品のみが、酵素反応がうまく行っていないことを示します。たとえば、MNase 治療を約と不適切な実行する場合 hela 細胞分裂における信号強度の細胞減少が大幅 (図 1 b)。古い HMD ソリューションで実行される酵素反応は、製品 (図 1) をも低減します。

図 1: 分裂の HeLa 細胞における内因性 TERT の代表 RdRP 製品。HeLa 細胞における IP 酵素試金の(A) 3 つの代表的な結果はノコダゾール (操作) または (たがる) DMSO で処理。化学的に合成された 34 nt RNA テンプレートとして使用されました。(B)不適切な MNase 処理で細胞分裂の HeLa 細胞における IP RdRP の試金。(C) 、新鮮なまたは古い HMD ソリューションで実行される分裂の HeLa 細胞における IP RdRP の試金。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: MNase 反応ミックス コンポーネント。

表 2: 酵素反応のミックス コンポーネント。

表 3: リボヌクレアーゼ反応ミックス コンポーネント。

IP 酵素試金は、人間の第三の酵素活性を検出する機密性の高い方法です。TERT タンパク質高、TERT が RdRP 複雑な^8,9,10を形作る分裂の HeLa 細胞で表されます。これは分裂の HeLa 細胞が酵素活性を検出するための最適な材料であることを示唆します。上記で説明したプロトコル、HeLa 細胞の細胞分裂と非同期含まれている肯定的な否定的な例としてそれぞれ。図 1 aのように、分裂の HeLa 細胞における推奨される RNA テンプレートから酵素アッセイ製品表示 20 に 30 間で広範な放射性信号 nt。HeLa 細胞に加えて我々 は細胞株の種類と分析を実行し、別のセルのタイプ⁹で、信号パターンを変更できることを発見: いくつか表示する強力な信号のみ約 30 nt では、いくつかは HeLa 細胞で同様のパターンを表示。我々 は短い RNA テンプレート 34 nt テンプレート⁸、以外と分析を実行しているし、長い (~ 300 nt)、いろいろな順序で Rna といくつかの設定がありますが、これらのテンプレートから RdRP 製品を正常に取得します。ただし、最初の試験では、HeLa 細胞分裂期 34 nt RNA テンプレートの使い方をお勧めします。プライマー依存性、プライマーに依存しない方法¹¹両方 RdRPs は二本鎖 RNA を生成できます。我々 は第三人間 RdRP^7,9; としてこのプロパティを維持することを報告しています。TERT はから戻るプライミング機構⁷3'-フォールド構造を持つ RNA テンプレートから dsRNA を合成します。34 nt RNA テンプレートの TERT はプライマー⁹を使用せず相補鎖を合成します。具体的にはプライマーに依存しない方法、すなわちデノボ合成 RNA 製品、[α-³²P] 合成酵素製品を検出する NTP は [γ-³²P] と置き換えることができます酵素反応⁹で NTP。

ビーズの TERT 免疫複合体の MNase 治療は望ましい結果を達成するために重要なステップです。長すぎるか、集中的な振動で MNase 処理を実行すると、RdRP 製品を著しく削減されるでしょう。このようなトラブルを避けるため、慎重にプロトコルに従う厳密に強く推奨します。HMD のソリューションは、成功のためのもう一つの重要な要因です。信号は非常に弱いことを発見した場合は、新規に準備したものに HMD ソリューションを取り付けます。

プロトコル、全体で 1 つは RNase の混入を避けるために細心の注意を取る必要があります。リボヌクレアーゼ処理は、専用の機器で行わなければなりません。リボヌクレアーゼを操作した後のヒントを破棄する必要があります 1 つと RNase を持つチューブは、すぐに専門ソリューション (例えばRNase 静かな)、RNase を排除し、木立を変更します。

TERT は帰すだけでなく内因性 Rna のまた多くの種類を操作し、我々 はそれらの部分に⁷を報告しています。MNase 治療せず IP 酵素アッセイなどの IP 酵素アッセイの変更がそのシーケンス機能に TERT 関連酵素活性とバイオ情報ガイドの内因性 RNA テンプレートの完全なリストを提供します。このプロトコルでは、組織ライセートを我々 に成功しました。TERT は表されるので正常細胞と腫瘍細胞の様々 なこの試金は人間の TERT の非正規の酵素の機能を調査する役に立つかもしれない。

著者が明らかに何もありません。

この作品によって支えられた一部プロジェクトがん治療 (P ダイレクト) (15cm0106102h0002 キロ) とプロジェクトに関する革新的な研究開発の癌研究と治療の進化 (P-作成) (16 cm 01061150001、キロ) の日本代理店から医学研究・開発、アメッド;武田科学振興財団 (山口);プリンセス高松がん研究基金 (13-24520 やって来た); の付与・日本学術振興会科研費助成番号 JP16K07133 (y. m.)。