Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Humana de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) sintetiza la DNA telomeric, pero también ARN bicatenario a través de la actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente. Aquí, describimos un análisis recién creado para detectar actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente del terc endógena.

Humano telomerasa transcriptasa inversa (TERT) es la subunidad catalítica de la telomerasa y alarga a través de la actividad de RNA-dependiente polimerasa de la DNA del telómero. Aunque terc es nombrado como una transcriptasa inversa, análisis estructurales y filogenéticos de terc demuestran que terc es miembro de polimerasas de diestros y relaciona con polimerasas RNA-dependent RNA virales (RdRPs) así como de la transcriptasa inversa viral. En primer lugar identificamos RdRP actividad de terc humano que genera RNA complementario soporte a una plantilla de RNA no codificante y contribuye a RNA silenciamiento en células de cáncer. Para analizar esta actividad enzimática no canónico, desarrollamos análisis de RdRP con terc recombinante en 2009, posteriormente había establecido en vitro ensayo RdRP para terc endógena. En este manuscrito, describimos el método de este último. Brevemente, complejos inmunes terc aislados de las células y se incubaron con plantilla de RNA y rNTPs incluyendo rNTP radiactivo de RdRP reacción. Para eliminar el RNA monocatenario, productos de reacción son tratados con Rnasa I y los productos finales están analizado con electroforesis en gel de poliacrilamida. Productos radiactivos de RdRP pueden detectarse por autorradiografía tras la exposición durante la noche.

Humana de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) es conocida como la subunidad catalítica de la telomerasa y alarga el telómero usando componente RNA de telomerasa (TERC), el RNA específico plantilla¹. Aunque terc polimeriza ADN telomérico como un componente de la telomerasa, los análisis estructurales y filogenéticos indican que terc está estrechamente relacionada con polimerasas RNA-dependent RNA virales (RdRPs) así como la transcriptasa inversa viral y comparte dominios con Estas polimerasas^2,3,4. RdRP es la enzima que genera el filamento del RNA complementario a una plantilla de RNA. La enzima está codificada no sólo virus, sino también en organismos modelo, como la planta, la levadura y el gusano, y síntesis de ARN de doble hebra por RdRP contribuye al silenciamiento génico transcripcional y postranscripcional en estos organismos^5,6 . Aunque RdRP humana había estado desaparecido durante mucho tiempo, se encontró actividad RdRP humano terc en 2009⁷.

Nos confirmaron actividad RdRP de terc con proteína recombinante⁷primero estableció un análisis de sensibilidad en vitro para detectar actividad RdRP de terc endógeno⁸. Aquí, demostramos el ensayo en vitro RdRP (IP-RdRP ensayo) para terc endógena. Este método comienza con inmunoprecipitación (IP) de terc endógeno y es seguido en vitro RdRP reacción, en el cual ribonucleótidos radiactivos se incorporan a filamentos de RNA nacientes.

1. reactivo configuración

1. Reactivos utilizados para la sincronización de la célula
   1. Para generar el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contiene timidina de 2,5 mM, disolver 30,28 mg de timidina por 1 mL de agua grado de cultivo de tejidos para preparar timidina 125 mM. Filtrar la solución con una unidad de filtro 0,22 μm jeringa. Añadir 1 mL de timidina recién preparada 125 mM por 50 mL de DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 10% (vol/vol).
   2. Para generar el DMEM que contenía 0,1 μg/mL de nocodazole, disolver nocodazole en dimetil sulfóxido (DMSO) para preparar 5 nocodazole μg/μL. Añadir 1 μl de 5 μg / μl nocodazole por 50 mL de DMEM suplementado con 10% FBS (vol/vol).
   3. Para generar el DMEM que contenía 0.002% (vol/vol) de DMSO, añadir 1 μl de DMSO por 50 mL de DMEM suplementado con 10% FBS (vol/vol).
2. Reactivos para análisis de RdRP IP
   1. Preparar lysis buffer A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) y el 0.5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Almacenar el reactivo a 4 ° C.
   2. Preparar 5 x buffer acetato: ácido 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic 50 mM (HEPES)-KOH (pH 7.8), acetato de potasio de 500 mM y 20 mM de MgCl₂. Almacenar el reactivo a temperatura ambiente.
   3. Preparar el tampón de acetato de 1: 1 x de tampón de lavado, glicerol al 10% (vol/vol), 0.1% (vol/vol) Triton X-100 y 0.06 x inhibidor de la proteasa coctel, ácido ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-libre. Preparar el tampón de lavado 1 día de uso o el día antes de su uso. Almacenar el reactivo a 4 ° C.
   4. Preparar solución AGC: 1 x de tampón de acetato, glicerol al 10% (vol/vol) y 0,02% (peso/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimetilamonio] -1-propanesulfonat (caps). Almacenar el reactivo a 4 ° C.
   5. Para generar la solución AGC que contiene 2 mM CaCl₂, añadir 100 μl de 1 M de CaCl₂ por 50 mL de solución AGC. Almacenar el reactivo a 4 ° C.
   6. Para generar la solución AGC que contiene bis de glicol de etileno de 3 m m (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido tetraacético (EGTA), añadir 375 μl de 0,4 M EGTA (pH 7.5) 50 mL de solución AGC. Almacenar el reactivo a 4 ° C.
   7. Preparar el tampón de acetato de 2: 1 x de tampón de lavado y grietas del 0,02% (peso/vol). Almacenar el reactivo a 4 ° C.
   8. Preparar la solución de la HMD: 0.2 M HEPES-KOH (pH 7.8), 40 mM de MgCl₂ y 2 mM Ditiotreitol (DTT). Almacenar el reactivo a-20 ° C.
      Nota: Solución HMD debe renovarse al menos en tres meses.
   9. Preparar 2 x proteinasa K buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM EDTA y 1% (peso/vol) sodio dodecil sulfato (SDS). Almacenar el reactivo a-20 ° C.
   10. Preparar 2 x de buffer de carga: 95% (vol/vol) formamida, 20 mM EDTA y 1% (peso/vol) G. naranja almacenan el reactivo a-20 ° C.

2. preparación de las células HeLa

Nota: Preparar las células HeLa sincronizada en fase mitótica (manipulado) o dividiendo de forma asincrónica (unmanipulated). Cultura de las células en presencia de 5% CO₂ a 37 ° C.

1. Sincronización de células HeLa en mitosis
   1. Placa de 1 x 10⁶ células HeLa con 10 mL de DMEM suplementado con 10% (vol/vol) FBS en una placa de cultivo de 10 cm.
   2. Dos días después de la galjanoplastia, sustituir el medio con 10 mL de DMEM que contenía timidina de 2,5 mM y 10% FBS (vol/vol). Cultura de las células durante 24 h.
   3. Lavar las células 3 veces con 10 mL de tampón fosfato salino (PBS) (-) y las células con 10 mL de DMEM con 10% (vol/vol) FBS para 6 h de la cultura.
   4. Reemplazar el medio con 10 mL de DMEM que contiene 0.1 μg/mL de nocodazole y 10% (vol/vol) FBS y las células por 14 h la cultura.
   5. Agitar suavemente la placa de cultivo y recuperar el sobrenadante que contiene las células mitotic separadas. Contar el número de células para el ensayo de RdRP de IP.
   6. Centrifugar la muestra a 490 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
      Nota: El precipitado de células puede ser almacenado a-80 ° C.
2. Preparación de células HeLa unmanipulated
   1. Placa de 1 x 10⁶ células HeLa con 10 mL de DMEM suplementado con 10% (vol/vol) FBS en una placa de cultivo de 10 cm.
   2. Dos días después de la galjanoplastia, sustituir el medio con 10 mL de DMEM con 10% FBS (vol/vol). Las células de 30 h de la cultura.
   3. Reemplazar el medio con 10 mL de DMEM que contenía 0.002% (vol/vol) DMSO y el 10% (vol/vol) FBS y las células por 14 h la cultura.
   4. Recoger las células mediante tripsinización 0,7 ml de tripsina (2,5 g/L) que contiene 1 mM EDTA. Contar el número de células para el ensayo de RdRP de IP.
   5. Centrifugar la muestra a 490 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
      Nota: El precipitado de células puede ser almacenado a-80 ° C.

3. IP-RdRP ensayo

1. Preparación de grano de proteína A-agarose
   1. Transferir 1 mL (cama volumen 500 μl) de la resina de afinidad a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a 800 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
   2. Añadir 800 μl de tampón de lisis A los granos y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Centrifugue a 800 x g durante 3 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Repita este paso dos veces (total tres lavados).
   3. Añadir 800 μl de tampón de lisis A los granos, mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Gire el tubo durante la noche (o por lo menos 4 h) a 4 ° C en un agitador rotatorio.
   4. Centrifugar el tubo a 800 x g durante 3 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
   5. Añadir 500 μl de tampón de lisis A los granos y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Almacenar los granos a 4 ° C.
2. Preparación de lisado de célula
   1. (Opcional) Si las células se congelan en el paso 2 y descongelar las células congeladas en el hielo hasta que las células queden sueltas.
   2. Lavar las células una vez con 10 mL de PBS (-). Centrifugar la muestra a 1.450 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
   3. Lyse las células con buffer de lisis helada (1 mL de tampón de lisis A por 1 x 10⁷ de las células) mediante pipeteo suave.
   4. Someter a ultrasonidos la muestra en un tubo de 1,5 mL con las siguientes condiciones; amplificación del sonicador en 25% y someter a ultrasonidos para 10 s.
   5. Centrifugar la muestra a 20.400 x g durante 15 min a 4 ° C.
   6. Recoger el sobrenadante. Transferir 1 mL del sobrenadante a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
      PRECAUCIÓN: Realice todos los procedimientos en condiciones libres de Rnasa.
3. Inmunoprecipitación
   1. Pre-claro el lisado de paso 3.2.6 añadiendo 40 μl (grano volumen 20 μl) de perlas de agarosa A proteína prelavada por 1 mL de lisado. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces y rotar la muestra durante 30 min a 4 ° C.
   2. Centrifugar la muestra a 13.000 x g durante 1 min a 4 ° C y recuperar el sobrenadante.
   3. Agregar 40 μl (cama volumen 20 μl) de proteína prelavada A-agarose granos y 10 μg de anticuerpo anti-humana terc (clon: 10E9-2)⁸ en el previamente despejado lisado. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces y rotar la muestra a 4 ° C durante la noche.
   4. Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.
   5. Lavar los granos con tampón de lavado 1: Añada 1 mL de tampón de lavado 1 a las cuentas, mezclar bien por inversión del tubo y girar la muestra durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Repita este paso tres veces más.
   6. Lavar los granos una vez con solución AGC que contiene 2 mM CaCl₂: Añadir 1 mL de solución AGC 2 mM CaCl₂ para los granos, mezclar bien por inversión del tubo y girar la muestra durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.
   7. Tratamiento de los granos con nucleasa Micrococcal (MNase): preparar la mezcla de reacción de MNase se describe en la tabla 1. Resuspender los granos en 60 μL de la mezcla de reacción de MNase mediante pipeteo suave. Agitar suavemente la muestra (20 a 25 rpm) en un plato de una shaker en una incubadora de tipo Peltier durante 15 min a 25 ° C.
      Nota: Es muy importante utilizar un vibrador ondulado y siga estrictamente el límite de velocidad en este paso. Otro tipo de agitadores, como mezcladores rotatorios, no se recomienda.
   8. Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.
   9. Lavar los granos dos veces con solución AGC que contiene 3 mM EGTA: Añadir 1 mL de solución AGC 3 mM EGTA a los granos, mezclar bien por inversión del tubo y girar la muestra durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Repita este paso una vez.
   10. Lavar los granos una vez con tampón de lavado 2: Añadir 1 mL de tampón de lavado 2a los granos, mezclar bien por inversión del tubo y girar la muestra durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Mantener los granos en el hielo mientras la reacción de RdRP.
       PRECAUCIÓN: Realice todos los procedimientos en condiciones libres de Rnasa.
4. Reacción de la RdRP
   1. Preparar una mezcla de reacción de RdRP en un nuevo tubo tal como se describe en la tabla 2.
   2. Añadir 6 μl de [α -³²P] UTP (3.000 Ci/mmol) para la mezcla y mezcle bien por pipeteo.
      Nota: ATP [α -³²P], [α -³²P] CTP y GTP [α -³²P] puede ser utilizado para la reacción en lugar de [α -³²P] UTP.
   3. Añadir 1 μl de plantilla de RNA (1 μg/μl) a la mezcla y mezcle bien por pipeteo.
      Nota: Para establecer el ensayo de RdRP, se recomienda la siguiente plantilla de RNA: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' ⁹.
   4. Resuspender los granos con 20 μl de la mezcla de reacción de RdRP de paso 3.4.3 mediante pipeteo.
   5. Agitar suavemente la muestra (20 a 25 rpm) en un plato de una shaker en una incubadora de tipo peltier por 2 h a 32 ° C.
   6. Añadir 5,4 μL de proteinasa K (20 mg/mL) y 45,4 μL de tampón de proteinasa K de x 2 a la mezcla de reacción. Mezclar mediante pipeteo y agitar (20 a 25 rpm) de la muestra sobre un plato giratorio en una incubadora de tipo Peltier durante 30 min a 37 ° C.
   7. Añadir 109,2 μl de agua libre de ARNasa a la muestra.
   8. Añadir 200 μL de ácido fenol-cloroformo a la muestra. Mezclar por vortex y centrifugar luego la muestra en 21.100 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo. Repita este paso una vez.
   9. Añadir 20 μl de acetato de sodio de 3 M (pH = 5.2), 4 μL de portador de precipitación y 250 μl de etanol en la fase acuosa. Agitar el tubo para mezclar, a continuación, centrifugar la muestra a 21.100 x g por 20 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
   10. Lavar el sedimento con 300 μL de etanol frío al 70% (vol/vol) almacenado a-20 ° C. Centrifugar la muestra a 21.100 x g durante 15 min a 4 ° C.
   11. Deseche el sobrenadante y secar el pellet.
       PRECAUCIÓN: Realice todos los procedimientos en condiciones libres de Rnasa.
       Nota: El precipitado del paso 3.4.11 puede almacenarse a-20 ° C durante al menos 2 días.
5. Tratamiento de la ARNasa
   1. Resuspender el precipitado de paso 3.4.11 en 20 μl de agua libre de ARNasa.
   2. Preparar una mezcla de reacción Rnasa en un nuevo tubo tal como se describe en la tabla 3.
   3. Añadir 180 μl de la mezcla de reacción Rnasa a la muestra e incubar el tubo durante 2 h a 37 ° C.
   4. Agregar 2.3 μl de SDS 10% (vol/vol) de la muestra e incubar por 15 min a 37 ° C.
   5. Añadir 2 μl de proteinasa K (20 mg/mL) a la muestra e incubar por 15 min a 37 ° C.
   6. Añadir 205 μl de ácido fenol-cloroformo a la muestra. Luego, mezclar por vortex, Centrifugue la muestra a 21.100 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.
   7. Añadir 20 μl de acetato de sodio de 3 M (pH 5,2), 4 μL del portador de la precipitación y 250 μl de etanol en la fase acuosa. Agitar el tubo para mezclar, a continuación, centrifugar la muestra a 21.100 x g por 20 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
   8. Lavar el sedimento con 300 μL de etanol frío al 70% (vol/vol) almacenado a-20 ° C. Centrifugar la muestra a 21.100 x g durante 15 min a 4 ° C.
   9. Deseche el sobrenadante y secar el pellet.
      Nota: El precipitado del paso 3.5.9 puede almacenarse a-20 ° C durante al menos 2 días.
6. Autorradiografía y electroforesis en gel de
   1. Resuspender la muestra con 20 μl de agua libre de ARNasa.
   2. Añadir 20 μl de 2 x de buffer de carga.
   3. Hervir la muestra 10 min a 95 ° C. Triturar la muestra en el hielo.
   4. Correr el gel. En caso de que el tamaño de la plantilla es 34 nts (véase también paso 3.4.3), gel de poliacrilamida al 7 M Urea - 10% se utiliza para desnaturalizando electroforesis del gel.
   5. Secar el gel con un secador de gel.
   6. Exponer la película al gel de secado dentro de un cassette de rayos x con una pantalla de intensificación a-80 ° C.

Con la plantilla de RNA recomendada, productos radioactivos de la RdRP se observan entre los 20 a 30 nucleótidos (nt) específicamente en las células HeLa en fase mitótica después de la exposición durante la noche (figura 1A). Por lo general, la intensidad de la señal de los productos de RdRP muestra dos picos que están situados en torno a los 25 nt y 30 nt en consonancia con la distribución de tamaño de los productos confirmado por la siguiente generación de la secuencia⁹. En contraste con las células mitóticas, las células HeLa sin sincronización demuestran casi ausencia de los productos radiactivos de 20 – 30 nt. Señales de ovales, que se colocan por debajo de 20 nt en todas las muestras, son no específicas derivas.

En caso de sólo un producto nt ~ 30 con señal débil en células HeLa mitotic, indica que la reacción de RdRP no salieron bien. Por ejemplo, si MNase el tratamiento se realiza aproximadamente e inadecuadamente, la intensidad de la señal en HeLa mitótico de las células disminuye significativamente (figura 1B). RdRP la reacción se realizó con la vieja solución HMD también reduce los productos (figura 1).

Figura 1 : Productos de RdRP representante de terc endógeno en células HeLa mitotic. (A) tres resultados representativos de la prueba de IP RdRP en células HeLa tratan con nocodazole (manipulado) o DMSO (unmanipulated). La síntesis química 34 nt RNA fue utilizado como una plantilla. (B) IP-RdRP ensayo en células de HeLa mitóticas con tratamiento inadecuado de la MNase. (C) ensayo de RdRP IP en mitóticas células HeLa con solución HMD ya sea fresca o vieja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: MNase componente de mezcla de reacción.

Tabla 2: RdRP componente de mezcla de reacción.

Tabla 3: Ribonucleasa reacción mezcla el componente.

El ensayo de RdRP de IP es un método sensible para detectar actividad RdRP de terc humana. TERC proteína se expresa altamente en células de HeLa mitóticas, en que terc forma el RdRP complejo^8,9,10. Esto sugiere que las células de HeLa mitotic son un material óptimo para detectar actividad RdRP. En el protocolo descrito anteriormente, las células HeLa mitotic y asíncrono se incluyen como un positivo y un ejemplo negativo, respectivamente. Como se muestra en la figura 1A, RdRP productos de análisis de la plantilla recomendada de RNA en células HeLa mitotic mostrar señales radioactivas amplias entre 20 a 30 nt. Además de las células HeLa, hemos realizado el ensayo con diferentes tipos de líneas celulares y encontró que se puede cambiar el patrón de señal en la célula diferentes tipos⁹: algunos muestran una señal fuerte sólo alrededor de 30 nt, algunos muestran un patrón similar con células HeLa. Han realizado también el ensayo con las plantillas del RNA que no sea el 34 nt plantilla⁸, corta y larga (~ 300 nt) ARNs con secuencias distintas y con éxito RdRP productos obtenidos de las plantillas aunque puede haber cierta preferencia. Para el primer ensayo, sin embargo, se recomienda utilizar células HeLa en fase mitótica y la plantilla de nt RNA 34. RdRPs puede generar ARN bicatenario en un cartilla-dependiente y en una forma independiente de la cartilla¹¹. Nos han informado que terc conserva esta propiedad como humano RdRP^7,9; TERC sintetiza dsRNA de una plantilla de RNA 3'-foldback estructura a través de un mecanismo de cebado de espalda⁷. Para la plantilla de nt RNA 34, terc sintetiza filamentos complementarios sin utilizar primers⁹. Para detectar específicamente la RdRP productos sintetizados en forma independiente de la cartilla, es decir, de novo sintetizadas RNA productos [α -³²P] puede reemplazarse con [γ -³²P] NTP NTP en el RdRP reacción⁹.

MNase tratamiento de complejos inmunes terc en granos es un paso crítico para obtener los resultados deseados. Si se realiza el tratamiento de MNase demasiado tiempo o con agitación intensa, los productos de RdRP se reduciría notablemente. Para evitar estos problemas, recomendamos seguir estrictamente el protocolo cuidadosamente. Solución HMD es otro factor crítico para el éxito. Si usted encuentra que las señales son muy débiles, reemplazar la solución HMD a uno recién preparado.

A lo largo del Protocolo, uno debe tomar gran cuidado para evitar la contaminación de la Rnasa. Ribonucleasa tratamiento debe ser realizado con equipo dedicado. Después de manipular la ribonucleasa, uno debe desechar las puntas y tubos con Rnasa inmediatamente, eliminan Rnasa con solución especializada (e.g. Rnasa tranquila) y cambian de arboledas.

TERC interactúa no sólo con TERC sino también muchos tipos de RNAs endógenos, y nos han informado de parte de ellos⁷. Modificación en el ensayo de RdRP de IP, tales como el ensayo de RdRP IP sin tratamiento MNase, proporcionará una lista completa de plantillas de RNA endógenas guía actividad y bioinformáticas de RdRP asociada a terc en sus características de secuencia. Hemos aplicado con éxito este protocolo al tejido lisado. Porque TERT se expresa en una variedad de tejidos normales y tumorales, este análisis podrían ser útil para investigar la función enzimática no canónico de terc en humanos.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue financiado en parte por el proyecto para el desarrollo de la investigación innovadora en Cancer Therapeutics (P-directo) (15cm0106102h0002, K.M.) y el proyecto para la investigación del cáncer y la evolución terapéutica (P-crear) (16cm 01061150001, K.M.) de Japón Agencia para la investigación médica y el desarrollo, AMED; la Fundación de ciencia de Takeda (Y.M.); Beca del fondo de investigación del cáncer de princesa Takamatsu (13-24520, Y.M.); y JSP KAKENHI número JP16K07133 (Y.M.).