Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Nós apresentamos um protocolo para a aplicação de interferometria fotoativado Localization Microscopy (iPALM), um método de microscopia de super-resolução 3-dimensional única molécula localização, à imagem do citoesqueleto de actina em células de mamíferos aderentes. Esta abordagem permite a visualização à base de luz de características estruturais em nanoescala que, caso contrário permanecem sem solução por microscopia óptica limitado por difração convencional.

microscopia de fluorescência permite a visualização direta das biomoléculas específicas dentro das células. No entanto, para a microscopia de fluorescência convencional, a resolução espacial é limitada por difracção para ~ 200 nm, dentro do plano de imagem e> 500 nm ao longo do eixo óptico. Como resultado, a microscopia de fluorescência tem sido severamente limitada na observação das características ultra-estruturais dentro de células. O recente desenvolvimento de métodos de microscopia de super-resolução tem superar essa limitação. Em particular, o advento dos fluoróforos foto induzida permite microscopia de super-resolução à base de localização, que fornece poder de resolução que se aproxima a escala de comprimento molecular. Aqui, descrevemos a aplicação de um método de microscopia de super resolução tridimensional baseado em microscopia de localização única molécula e interferometria multifásico, chamada interferometria fotoativado Localization Microscopy (iPALM). Este método oferece resolução quase isotrópica naordem de 20 nm em todas as três dimensões. Os protocolos para visualizar o citoesqueleto de actina filamentosa, incluindo a preparação da amostra e o funcionamento do instrumento iPALM, são descritos aqui. Estes protocolos são também prontamente adaptável e instrutiva para o estudo de outras características ultra-estruturais nas células.

A visualização das estruturas celulares complexas, desde há muito integrante a insights biológicos e descoberta. Embora a microscopia de fluorescência pode células de imagem com especificidade molecular elevado, o seu poder de resolução é limitada por difracção para ~ 200 nm, no plano de imagem (x, y, ou dimensão lateral) e> 500 nm ao longo do eixo óptico (Z, ou dimensão axial) ^1,2. Assim, a observação de características ultra-estruturais historicamente tem sido limitada a microscopia electrónica (ME). Felizmente, o recente desenvolvimento da microscopia de super-resolução tem contornado este limite, permitindo a resolução espacial no 10-100 gama nm ^1-6. Em particular, super resolução abordagens baseadas em localização única molécula, conhecida por siglas como PALM (fotoativado Localization Microscopy) ^4, FPALM (Fluorescência fotoativado Localization Microscopy) ⁵ (d) STORM (direto Stochastic Optical Reconstrução Microscopia) ^6,7, PINTURA ( PoAcumulação int para imagens em nanoescala Topografia) ^8, GSDIM (Estado Chão Depleção Microscopia seguido de retorno moleculares individuais) ^9, ou SMACM (Single-molécula activa-Control Microscopia) ^10, bem como as suas três dimensões implementações (3D), tal como PALM interferométrico (iPALM) ¹¹ ou 3D-STORM ^12, têm sido valiosos em revelar novos insights sobre a organização nanoescala de numerosas estruturas biológicas, incluindo os axônios neuronais e sinapses ^13, adesões focais ^14,15, junções célula-célula ^16, nuclear poros ¹⁷ centrossomas, e ^18-20, para nomear alguns.

Outra característica ultra-estruturais em células para as quais a microscopia de super-resolução é potencialmente útil é o citoesqueleto de actina. O complexo de malha filamentosa (F) -actina no córtex celular desempenha um papel essencial no controlo da forma e propriedades mecânicas celular ^21. A organização of f-actina é activa e dinâmica regulada embora numerosas proteínas reguladoras que influenciam fortemente a polimerização, reticulação, volume de negócios, estabilidade e topologia de rede ^22. No entanto, embora a caracterização da arquitectura malha de actina F é importante para percepções mecanísticos em uma grande variedade de processos celulares, o pequeno tamanho (~ 8 nm) dos filamentos F-actina dificulta a sua observação por microscopia de luz limitado por difração convencional; Assim, a visualização da estrutura fina actina tem sido até agora exclusivamente realizada por EM. Aqui, nós descrevemos protocolos para a visualização do citoesqueleto de actina F em células de mamífero aderentes, usando a técnica de microscopia de super-resolução iPALM para tirar partido da sua capacidade muito alta precisão em 3D ^11,23. Embora o instrumento iPALM é altamente especializada, instruções sobre a criação de um tal instrumento foi descrito recentemente ^23, enquanto o acesso ao microscópio iPALM organizada pelo Hoala Hughes Medical Institute, também foi disponibilizado para a comunidade científica com um custo mínimo. Além disso, os métodos de preparação de amostras aqui descritas são directamente aplicáveis aos abordagens alternativas 3D Super resolução, como aquelas baseadas em desfocagem astigmatic da função de propagação do ponto (PSF) ^{de 12} ou bi-plano de detecção ^24, que são mais amplamente disponível.

Notamos que um ingrediente necessário para a microscopia de super resolução baseada em localização única molécula, em geral, é o fluoróforo foto induzida ^25, que permite que os três requisitos essenciais para a microscopia de super-resolução com base em localização única molécula de ser cumprido: i) alta single-molécula brilho e contraste em relação a sinais de fundo; ii) distribuição esparsa de moléculas individuais em um determinado quadro de imagem; e iii) densidade espacial de alta rotulagem suficiente para capturar o perfil da estrutura de base (também conhecida como Nyquist-Shacritério de amostragem nArquivos não) ^26. Assim, para obter resultados satisfatórios, a ênfase deve ser colocada igualmente em ambos a preparação adequada das amostras para otimizar fluoróforo photoswitching e preservar a ultra-estrutura subjacente, bem como sobre os aspectos de instrumentação e aquisição dos experimentos.

1. Criação de Imagens Preparação de Amostras

1. Uma vez que os sinais de fluorescência de fundo interferir com fluorescência a partir de fluoróforos etiquetas, limpar os esfregaços por primeiro enxaguar em água desionizada _(ddH2O) e, em seguida, ar-secando-os com ar comprimido. Subsequentemente, executar gravação por plasma num dispositivo de limpeza de plasma durante 15 seg, ou mais longo, se necessário.
2. Para ativar a correção de deriva e calibração iPALM, utilize # 1.5 round (22-mm de diâmetro) esfregaços pré-limpos incorporados com nanopartículas fluorescentes como pontos de referência, que servem fiducials como altamente fotoestável para calibração confiável e correção de drift. Devido ao tempo de aquisição muito tempo necessário para acumular suficiente densidade fluoróforo (> 15 - 30 min), a deriva de amostra é inevitável.
3. Colocar cada lamela fiducialed em uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. Esterilizá-los por radiação ultravioleta (UV) numa câmara de fluxo laminar durante 15 min.
4. Em uma capela de fluxo laminar estéril, prepare fibroNectin solução para revestimento lamela por diluição de 1 mg / ml de solução stock de f ibronectina em solução salina tamponada com fosfato estéril de Dulbecco (DPBS) a uma concentração final de 2-10 ug / ml. Lavar cada lamela três vezes com DPBS e incubar com 2 ml da solução de f ibronectina durante a noite a 4 ° C. Posteriormente, aspirar a solução fibronectina e lave uma vez com DPBS.
5. Lavar as células brevemente com DPBS. Incubar por 1 - 2 ml de tripsina durante alguns minutos a 37 ° C até as células separar e extingue-se com ~ 10 mL de meio de cultura celular contendo soro fresco. Por exemplo, para as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), utilizar o meio de cultura endoteliais dos vasos grandes suplementado com grandes factores endoteliais dos vasos e penicilina ou estreptomicina.
   1. Replate as células sobre a lamela revestida de fibronectina (para uma densidade de esparso, placa <50.000 células por lamela) e manter a cultura numa incubadora a 95% de humidade, 5% de CO _2, e 37 & #176; C.
6. Para a preservação adequada dos finas estruturas do citoesqueleto de actina F, utilizar soluções tampão baseadas em reagentes tampão de Good ^27.
   1. Por exemplo, preparar tampão PHEM como uma solução 2x da (PIPES 120 mM, HEPES 50 mM, EGTA 20 mM, MgCl ₂ 4 mM, pH 7,0 com KOH) por dissolução de 6,5 g de HEPES, 3,8 g de EGTA, e 190 mg de MgCl ₂ em ~ 300 ml de _ddH2O, com o pH ajustado para 7,0 por adição gota a gota de uma solução de KOH concentrado; em seguida, adicionar _ddH2O para levar o volume até 500 ml. Esteriliza-se o tampão através de um filtro de 0,22 mícrons, armazená-lo a 4 ° C, e dilui-lo 1: 1 com _ddH2O antes da utilização.
7. Para obter os melhores resultados com a rotulagem de alta densidade de F-actina, o uso faloidina conjugada com fluoróforos orgânicos, tais como Alexa Fluor 647. No ponto de tempo desejado após replating célula, fixar as células como se segue:
   1. Aspirar a mídia de cada poço de cultura contendo o ceespécime ll. Suavemente, mas rapidamente dispensar 2 ml de fixadores de extracção quentes (37 ° C) contendo 0,25% de glutaraldeído em tampão de PHEM com 0,25% de Triton X-100. Incubar-la à temperatura ambiente durante 1-2 minutos. Para obter as etapas subsequentes, use 2 ml de fixador ou extinguir buffer por lamela, salvo indicação em contrário.
   2. Substitua o fixador extracção com um fixador de glutaraldeído 2,5% em tampão PHEM e deixar que as amostras incubar por 10-12 min. Este e todos os seguintes passos são realizados à temperatura ambiente.
   3. Aspirar os fixadores e gentilmente substituí-los com tampão PHEM. Tilt e homogeneizar suavemente, e depois lavar novamente com PHEM. Repita duas vezes.
   4. Para extinguir autofluorescência de glutaraldeído, o que pode sobrecarregar os sinais a partir de fluoróforos desejadas, incubar as amostras com um tampão de têmpera recentemente preparada com _NaBH4 a uma concentração de massa de 0,1% em PHEM. será observado bolhas profusas. tocar ocasionalmente o prato de amostra suavemente para DISLodge as bolhas. Deixe-a incubar durante 5 - 10 min.
   5. Aspirar o buffer de têmpera e gentilmente substituí-lo com tampão PHEM. Lavar algumas vezes para limpar as bolhas. Pipetar em 2 ml de tampão PHEM e deixá-lo incubar no escuro durante 5 min. Repita duas vezes e deixar o resto da amostra em tampão PHEM quando terminar.
   6. Preparar uma câmara de humidade durante phalloidin incubação utilizando um grande plástico de Petri preenchido com um pedaço de papel toalha generosamente humedecido com 5 - 10 ml de DDH ₂ O. Coloque uma grande folha de Parafilm limpa em cima da toalha de papel molhado.
   7. Devido ao custo relativamente elevado de faloidina etiquetada, usar um pequeno volume para cada rotulagem. Para a etiquetagem de alta densidade, começam com uma concentração de 0,3 uM. Prepara ~ 60 ul por lamela utilizando faloidina-Alexa Fluor 647 em tampão PHEM.
   8. Pipetar 55 - 60 ul de solução a faloidina para a folha de Parafilm na câmara de humidade. Usando uma pinça fina, remover suavemente a coverg espécimemoça. Seja cuidadoso ao observar a face contendo as células corretas.
   9. Rapidamente e bata suavemente o excesso de tampão por tocar a borda da lamela com um pedaço de papel dobrado delicado absorvente, e, em seguida, colocar o lado das células para baixo lamela sobre a gota de solução de faloidina na Parafilm. Certifique-se de que não existem bolhas de ar pela lamela.
   10. Coloque a tampa na câmara de humidade. Enrole a câmara em folha de alumínio para protegê-lo da luz ambiente, e deixe a amostra incubar durante a noite a 4 ° C. A amostra pode ser mantidas nesse estado durante vários dias. Certifique-se de que a câmara de umidade permanece úmido se o armazenamento de longa está prevista.
8. Antes da imagiologia, suavemente colocar lado a célula lamela para cima sobre uma nova placa de 6 cavidades contendo 2 mL de tampão de PHEM por poço.
9. Preparar tampões de imagem à base de tiol-scavenged oxigénio utilizando as seguintes soluções de reserva: 1 M de glicose, cisteamina 1 M, e 100x de glucose oxidase / MIXT enzima de catalaseure (4 mg de catalase e 10 mg de glucose oxidase em 100 ul de tampão de PHEM, bem misturado por vórtex ^28). Logo antes de imagiologia, misturar 75 mL de solução 1 M de glicose, 30 ml de solução 1 M de cisteamina, e 3 ul de mistura enzimática da 100x. Ajustar o volume para 300 ul com tampão de PHEM e utilizar imediatamente após a mistura para montagem da amostra.
10. Para iPALM, preparar a amostra de imagem usando um pré-limpeza # 1.5 lamela (22 mm de diâmetro).
    1. Em alternativa, usar uma lâmina de vidro (3 "x 1") com um espaçador de dupla face adesiva para auxiliar na montagem se baseia-astigmatismo 3D-TEMPESTADE ¹² é para ser utilizado em vez disso.
    2. Para montar a amostra de imagem, use uma pinça fina para remover delicadamente a lamela espécime do buffer bem. Em seguida, rapidamente e bata suavemente o excesso de tampão por tocar a borda da lamela com papel absorvente dobrada.
    3. Coloque o lado das células lamela voltado para cima em um pedaço de papel de lente limpa. Lavar a amostracolocando 30 - 50 ul de tampão de amostra de imagem para o, e remover o excesso de tampão através da inclinação e batendo com papel absorvente dobrada.
    4. Repetir o passo de enxaguamento algumas vezes, e, em seguida, colocar 30 - 50 ul de tampão de imagem sobre a amostra. Secar a extremidade da lamela e colocar vários pontos muito pequenos de epoxi de cura rápida na área seca.
    5. Lentamente, abaixe outra # 1.5 lamela pré-limpeza (normal, lamela redondo, de 18 mm de diâmetro) para o centro da lamela contendo células de 22 mm. Deixe o tampão de imagem molhar ambos os esfregaços por acção capilar. Os pequenos pontos de epóxi de cura rápida devem aderir a ambos os esfregaços.
    6. Pressione suavemente sobre a amostra montada com papel absorvente dobrado para espalhar a pressão uniformemente. Utilize uma pressão suficiente para fazer célula-fina da amostra e até mesmo (<15 um), mas não tanto quanto para esmagar as células. Medir a espessura adequada, observando padrão de anéis de Newton. Além disso, certifique-se de executar esta stEP suavemente para minimizar as bolhas de ar. Se necessário, praticar com esfregaços vazias várias vezes de antemão.
11. Selar a amostra com derreteu vaselina-lanolina em parafina (valap, estoque preparado a partir de 100 g cada de vaselina, lanolina e parafina derretida em conjunto) ^29, enxaguar a amostra selada com DDH ₂ O, e seque com ar comprimido. A amostra está agora pronto para montagem sobre o microscópio para a imagem latente.

2. A colocação da amostra e Alinhamento iPALM

1. Mover a lente objectiva topo carregados por mola para cima para permitir a remoção do suporte da amostra. Coloque a amostra lacrados, preparados na etapa 1.10 no suporte da amostra e seguro, com vários pequenos ímãs de terras raras. Aplicar o óleo de imersão em ambos os lados da amostra de imagem. Coloque o suporte de amostra de volta para o caminho óptico e delicadamente abaixar a lente objetiva superior.
2. Ligue os lasers de excitação. Ligue o dispositivo Electron Multiplicando Charge-Coupled (EMCCD) câmera no modo de transferência de quadro.
   1. Gire nos filtros de emissão adequados. Ativar um obturador mecânico para bloquear o topo caminho do feixe (Figura 1A) e abrir o caminho do feixe de fundo. Traga a lente objetiva de fundo em foco pela tradução em pequenos incrementos usando o atuador piezo.
   2. Uma vez que o fiducial está em foco, abrir o percurso de feixe superior, bloqueando o percurso do feixe de fundo e trazer a lente objectiva topo para o foco de um modo semelhante. Monitorar a largura da fiducial no monitor do computador para a focagem ideal.
3. Para centração adequada, aberta tanto a superior e percursos de feixes de fundo. ajustar manualmente a lente objetiva topo, enquanto o objetivo do fundo é mantido constante usando um par de parafusos de ajuste micro-fino, até que as imagens fiduciais são sobrepostas, tanto quanto possível, de preferência dentro de um pixel.
   1. Posteriormente, realizar ajustes finos para que as imagens de referência no passo 2.3 sobreposição dentro de um décimo de um pixel de EMCCD. Ajuste o topo2 eixos espelhos montados em piezo através do software de controle, mantendo ambas as lentes objetivas ea reflexão de fundo espelha constante. Compare os centros das fiducials do topo e no fundo visualizações objetivas através da tela do computador para orientar o processo.

3. A calibração do Setup iPALM

Observação: Uma vez que a emissão de fluorescência é incoerente, por interferência a ser observado em iPALM, a comprimentos de percurso através da parte superior e inferior objectivos devem estar próximos uns dos outros, dentro de poucos microns. Isto pode ser conseguido como segue:

1. Com os lasers no, as câmaras de fluxo contínuo, ea parte superior e inferior caminhos do feixe aberto, oscilar o suporte de amostras Z-piezoeléctrica, que utiliza uma forma de onda de tensão sinusoidal gerada pelo software de controlo para uma oscilação do eixo z contínua ao longo de uma amplitude de 400 nm .
2. Tirando vantagem do facto de que, quando fora de um alinhamento óptimo, a intensidade fiducial varia pouco com tele oscilação, traduzir manualmente o conjunto divisor de feixe motorizado para cima ou para baixo até que a intensidade das oscila fiduciais devido ao efeito de interferência de fóton único desejado. Isto significa a próxima correspondência dos comprimentos de percurso óptico. Um rácio de pico a vale de> 10 pode ser conseguida em casos ideais (Figura 1D).
3. Para garantir que tanto a amplitude ea fase em cada superfície são tão uniforme quanto possível em todo o campo, ajustar o espelho inferior do conjunto divisor de feixe em pequenos passos para ajustar a distância e os ângulos de inclinação. Execute divisor de feixe fino de alinhamento, traduzindo a amostra em 8 Nm z-passos acima de 800 nm.
   1. Monitorar a intensidade fiducial entre câmeras # 1 - 3. Ajuste a altura, posição e inclinação do espelho inferior dentro do conjunto divisor de feixe em pequenos passos, de modo que a fase de oscilação da câmera # 1 em relação à câmera # 2 é maximizada, idealmente a 120 ° C (Figura 1B-D).
   2. Uma vez que o inicialalinhamento estará completo, traduzir a amostra para verificar se há um campo adequado de vista que contém ambas as células a imagem e várias fiducials nas proximidades. Coloque um invólucro em torno do sistema para bloquear a luz difusa e perturbações ambientais. Uma vez que a área de imagem for encontrado, realizar o procedimento no passo 3.4 novamente, e registrar a curva de calibração para uso em subsequentes extracções coordenada z utilizando o comando "Adquirir calibração Scans vs Piezo Amostra Position" na interface principal.

4. Aquisição de Dados

1. Uma vez que uma área desejada é encontrado e a curva de calibração é obtida, digite os nomes de arquivos apropriados para o software. Abra a parte superior e percursos de feixes de fundo. Aumentar a energia de excitação do laser de 642 nm para o máximo. Para Alexa Fluor 647, um período inicial de fluoróforo de desligar pode ser necessário (Figura 2A).
   1. Expor com uma constante de excitação 642 nm durante 5 min, ou mais, se necessário, até Simolécula ngle piscar é observado (Figura 2B). O software permite um aumento automático da activação do foto-405 nm durante o curso da aquisição. Um grande número de quadros de aquisição são geralmente necessários para recursos filamentosos a ser claramente visível (> 50.000 quadros). Quando estiver pronto, começar a aquisição de conjuntos de imagens em bruto utilizando o comando "Start iPALM Aquisição" na interface principal.
2. Durante a aquisição, ajustar o nível de fotoactivação ajustando a intensidade do laser de 405 nm para manter a densidade intermitente adequado, conforme necessário (ver exemplos na Figura 2B).
   NOTA: Uma vez que a aquisição for concluída, o software irá automaticamente converter os arquivos de imagem para o formato binário adequado. O repositório de dados no servidor de computação é montado como uma unidade de rede, permitindo que os dados a ser copiado directamente lá para processamento adicional.

5. Processamento de Dadose Análise

1. Executar análise de localização utilizando um software customizado para extrair os parâmetros de melhor ajuste para todas as moléculas individuais, bem como para os fiduciais ^11,15,23. Obteve-se não só os X, coordenada y, mas também a intensidade que é usado para a análise da curva de calibração.
   1. Importe os dados de calibração matérias adquiridas no passo 3.5 utilizando o comando "Extrair Picos várias etiquetas" no menu "File" para executar a localização única molécula. Após a análise de localização inicial, coordenadas obtidas a partir de câmaras # 1 - 3 estão presentes em canais vermelho, verde e azul, respectivamente, e pode ser guardado para posterior análise usando o comando "Guardar processado como IDL (sav)" sob o título " menu arquivo ".
2. Para trazer os dados das câmeras # 1 - 3 em registo com as fiducials fluorescentes embutidas nas lamelas, selecione vários fiducials brilhantes para fornecer cobertura da imagem central (por exemplo,Figura 1B), utilizando o comando "Anchor Fiducial Pontos" no menu "Transformações de Imagens". Use os conjuntos triplos de localização de coordenadas a partir de câmeras # 1 - 3 obtidos a partir dos fiducials brilhantes no passo 5.1 para calcular a rotação e a matriz de escala que vai trazer câmeras # 1 e # 3 no registrador com câmera # 2. Com um número suficientemente grande de fiducials, de ordem superior deformação polinomial pode ser realizada para melhor se encaixa.
3. Uma vez que a matriz de transformação é calculada, transformar os dados brutos de câmaras # 1 - 3 em conjunto para obter os dados não processados ​​somados. Realizar outra rodada de análise de localização para produzir um mais precisas x, y-coordenar e determinar a contribuição relativa de cada canal da câmera para os dados brutos somados; use o comando "Transformar Raw, Salvar e Salvar Sum (.dat)" sob o menu "Transformações de Imagens". Esta relação da intensidade contém a informação coordenada z.
4. Selecione um fiducial brilhante e executar z-calibração montagem usando a função "Test Wind Point 3D" na caixa de diálogo pop-up, clicando em "Z-coordenar as operações" sob o menu "Funções especiais". Isso vai caber funções de 3 senoidais para as intensidades dos 3 canais de câmera para determinar a curva de calibração. O arquivo de calibração é então guardado para uso posterior sobre os principais conjuntos de dados.
5. Para testar a qualidade da curva de calibração, efectuar a extracção coordenada z, tal como descrito anteriormente ^23. Para fiducials bem-comportados em um sistema bem calibrado, o coordenada z deve escalar linearmente, uma vez que os conjuntos de dados de calibração são tomadas com um movimento linear em z-position. Além disso, o Z-posições de todos os fiduciais deve ser dimensionada com uma inclinação semelhante.
6. Uma vez que uma calibração satisfatória é obtida, execute localização e análise de transformação para os conjuntos de dados de imagem não processados ​​adquiridos na etapa 4 a seguir procedimento idêntico ao descrito nos passos 5,1-5,3. Quando terminar, carregue o arquivo de calibração a partir do passo 5.4 e realizar a extração coordenada z utilizando as funções "Pick WND Arquivo" e "Extrair Z coordenadas" na caixa de diálogo pop-up, clicando em "Z-coordenar as operações" sob o menu "Funções especiais".
   Observação: Uma vez que o tempo de aquisição é> 15 min, desvio mecânico é de se esperar.
7. Para realizar correção de desvio em x, y, selecione um fiducial brilhante a partir das coordenadas de localização. Este fiducial deve estar presente em todos os quadros. Em seguida, use o x, a deriva do fiducial coordenada y para alinhar todas as outras coordenadas dentro do mesmo quadro de volta para o registro (Figura 3A-B) usando a função "Test / Escrever Estrela Guia" sob o menu "Transformações de Imagens". Registro coordenada Z pode ser realizada de forma semelhante, acessando o "Test Guide Star" e "Write Estrela Guia" funções na caixa de diálogo pop-up, clicando em "Z-coordenar as operações" sob o menu "Funções especiais".
8. Como a amostra pode apresentar ligeira inclinação, faça a correção de inclinação, fornecendo os x, y, z-coordenadas de 3 pontos de referência que define o plano que deve ser definido nível usando a função "Remover XYZ Tilt" na caixa de diálogo pop-up, clicando em " Z-coordenar as operações "sob o menu" Funções especiais ".
9. Subsequente à deriva e inclinação correções, gravar as coordenadas de localização. Reconstruir uma imagem de super resolução para análise posterior (Figura 4A-D), usando o comando "render" na interface principal. A cor pode ser usado para indicar a coordenada z. Alternativamente, uma vista lateral da área seleccionada também pode ser processado. As coordenadas de localização podem ser exportados como arquivos de texto para posterior quantificação, ou a imagem reconstruída pode ser salva como um arquivo .tif.

requisitos críticos para iPALM são o alinhamento, registro e calibração dos sistemas ópticos. Estes são necessários para garantir a interferência adequada dentro do 3-way divisor de feixe requisito para extração coordenada z. Para permitir a monitorização contínua, fontes pontuais constantes de fluorescência são necessárias. Isto pode ser conseguido usando fluorescente Au ou nanopartículas bimetálicas ²³ cuja fotoluminescência surgir de ressonância de plasma de superfície localizada (LECC). Eles agem como um dipolo única estável em cima de iluminação e geralmente pode ser localizada com 5 - accuracy 10 nm. Estas nanopartículas disponíveis comercialmente emitem um nível de luminosidade dentro da gama da maioria dos fluoróforos de molécula única, de tal forma que ambos os fluoróforos e os fiducials podem ser visualizados com intensidades semelhantes de excitação e configurações de ganho nas câmeras EMCCD, sem saturação (Figura 1B). Além disso, estes fiducials também muito facilitate de focagem, pelo que a largura aparente do fiduciais pode ser monitorizada durante o ajuste do foco. Além disso, a limpeza rigorosa da superfície da lamela, como por Piranha decapagem ou limpeza de plasma, também é necessária, uma vez que o fundo falso de fluorescência de esfregaços por limpar ou mal limpos podem facilmente sobrecarregar sinais de molécula única, conforme descrito anteriormente.

iPALM depende de interferometria multifásico para permitir de alta precisão de medição coordenada z simultaneamente com PALM (para x, y). No instrumento iPALM, cada fotão fluorescência emitida pode ser considerado para propagar através de ambos os caminhos ópticos, que, em seguida auto-interferir de 3 vias divisor de feixe fabricado por medida. A coordenada z-se, assim, codificado na fase do fóton interferido. As diferenças de fase mútuo de ~ 120 ° dos feixes de saída da 3-maneira resultado divisor de feixe na variação de intensidade das imagens de molécula única entre o 3 camercomo, permitindo Z - coordenar extracção a partir de uma curva de calibração. Com base nisso, o conjunto do suporte da amostra iPALM é um componente essencial, uma vez que está equipado com um par de actuadores piezoeléctricos, que permitem a tradução nm de precisão em que Z pode ser usado para o alinhamento e calibração.

No foco adequado e alinhamento, a tradução da amostra ao longo do eixo z irá gerar um efeito de interferência. Este manifesta-se como a oscilação da intensidade fiducial entre os três canais de câmara (Figura 1C-D). Essas oscilações também indicam que tanto a caminhos feixe óptico superior e inferior são quase alcançaram, permitindo a interferência de fóton único. Geralmente, ao ligar o aparelho, as fases iniciais de cada câmara não ser o ideal e a verificação de Z-posição é necessária como uma ferramenta de diagnóstico para a calibração e alinhamento. Para chegar às fases óptimas, o espelho inferior do divisor de feixe(Figura 1A) pode ser ajustado usando o estágio tip-tilt piezoelétrico. A verificação de calibração de z-posição é tomada depois de cada pequeno 10 - Ajuste nm 20. A intensidade da fiducial em cada canal é então determinada por análise de localização (ou seja, uma função de encaixe com 2D-Gaussiana). A intensidade normalizada pela intensidade total pode ser aproximada por uma forma de onda sinusoidal, permitindo que o termo de fase a ser calculado; Assim, pode ser determinada a fase correspondente a cada câmara, como pode ser visto na Figura 1C. Notamos que o princípio interferência de fóton único utilizado em iPALM também pode ser demonstrada através de um muito mais simples de 2 vias divisor de feixe. No entanto, um divisor de feixe 2-maneira é impraticável para a microscopia de resolução super-3D desde ou perto do limite de interferência destrutiva, o sinal de um canal é mínima, o que resulta em estimativas ruidosos de intensidade e localização coordenadas, que limitar efectivamente a coordenada z determinação para o range em que ambas as câmaras têm intensidade substancial (<100 nm). O número mínimo de canais necessários para superar este efeito é de três, e 3- e 4-forma como os sistemas de projecção têm sido descritos na literatura ^11,30.

Em condições óptimas, para um divisor de feixe de 3 vias, as diferenças de fase entre as câmaras 3 deve ser de cerca de 120 °. O divisor de feixe de 3 vias para iPALM contém 3 interfaces de reflexivas, como diagramado na Figura 1A. O divisor de feixe é posicionado acima de um espelho dieléctrico plana, com um intervalo fino preenchido com óleo de combinação de índice de refracção, para permitir o ajuste fino de comprimentos de percurso dentro do divisor de feixe e para conseguir as diferenças de fase óptimas. Como mostrado na Figura 1C-D, no alinhamento apropriado para iPALM, as câmaras estão perto de uma diferença de fase de 120 ° mútuo. Na prática, uma diferença de fase superior a 105 ° é geralmente aceitável. Essa calibração tanto indicates que o sistema está alinhado e que irá ser utilizado para a extracção subsequente coordenada z. Também é útil para avaliar a curva de calibração gerada utilizando diferentes fiducials. A maioria dos fiducials com luminosidade moderada geralmente emitem como um único dipolo, produzindo curvas de calibração bem-comportados. No entanto, os agregados ocasionais de fiducials (muitas vezes aquelas com brilho extremo) podem se comportar de maneira anômala, produzindo curvas de calibração não confiáveis. Também é aconselhável escolher fiduciais perto do centro do campo de imagem e perto da área de interesse biológico (Figura 1B), particularmente uma vez que a alta lente objectivos NA usado na configuração iPALM não é corrigido-campo plano. O campo de visão efetivo é limitado à área central, resulta dos maiores larguras fiduciais em direção à borda do campo.

Posteriormente ao alinhamento inicial, a vista campos de-contendo células com mo desejávelrphology e múltiplas fiducials para garantir uma boa calibração são escolhidos para a imagem latente. Isto pode ser conseguido por traduzindo-se lentamente o suporte de amostra utilizando unidades de servomotor dois eixos. A tradução da amostra irá resultar em alguma desfocagem, uma vez que a amostra não é sempre perfeitamente plano. Portanto, o foco deve ser ajustada continuamente durante a tradução. Uma vez que o campo de imagem foi escolhida, uma nova rodada de calibração para otimizar a curva de calibração é então realizada para afinar o alinhamento do sistema e obter a curva de calibração real. Importante, as áreas sob o núcleo ou regiões com índice de refracção próximos heterogéneo (por exemplo, bolhas de ar) devem ser evitados, em geral, uma vez que estes irão causar alteração significativa do caminho relativo comprimentos, distorcendo a coordenada z.

Com rotulagem de alta densidade, sinais de fluorescência de fluoróforos orgânicos, tais como Alexa Fluor 647 pode ser extremamente brilhante. Como se mostra in Na figura 2A, com a preparação tampão adequado contendo uma alta concentração de tiol (-SH), grupos ^31, o fluoróforo deve ser rapidamente desligado sob alta iluminação de excitação. Isto resulta na supressão dos sinais de fluorescência a partir da maioria das moléculas. Em um dado momento, uma minoria muito pequena de fluoróforos estocasticamente retornar ao estado "on". Estes deverão ser esparsamente distribuídos e, assim, podem ser visualizadas como moléculas individuais para um ou alguns quadros antes de comutar "desligado". A dinâmica photoswitching são fortemente dependentes da intensidade de excitação e a concentração de -SH, e, assim, para um dado sistema, deve ser tomado cuidado para optimizar a densidade de marcação adequada, particularmente uma vez que uma relativamente elevada intensidade de excitação (640-647 nm) é necessária para desligar uma maioria de Alexa Fluor 647 moléculas. Se a excitação não é suficientemente forte, uma fração significativa de Alex Fluor 647 vontadepermanecer no estado "on", resultando em alta fundo, dificuldades na observação única molécula de fluorescência, e, finalmente, a má qualidade única molécula de resultados da localização. Sob uma condição devidamente equilibrada, única molécula de dados brutos deve conter um número suficientemente grande de moléculas (centenas) por quadro (Figura 2B), enquanto cada molécula é escasso o suficiente para permitir a detecção inequívoca e análise de localização. Também é importante notar que, para iPALM, os princípios da photoswitching são idênticos aos da palma da mão ou STORM, e, assim, as amostras adequadamente preparados para iPALM pode ser usado diretamente nos sistemas 3D-PALM ou 3D-TEMPESTADE mais simples. Para adquirir uma densidade suficientemente elevada para satisfazer as moléculas de amostragem de Nyquist, geralmente 50.000 ou mais quadros de dados em bruto são necessárias (isto é, 150.000 quadros totais para as câmaras 3). Como a aquisição progride, uma fração cada vez maior de fluoróforos podem ser esgotados por fotodegradação destrutiva, resultando em longarinaSer densidade única molécula. Para compensar isso, breves pulsos de 405 luz azul nm (405 nm) pode ser iluminado sobre a amostra em intervalos de promover a activação fluoróforo.

Devido ao tempo de aquisição de longo necessário, os resultados ideais para iPALM (ou microscopia localização única molécula em geral) requerem baixa deriva da amostra e / ou boa correção deriva. Por exemplo, usando o tempo de exposição de 50 mseg no modo de transferência de estrutura (taxa de quadros 20 Hz), o tempo total de aquisição para 50.000 molduras é de 42 min. Durante esse período, é esperado tração mecânica ao longo de dezenas de nm. Com efeito, para além da elevada precisão de localização e de alta densidade de rotulagem, a resolução também depende da qualidade de correcção de desvio. Existem múltiplas origens para estes desvios com flutuação térmica sendo uma das principais causas. Devido a esta consideração, sempre que possível, as partes iPALM são personalizados-usinado com Invar, uma liga de baixa expansão térmica, ou aço inoxidável,sendo que ambos têm muito mais baixas características de expansão térmica do que latão ou alumínio. Infelizmente, isto também impõe um custo adicional em relação à de alumínio, que é um metal mais comumente usado para componentes optomechanical, sendo muito mais barato e mais fácil de maquinar. Outras fontes de tração pode ser vibrações mecânicas de equipamentos periféricos, meio-ambiente, ou correntes de ar. Estes devem ser minimizados, colocando o sistema numa caixa adequada e por redireccionar a direcção do fluxo de ar na área do microscópio. A configuração deve ser construída sobre uma mesa óptica de grau de pesquisa e, se possível componentes, contendo ventilador deve ser colocado fora da mesa óptica. No entanto, apesar de todas as precauções, uma certa quantidade de desvio permanecerá. Fundamentalmente, estes desvios deve ser minimizado de modo que a imagem em foco permanece todo o tempo de aquisição. Nos nossos sistemas, estes métodos passivos suficiente para minimizar o desvio para níveis aceitáveis. No entanto, deve ser possível para implementar COM tração activamétodos de compensação para permitir a longo prazo e de imagem de alta precisão ^32.

Após a transformação dos dados brutos, as coordenadas de localização 3D pode ser obtida com tipicamente 5-10.000.000 picos de molécula única por conjunto de dados. Como mostrado na Figura 3, o desvio como uma função do tempo, pode ser visualizada a partir das coordenadas de localização das fiduciais. Várias fiduciais podem ser usadas para calcular a trajectória de correcção médio deriva (Figura 3A-B). Além disso, é habitual para filtrar picos que se encaixam mal para a função de Gauss-2D durante a análise da localização. Isto pode ser devido a ruídos espúrios ou picos de molécula única que se sobrepõem parcialmente e podem ser diferenciadas pela grande erro quadrático residual calculada durante o processo de montagem. Picos com baixa luminosidade (como indicado pela contagem de fotão) e, assim, uma maior incerteza (isto é, maior do que ~ 25 nm) são também filtrados, umaestes s provavelmente surgem da fluorescência de fundo não específico. Da mesma forma, os picos para o qual as intensidades dos 3 canais de câmara cabem mal à curva de calibração também são rejeitadas, como as coordenadas z obtidos são confiáveis. Deve notar-se que o conteúdo de informação completo de iPALM (e microscopia de localização em geral) é enorme, uma vez que os resultados da análise não apenas nas coordenadas fluoróforo, mas também em vários parâmetros adicionais tais como a intensidade, largura, brilho, etc. No entanto, na prática, uma vez que relativamente poucas ferramentas computacionais estão atualmente disponíveis para análise no espaço de coordenadas, as coordenadas de localização são normalmente prestados ou reconstruídas em imagens baseadas em pixel para análise posterior.

A abordagem comumente utilizada para a reconstrução da imagem iPALM é para representar cada localização coordenar com uma função de Gauss 2D normalizada, com a incerteza de localização definida como a Gauwidth ssian ^33. Assim, as coordenadas de alta precisão (geralmente picos de molécula única com alto brilho contra o fundo baixo) aparecem como picos afiados e estreitos, enquanto as coordenadas de baixa precisão (tipicamente baixa luminosidade ou de alta fundo de molécula única picos) aparecem como dimmer e mais ampla picos. Desta maneira, cada molécula contribui para a mesma quantidade de intensidade para a imagem. Para um conjunto de dados 3D, a coordenada z pode ser representado de cor, tipicamente com base em uma escala de cor (Figura 4C-D). Alternativamente, as imagens podem ser mostrados como uma vista lateral (x, z ou y, z) de projeção ou como volumes. Um número de software disponível ao público pode ser utilizado para visualizar dados tais ^34.

Como mostrado nas Figuras 4-6, as imagens iPALM originar uma melhoria significativa sobre a microscopia de fluorescência limitado por difração. A arquitectura F-actina em células HUVEC pode ser visualizado com muito especial aumentada resolução. Em regiões do córtex, redes de filamentos distintos pode ser visto, enquanto que nos feixes de fibras de stress, e lamelip�ios, as redes de F-actina densamente empacotados são observados para ter uma textura filamentosa, embora os filamentos individuais não são distinguíveis. Isto é provavelmente devido às limitações tanto o brilho dos fluoróforos e a precisão de localização. A presença de filamentos corticais distintas sugere que a ultra-estrutura da rede de f-actina é suficientemente bem preservado; Assim, iPALM poderia ser uma ferramenta útil para caracterizar a arquitetura cortical. Na Figura 5, uma sub-região de um células HUVEC é apresentado com os perfis de um filamento de actina quantificada. Pode ver-se que o Z-histograma de um filamento é de cerca de 15 nm de largura, relativamente pequena em comparação com ~ 45 nm para a transversal (X, Y) vista, mostrando que iPALM produz uma melhoria significativa resolução em Z-resolução em relação ao X, Y-plano, como seria de esperar. No entanto, uma vez que o actuai diâmetro de F-actina é ~ 8 nm, não é claro se o filamento é observado um único filamento ou um feixe de alguns filamentos. Imagiologia correlativo usando iPALM e EM pode ser uma estratégia útil para caracterização adicional da arquitectura F-actina, embora esta abordagem não tem sido utilizada para estudar a F-actina ainda ^23.

Figura 1: Diagrama esquemático da iPALM 3-D Super Resolution Microscopia. A) Esquema de iPALM óptica. As lentes objetivas dupla (Nikon, NA 1.49 60X) permitir que cada fóton fluorescência emitida para propagar tanto através da parte superior e percursos de feixes ópticos de fundo, e eles são redirecionados para interferir na divisor de feixe por um par de espelhos orientados a 22,5 °. A fase do fotão auto-interferência é directamente proporcional à δZ, que codifica, assim, a coordenada z do fluoróforo, e pode ser medido nosing um divisor de feixe de 3 vias com diferenças de fase mútua de ~ 120 ° entre os três feixes de saída. Eles estão focados pelas lentes de tubo (L1-L3, F = 400 nm) e filtrado pelo filtro de emissão (F1 - F3). Por conseguinte, cada molécula individual aparece com diferentes intensidades entre câmaras (EMCCD1-3) mas em x semelhantes, coordenadas y. (A) é reproduzido e modificado a partir de Ref. 11. (B) imagem limitado por difração de células HUVEC marcados para f-actina com Alexa Fluor 647. Os pontos brilhantes denotam Au fiducials nanopartículas. Os ângulos de fase para câmaras # 1-3 são representados por linhas vermelhas, verdes e azuis, respectivamente, centrado em cada fiducial, com a diferença de fase entre as câmaras # 1-3 indicado. Barra de escala:. 5 mm (C) imagens Fiducial mostrando os efeitos de interferometria. Imagens de um fiducial nanopartículas Au para cada câmera (CCD1-3) ou total (soma), tomado como o z-position (em nm, na linha inferior) é digitalizado para a calibração. A intensidade dentro de EACH câmara pode ser visto a oscilar com uma relação de fase, tal como mostrado em (B). curva de calibração (D) iPALM. A amostra é a translação ao longo do eixo z. As intensidades de um fiducial nanopartículas Au para o EMCCD1-3 são mostrados como linhas vermelhas, verdes e azuis, respectivamente (em cima). Estes são então normalizados e se encaixam para determinar as diferenças de fase (em baixo). Durante o alinhamento, o sistema é ajustada para alcançar as diferenças de fase entre os máximos todas as três câmaras. A curva de calibração é tomada em cada local de imagem para usar na extração da coordenada z de cada única molécula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagem única molécula de Photoswitching Alexa Fluor 647-phalloidin como etiquetas de actina. (A) passo inicial photoswitching. F-actina em células fixas é rotulado a uma alta densidade por faloidina conjugada com Alexa Fluor 647. alta intensidade de iluminação em um contendo tiol resultados buffer de imagem em rápida switch-off da maioria dos fluoróforos. (B) quadros representativos de uma única molécula de matéria- quadros. No piscar de estado estacionário, o activado Alexa Fluor 647 deve ser suficientemente escassa que as moléculas individuais individuais aparecem como uma mancha do tamanho PSF-. Imagens das mesmas células mostrado em (A), mostrado com contraste inversa. Barras de escala em A e B:. 5 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Correção de tração usando Multip. le Fiducials coordenadas de localização por quatro fiducials (A, coordenada x; B, coordenada y) foram utilizados para calcular a deriva usando acessórios polinomiais ^(5ª ordem, parâmetros de ajuste no canto superior direito). A trajetória média desvio permite a correção de deriva com sub-5 nm de precisão (x: 3.085 nm, y: 3,606 nm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Visualização de 3-D Arquitectura F-actina por iPALM. (A) imagem limitado por difração de células HUVEC com F-actina marcada por Alexa Fluor 647-faloidina (correspondente ao sub-áreas da célula na Figura 2). O ponto positivo é devido aos fiducials de nanopartículas de Au. (B) Localização coordenadas determinadas por análise iPALM para a área em (A). (C) Imagem reconstruída iPALM, com cada localização coordenada proferida por um 2D-Gaussian com a largura correspondente a incerteza de localização. A coordenada z é colorido de acordo com a barra de cores. Áreas de recursos filamentosos densas e esparsas podem ser vistos. Barras de escala (AC): 1 mm (D) Zoom-in vista da área de box em C mostrando filamentosa topologia de actina cortical.. Barra de escala:. 250 nm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Dimensão nanoescala de F-actina visualizado por iPALM. (A) imagem reconstruída iPALM células HUVEC com F-actina marcada b y Alexa Fluor 647-phalloidin. A cor indica a coordenada z de acordo com a barra de cores. Barra de escala:. 1 | iM (B) transversal secção transversal histograma de x, y as coordenadas de localização ao longo do eixo longo da área de box em (A). Para obter o histograma, as coordenadas são projetadas sobre o longo eixo da caixa e finalmente resolvido com a 5 nm bin-size. A curva de cinza indica um melhor ajuste ao histograma de Gauss, com uma largura total a meia altura (FWHM) de 43,88 nm. (C) Histograma do Z-posição de localização de coordenadas na área de box em (A). O Z-posições são binned com um tamanho bin de 1 nm. A curva de cinza indica um melhor ajuste de Gauss para o histograma, com um FWHM de 17,50 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6:. Comparação de iPALM imagem de F-actina Usando diferentes reagentes de marcação imagens reconstruídas iPALM de F-actina marcada usando Alexa Fluor faloidina 647-conjugado (A), Alexa Fluor faloidina 568 conjugado com (B), ou por transfecção com actina -mEos2 vector de expressão de fusão de proteína (C). Barras de escala (AC):. 1 mícron Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O sistema óptico de iPALM baseia-se no objectivo de criação de uma dupla-4-oposição π, como mostrado na Figura 1A. A configuração é construído usando peças tanto custom-usinados e comerciais opto-mecânico, como descrito anteriormente ²³ e listados na Tabela 1. Além da nossa configuração, o Howard Hughes Medical Institute (HHMI) hospeda um sistema que é acessível à comunidade científica no Imaging Center avançada no Campus Janelia Research. Para os desenhos completos mecânicos, esquemas de controle e software, os leitores são encorajados a perguntarem com Harald Hess em HHMI para mais informações. A principal vantagem para a utilização iPALM, bem como outros métodos de microscopia de localização de molécula única para a visualização de f-actina é a relativa facilidade de preparação da amostra em comparação com técnicas de EM, que geralmente requerem processamento de amostras duras, a preparação laboriosa e profissionais altamente qualificados ^3,23 . Additionally, a fluorescência é naturalmente passíveis de imagem multicanal, que continua a ser difícil para EM. No entanto, tal como descrito mais abaixo, há várias limitações actuais para a abordagem, tanto em termos de preparação de amostra e processamento de imagem. Em primeiro lugar, como é o caso para a preparação da amostra EM, deve ser tomado cuidado para assegurar uma boa preservação ultra-estrutural das amostras ^35, uma vez que um protocolo adequado para um nível limitado por difração de resolução pode provocar perturbações graves a nível nanoescala. Para imagens de actina, fixação adequada das células é um fator importante que afeta a qualidade da amostra. O glutaraldeído é um fixador preferida uma vez que preserva o citoesqueleto e a membrana muito bem, apesar de em casos de co-coloração com anticorpo, sítios epitópicos podia ser afectada. Em tais casos, paraformaldeído podem oferecer um compromisso aceitável, uma vez que tende a preservar melhor locais epítopo de anticorpo. Importante para a microscopia de localização única molécula, estes fixadores tendempara gerar autofluorescência de fundo; Assim, a pós-fixação de têmpera por boro-hidreto é necessário, em especial no caso de glutaraldeído.

Além disso, a seleção adequada de fluoróforos e estratégias de rotulagem estão entre os fatores mais importantes para experiências bem sucedidas. Devido à dimensão nanoescala de F-actina, altas densidades de rótulos são necessários para capturar as redes filamentosas subjacentes, conforme estipulado pelo Nyquist teorema da amostragem ^36. Para a actina, faloidina permite rotulagem muito alta densidade, com uma vasta variedade de fluoróforos orgânicos disponíveis a partir de diversos fabricantes. No entanto, uma vez que é tóxico faloidina, fixação e permeabilização de células é necessária. estratégias alternativas para ao vivo de células rotulagem actina compatíveis incluem o uso de fusão de proteínas fluorescentes (FP), ou com a actina monomérica ou com pequenos polipeptídeos de ligação à actina. No entanto, descobrimos que estes tendem a produzir uma densidade de rotulagem menor em comparação com phalloidin ( Figura 6). Notamos que a actina purificado pode também ser directamente marcado com fluoróforos orgânicos e introduzido em células vivas por electroporação ^37, mas esta abordagem deverá ser dispendiosa e de trabalho intensivo. Em termos de fluoróforos, Alexa Fluor 647 tem sido geralmente encontrada para oferecer consistentemente bom desempenho para a microscopia de localização. Isto pode ser descrito em termos da relação de contraste entre o brilho quociente único pico molécula e a fluorescência de fundo ^38. A densidade de rotulagem superior requer uma relação de contraste mais elevado, uma vez que o fundo poderia cumulativamente degradar a precisão de localização. Na nossa experiência, vários outros fluoróforos, tais como ATTO488, ATTO520, e Alexa Fluor 568 (Figura 6B), pode ser usado para visualizar a F-actina, mas com resultados menos consistentes em comparação com Alexa Fluor 647, que oferece um desempenho photoswitching robusta entre uma vasta gama de condições de tampão de imagem.

Em termos de processo de imagem, as limitações dos métodos de imagem biológicos têm sido muitas vezes conceituada como um trade-off na resolução espacial, resolução temporal, e variam imageologia (campo de visão / profundidade de campo e duração) ^39. Isto aplica-se igualmente às vantagens e limitações de iPALM. Em comparação com outras técnicas de microscopia de resolução super-3-dimensionais, iPALM manteve-se a abordagem de resolução óptica de mais alta até à data, particularmente ao longo do eixo z, com a resolução-Z quase 2 vezes melhor do que X, Y-resolução ^11. No entanto, a dependência de iPALM em interferometria para uma alta resolução Z também impõe uma restrição à profundidade da imagem, uma vez que a curva de calibração é periódico. Em outras palavras, z coordenadas repetir todos os 250 nm ou menos (para ~ 700 nm comprimento de onda de emissão de Alexa Fluor 647). Na prática, isto pode ser abordado através da utilização TIRF iluminação, o que limita a zona de excitação para dentro da profundidade de campo evanescente <200 nm a partir da lamela. Assim, fluoróforos mais profundamente a amostra não está animado e permanecer invisível. No entanto, isso também limita as estruturas biológicas que podem ser visualizados para aqueles em estreita proximidade com a lamela, tais como adesões focais, citoesqueleto cortical, e membrana de plasma ventral, enquanto mais estruturas interiores estão fora de alcance. Exemplares fixos, um remédio é realizar cryosectioning ^40. No entanto, essa abordagem é altamente trabalhoso e requer conhecimento especializado que não é comumente acessível.

Alternativamente, iPALM pode ser adaptado para um z-gama alargada através da combinação de interferometria com o esquema de astigmatismo-desfocagem ¹² utilizadas em 3D-STORM. Esta abordagem proporciona dupla coordenada z leituras, a primeira de interferometria, que é de alta precisão, mas periódica, ea segunda pela desfocagem astigmatismo, que é menos preciso, mas não periódica. Este último pode então ser usado para "desempacotar" ou quebrar a degenerescênciaos interferométricos z-coordenadas, permitindo, assim, a triplicação da profundidade da imagem iPALM a ~ 750 nm, efetivamente se aproximar da profundidade focal intrínseca de altas lentes objetivas de NA. Com desenrolamento de fase, iPALM tem sido usada para estruturas de imagem no fundo das amostras, tais como mitocôndrias, embora com precisão ligeiramente reduzida em 3 dimensões, devido à desfocagem do adicional ^40.

Outra limitação intrínseca do iPALM é a velocidade de imagem. Uma vez que um grande número de quadros são necessários para obter uma elevada densidade de coordenadas de localização, a velocidade de câmara é geralmente o limite para a velocidade de aquisição. Com câmaras EMCCD actuais rodando a 10 - 20 MHz taxas de leitura, dezenas de minutos são necessários para um número suficiente de quadros. Tais escalas de tempo longas exigem que o espécime ser corrigido. Aqui, os recentes avanços na tecnologia de câmera, como o Complementary Metal Oxide Semiconductor câmera muito mais rápido científica (scmos), pode permitir um rápido aumento na imvelocidade de ⁴¹ envelhecimento, embora isto não tenha sido implementado para iPALM ainda. Para algumas abordagens de molécula única de microscopia de localização, um campo de uma única molécula de denso podem ser analisadas utilizando um algoritmo modificado ⁴² ou comprimido de detecção ^43. A adaptação de tais estratégias podem também acelerar iPALM, permitindo imagens mais densas de molécula única e, portanto, menos quadros.

Com limitações de velocidade e de imagem gama e pontos fortes em resolução espacial, um grande pedido de iPALM é como um método ultra-estrutural que aproveita os benefícios da marcação fluorescente para desvendar organização nanoescala de proteínas específicas ^14,15,44. Mais melhorias, tanto em termos de tecnologias ópticas e fluoróforo, deverá permitir reforçar ainda mais na resolução espacial iPALM. Por exemplo, processamento de imagem iPALM atualmente emprega uma abordagem relativamente simples aproximação de primeira ordem, com cada única molécula modelada por uma função 2D-Gaussian e comosumed ser um isotopicamente média dipolo. Isto poderia ser aumentada com métodos recentes, que empregam um modelo mais preciso da função de ponto de difusão e orientação dipolo, ou tratamento explícito de aberrações ópticas em todo o campo de visão para melhorar significativamente a resolução espacial. Da mesma forma, photocaging tem sido relatado, o que aumenta o brilho fluoróforo por ordens de magnitude ^45. De fato, desde elementos-chave da sua organização ultra-estrutural têm sido bem caracterizado, o citoesqueleto de actina F poderia ser um sistema modelo altamente valiosa para testar novos desenvolvimentos metodológicos em iPALM. A capacidade de analisar organização proteína por microscopia de luz com o poder verdadeiro EM-nível resolver é esperado para aumentar consideravelmente nossa compreensão da miríade de aspectos da estrutura e função celular.

Os autores não têm nada para revelar.

YW e PK agradecem apoio financeiro da Fundação de Pesquisa Nacional de Cingapura, atribuído a PK (NRF-NRFF-2011-04 e NRF2012NRF-CRP001-084). Agradecemos também aos abertas de laboratório e de núcleo de microscopia instalações MBI para suporte de infraestrutura.