Transplantes competitivos para avaliar hematopoéticas aptidão Stem Cell

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

A hematopoiese é um processo regenerativo que garante o reabastecimento das células do sangue que foram perdidos devido a uma lesão, a radiação e a morte celular. Este processo é assegurada por células estaminais hematopoiéticas (HSC), que em grande parte residem na medula óssea de adultos. Além disso, as células estaminais hematopoiéticas podem ser utilizados para fins terapêuticos em doenças auto-imunes, doenças malignas hematológicas e imunodeficiências ^1. Assim, há uma necessidade de compreender melhor os mecanismos que regulam a função HSC, incluindo sua expansão proliferativa e sua capacidade de alcançar e enxertar a medula óssea receptor após o transplante. Embora estudos recentes tenham relatado vários marcadores de superfície celular, incluindo os membros da família SLAM CD150 e CD48, para enriquecer prospectivamente HSCs adultos e fetais HSCs para aproximadamente 50% de pureza ^2-4, a medida padrão de ouro para hsc funcional permanece um ensaio in vivo para repovoar determinar a sua capacidade de restabelecer sangue cprodução ell em um host irradiado ^5.

O ensaio de repovoamento clonal in vivo foi inicialmente desenvolvido por Till e McCulloch ⁶ e desde então tem sido aperfeiçoado e expandido. Tal como inicialmente definido, HSCs garantir a produção de glóbulos ao longo da vida através da auto-renovação e diferenciação. A transferência de HSCs para um destinatário irradiado permite-nos assim a avaliar: a sua capacidade de se diferenciar por meio da análise das diferentes linhagens de células sanguíneas (linfócitos T, linfócitos B, granulócitos, monócitos) e a sua capacidade de auto-renovação por transplante em série. O ensaio que geralmente envolvem a comparação da funcionalidade e / ou a quantidade de duas populações de HSCs, por exemplo, células provenientes de dois ratinhos de diferentes genótipos ou células que foram tratadas ou não tratadas com diferentes factores que podem influenciar a manutenção ou expansão de HSCs em cultura. quimerismo doador, ou a contribuição de doadores transferidos HSCs tO produção de células sanguíneas pode ser então determinada por análise de citometria de fluxo no sangue periférico e de medula óssea por meio de marcadores de superfície celular ou outros métodos que irão distinguir células dadoras do recipiente, ou hospedeiro. Os marcadores mais utilizados são certamente os dois alelos para o gene Ptprc ou antígeno CD45 leucócitos ⁷ que temos escolhido para os exemplos fornecidos abaixo.

O ensaio de repovoamento clonal pode ser competitiva ou não competitiva. Em uma configuração não-competitivo, de controlo e de teste HSCs são transferidos para ratinhos receptores separados e os resultados para cada tipo de célula será independente da outra. Num ambiente competitivo, a função tanto de teste e de controlo HSCs é medido contra uma população de HSCs concorrente. O protocolo descrito aqui usa a configuração competitiva, mas também pode ser adaptado para situações não-competitivas. Ambas as abordagens têm suas vantagens e limitações, e vamos compará-las em detalhe nodiscussão. Nós também descrevem abordagens diferentes para garantir a equidade no número de HSCs transplantadas, explicam como adaptar o ensaio para a quantificação de HSCs, limitando ensaio de diluição (LDA), e fornecer exemplos de ambos os transplantes de bem e mal sucedidas para a interpretação dos resultados.

Todos os procedimentos descritos neste protocolo ter sido aprovado pelo comitê de ética animal institucional e seguir o Canadian Council on Animal Care orientações.

Nota: Para manter condições estéreis / ou específicas isentos de agentes patogénicos de habitação, realizar todos os procedimentos que envolvem a manipulação direta de ratos vivos dentro de uma cabine de segurança biológica ou uma capela de fluxo laminar. Limpe ou esterilizar gaiolas, dispositivos de retenção, materiais de construção, comida e água fornecida aos animais de forma adequada. Use, agulhas descartáveis ​​única estéreis para as injeções e para coleta de sangue. A técnica asséptica é crucial durante a preparação do enxerto.

1. Preparação de ratinhos receptores

1. Identificar ratos receptores com entalhes de ouvido (ou outro método aprovado pelo Comitê Local ética animal ⁸⁾ para permitir indivíduo acompanhamento da reconstituição sangue e medula óssea periférica ao longo do tempo. Pesa-se a ratinhos para pós-transplante de seguimento. Noscamundongos destinatário E que estão entre 7 e 12 semanas de idade (menos de 25 g).
   Nota: No exemplo fornecido, ratos destinatário CD45.1 ⁺ CD45.2 ⁺ foram criados em casa, atravessando camundongos C57BL / 6 com ratos B6.SJL cong�icas.
2. Irradiar ratinhos receptores com duas doses de 450 rad para destruir a actividade hematopoiética. Submeter a primeira dose no dia antes do transplante e a segunda 1-2 h antes do transplante.
   Nota: raio-x ou raios gama podem ser usados, dependendo da disponibilidade de instalações adequadas.

2. Preparação de doadores e Concorrente Células da Medula Óssea

1. Eutanásia doador (teste e controle; CD45.2 ⁺⁾ e competidor (CD45.1 ^+; B6.SJL) ratos por asfixia com _CO2, seguido por deslocamento cervical ou usando métodos aprovados pelo comitê de ética animal local.
2. Coloque os ratos em suas costas, pernas abertos, em uma placa de Petri vazia ou em uma gaze estéril (para manter a superfície de trabalho limpa) inside uma cabine de segurança biológica. Molhar a pele e a pele com 70% de etanol / 30% _{de H2O} (v / v).
3. Cortar o pé com uma lâmina cirúrgica ou tesoura afiada. Cortar abrir a pele ao longo da perna e afastar a pele com pinças serrilhadas. Cortar o excesso muscular.
4. Deslocar fémur puxando pelo osso da perna e usando lâminas de tesoura contra os ossos pélvicos como uma força contrária. Retire tíbia e fêmur da rótula e remover pedaços restantes de músculos e tendões. Colocar os ossos em 2-3 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) numa placa de cultura de tecidos de 6 poços.
5. Recolha células da medula óssea por rubor os ossos com 5 ml estéril PBS.
   1. Segurar o osso suavemente com uma pinça e inserir uma agulha de 25 G ligada a uma seringa cheia de 1 ml para uma extremidade do osso. Pressionar o êmbolo e recolher as células em um tubo de 15 ml. Repita conforme necessário até que o centro do osso é branco.
6. Dissociar as células por repetidas que passa através da agulhase obter uma suspensão de célula única. Evite bolhas e força em excesso. Nota: Use uma agulha ligeiramente maior (22 L) para melhorar a viabilidade das células nesta etapa.
7. Passar as células através de um filtro de nylon de 70 ^ m a assegurar a suspensão de células uniforme e para remover detritos e aglomerados.
8. Remove-se uma alíquota para contagem de células utilizando um hemocitómetro. Centrifugar a suspensão de células remanescente em 200 xg durante 5 min a 4 ° C. Reajustar a densidade celular como exigido em PBS estéril (10 ⁸ células / ml). Manter as células no gelo.

3. Estabelecer doador da célula Equivalentes HSC

1. Transferir o equivalente a 3 x 10 ⁶ células (30 uL) em 5 ml de um tubo redondo de poliestireno de fundo para a coloração de citometria de fluxo. Adicionar um volume igual de anticorpo não marcado contra CD16 / CD32 para bloquear a coloração não específica (diluído em tampão de coloração (PBS suplementado com albumina de 0,1% de soro de bovino (BSA) e EDTA 1 mM) para uma concentração final de 2,5 ug / ml). Incubar 5 min à TA.
2. Adicionar 90 ul conjugado com fluorocromo anticorpo mistura principal preparada em tampão de coloração: cocktail Lineage biotinilado (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Incubar em gelo durante 30 minutos, ao abrigo da luz.
   Nota: as diluições apropriadas devem ser determinadas para cada lote de anticorpo. Veja a Tabela de Materiais para diluições utilizadas neste estudo.
3. Adicionar 2 ml de tampão de coloração para as células, de vórtice e centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para remover o anticorpo não ligado. Decantar o sobrenadante e pellet ressuspender por um movimento súbito.
4. Adicionar 10 ul de estreptavidina conjugado com fluorocromo diluído em tampão de coloração (ver Materiais Tabela). Incubar em gelo durante 20 minutos, ao abrigo da luz. Lavar como no passo 3.3 para remover estreptavidina não ligado.
5. Adquirir as amostras de células, utilizando um citómetro de fluxo com, pelo menos, seis detectores ^9. Determinar a frequência de Lin ^- Sca1 ⁺ CD117 ⁺ CD135 ^- CD150 ^{+ (avaliado HSCs) em cada amostra, utilizando o modelo de análise apresentado na Figura 2 e conforme relatado anteriormente 10,11.
   Nota: A frequência de HSCs funcionais dentro dessa população pode ser estimado entre 1/3 e 1/5 2,12.}
6. Estabelecer equivalentes HSC estimados para todas as amostras ^11, usando uma amostra (tipicamente, o competidor, B6.SJL CD45.1 ^+, neste exemplo) como linha de base, como detalhado a seguir e na Figura 2.
   1. Calcule o número de células necessárias utilizando as seguintes fórmulas:
      #transplanted HSCs / destinatário = 5 x 10 ⁵ células x estimado frequência HSC (conforme determinado para a amostra de linha de base; este número é geralmente entre 75 e 125 para o tipo selvagem camundongos C57BL / 6) ^10-12.
      Nota: Na figura 2, a amostra A, o resultado é de 139 HSCs.
      # células transplantadas no total (para outras amostras, por exemplo Amostra B na Figura 2) = # transplantados frequência HSCs / HSC.
      Nota: Na figura 2, para a Amostra B, o resultado é 197.826 (ou seja, aproximadamente 2 x 10 ⁵⁾ total de células de medula óssea.
7. Calcular o número total de células necessárias para cada receptor do enxerto para cada amostra, utilizando os resultados obtidos acima.
   Nota: Este número deve ser de 5 x 10 ⁵ para a amostra de referência (concorrente).
   1. Multiplicar o número obtido na etapa 3.7 pelo número de ratinhos receptores e adicionar células suficientes para, pelo menos, dois ratinhos adicionais para compensar o volume morto na seringa.
8. Misture competidor (por exemplo, CD45.1 ⁺⁾ e células de teste (CD45.2 ⁺⁾ em 1: 1 razão equivalente HSC como calculado no passo 3.6 e ajustar o volume final para 200 mL por injecção utilizando PBS estéril.
   Nota: Para um grupo de cinco ratinhos receptores do volume sugerido seria, assim, pelo menos, 1,4 ml, contendo 3,5 x 10 ⁶ concorrente células de medula óssea (ou973 HSCs estimados a amostra A na Figura 2), e o número equivalente de células de teste (na Figura 2, o equivalente para a Amostra B seria 197826 x 7 = 1,384,782 células de medula óssea).

4. Transplante de Medula Óssea

1. Aquecer os ratinhos receptores irradiados na etapa 1.2, com uma lâmpada de calor vermelho para assegurar a dilatação dos vasos sanguíneos e para fazer a lateral da cauda veias mais visível.
2. Prepara-se uma seringa de 1 ml de tuberculina equipadas com uma agulha G 27 (ou menor). Aspirar cerca de 750 ul da suspensão de células preparada (para ratinhos receptores 3). Certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa.
3. Insira o mouse em um dispositivo de retenção. Examinar a cauda e olhar para as veias da cauda laterais que devem ser claramente visíveis em ambos os lados da cauda. Limpe o local da injecção com etanol. Inserir a agulha bisel para cima, paralelo à pele e pressione suavemente o êmbolo. A injecção deve ser fácil. Se a força é recessário, a agulha não está na veia.
   Nota: os ratos mais velhos têm pele mais espessa, o que pode fazer encontrar a veia mais difícil. Se a agulha não está na veia, reinserir a agulha proximal do local da injecção inicial.
4. Remover a agulha e pressione o local de injecção com gaze esterilizada durante alguns segundos para parar a hemorragia. Transferir o mouse em uma gaiola limpa.
   Nota: Use a mesma seringa e agulha por três injeções, após o que a agulha pode se tornar muito maçante.
5. Para pós-transplante follow-up, injectar 1 ml estéril PBS subcutaneamente para reidratar os ratos durante os primeiros cinco dias. Adicione antibióticos em água potável para prevenir infecções (se necessário; opcional). Pesar ratos a cada dois a três dias para as três primeiras semanas e eutanásia ratos que perderam mais de 15-20% do peso corporal pré-transplante (ou conforme determinado pela comissão de ética animal local).

5. Análise de sangue periférico

1. Coletar uma gota de sangue (approx. 50-100 ul) em tubos de EDTA.
   1. Para colheita de sangue a partir da veia da mandíbula, usar uma lanceta ou uma agulha de 22 G para perfurar a pele facial perto do local sem pêlos localizado sob o osso maxilar e colocar o tubo de recolha para receber a gota de sangue ^13. Recolha de sangue em 4, 8, 12 e 16 semanas após o transplante para seguir multi-linhagem reconstituição.
2. Adicionar 1 mL preparado de fresco RT tampão de lise de glóbulos vermelhos (9 partes de 0,16 M NH ₄ Cl + 1 parte de Tris-HCl a pH 0,17 7,65) para a gota de sangue recolhidas no passo 5.1.1. Misture e amostra de transferência para a 5 ml tubo de poliestireno de fundo redondo adequado para citometria de fluxo. Deixar repousar durante 4 minutos à temperatura ambiente.
3. Adicionar 4 volumes de PBS gelado. Misture girando end-to-end e transferir imediatamente em gelo. Centrifugar 10 min a 200 xg, a 4 ° C.
4. Decantar o sobrenadante e pellet ressuspender por um movimento súbito. Sobrenadante deve ser claro e vermelho. Adicione 2 ml de coloração de buffer e vortex brevemente. Centrifugar 5 min a 200 xgat 4 ° C.
5. Decantar o sobrenadante e pellet ressuspender por um movimento súbito.
6. Proceda com citometria de fluxo coloração utilizando o protocolo geral descrito nos passos 3.1 a 3.3 e os seguintes anticorpos para a mistura principal: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1.
7. Adquirir as amostras de células, utilizando um citómetro de fluxo com, pelo menos, seis detectores ^9. Determinar a frequência de células derivadas do dador para cada linhagem (linfócitos B CD19 ^+, de linfócitos CD3e ⁺ T, granulócitos GR1 ^brilhantes) em cada amostra, utilizando o modelo de análise apresentada na Figura 3 e como publicado ^10,11.

6. Análise de Medula Óssea A reconstituição

1. Recolha células da medula óssea, conforme detalhado na seção 2. Stain as células para análise de citometria de fluxo utilizando o protocolo geral descrito nos passos 3.1 a 3.3 e os seguintes anticorpos para a mistura principal: cocktail Lineage, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. detectar linanticorpos cocktail EAGE utilizando estreptavidina conjugada com fluorocromo como descrito na etapa 3.4.
2. Adquirir amostras de células utilizando um citómetro de fluxo com, pelo menos, oito detectores ^9. Se apenas seis estão disponíveis, adicionar CD135 para o mesmo canal como o painel de linhagem de células CD135 ⁺ serão excluídos. Determinar a frequência de Lin derivadas do dador ^- Sca1 ⁺ CD117 ⁺ CD135 ^- CD150 ⁺ HSC em cada amostra, utilizando o modelo de análise apresentada na Figura 4 e como publicado a ^10.

Uma descrição geral da definição de transplante competitivo, incluindo transplantes secundárias (discutido mais adiante) pode ser encontrada na Figura 1. A análise representativa de medula pré-transplante ósseo HSCs pode ser encontrada na Figura 2. Informações mais detalhadas sobre a exclusão de dobletes e células mortas pode ser encontrada em outros lugares ^9.

As Figuras 3 e 4 fornecem exemplos de modelos de citometria de fluxo de análise de sangue periférico e de medula óssea, respectivamente. É normal para detectar alguns linfócitos T do hospedeiro (até 20% de todas as células T; Figura 3B), como as células T são mais rádio-resistentes. células derivadas de competidor deve estar presente em todas as três linhagens. O limite de detecção depende muito do número de células total adquirido para análise, mas em nossa experiência um total de 20 mil células dentro doportão de leucócitos única é geralmente suficiente. Utilizando um limite arbitrário de 1% ou 0,5%, se as células doadoras representam uma proporção mais baixa do que o ponto de corte em qualquer linhagem (B linfóide, t linfóide ou mielóide, como mostrado na Figura 3), o rato não é considerado positivo para a reconstituição de multilinhagens . Este conceito torna-se importante quando os transplantes competitivos são combinados com um ensaio de diluição limitante para quantificar HSCs dadores, tal como explicado na discussão. É certamente possível ter, por exemplo, linfócitos T e B derivadas do doador, mas a perda gradual de células mielóides, que normalmente gostaria de sugerir a reconstituição única passageira. Linfócitos têm mais longas semi-vidas do que as células mielóides (particularmente Gr1hi SSChi granulócitos / neutrófilos) e pode persistir mesmo na ausência de medula óssea HSCs ^10.

A Figura 5 mostra resultados representativos para quimerismo sangue periférico sob situ diferenteções. Quando HSCs doadores são funcionalmente equivalentes a células concorrente, as proporções de doador (CD45.2 ⁺⁾ e competidor (CD45.1 ⁺⁾ células -derived são equivalentes (Figura 5A). As células hospedeiras residuais (CD45.1 ⁺ CD45.2 ⁺⁾ na Figura 5A e 5B são quase exclusivamente linfócitos T como eles são mais rádio-resistentes. Quando as células doadoras apresentar uma proporção muito menor de leucócitos do sangue periférico (Figura 5B), alguns aspectos da função HSC é provável defeituoso e mais estudos são necessários, como descrito na discussão. A presença de células concorrente confirma que o ensaio trabalhou bem, mas de medula óssea do dador foi simplesmente menos eficaz. Isto está em contraste com o resultado apresentado na Figura 5C, em que ambas as células do doador e concorrente estão presentes em números de células hospedeiras e baixo representam a maioria das células do sangue periférico. Neste caso, o transplante e não foi bem sucedida it não é possível tirar conclusões quanto à funcionalidade relativa do doador contra células concorrente. Diferentes soluções são discutidas mais adiante.

. Figura 1. Desenho experimental (A) Para um transplante competitiva, células da medula óssea de camundongos doadores ⁽⁺ CD45.2; C57BL6 fundo; controle e teste) ratos e concorrente congênica (CD45.1 ^+; B6.SJL) são misturados uma proporção de 1: 1 e injectadas na veia da cauda de ratinhos receptores irradiados (CD45.1 ⁺ CD45.2 ^+; F1 progenitura de C57BL6 x pares reprodutores B6.SJL). A eficácia de reconstituição de medula óssea é determinado no sangue periférico (PB) em 4, 8, 12 e 16 semanas pós-transplante e na medula óssea em 16 semanas após o transplante, ou mais tarde. (B) Para melhor avaliar a auto-renovação das células transplantadas, bonAs células de medula e recuperados a partir de receptores de transplantes após 16 semanas pode ser transferido para murganhos receptores secundários irradiados. HSC, células-tronco hematopoiéticas; MPP, células progenitoras multipotentes; LMPP, MPP ferrado-linfóide. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Pré-transplante de medula óssea HSC modelo de análise. Dentro de células individuais, selecione hspCs de acordo com c-kit (CD117) e expressão Lineage. Dentro do ^{/ dim} Lin ^- população de células, selecione o c-kit Sca1 ^{brilhante +} população (LSK). Dentro LSKs, selecione CD150 ⁺ CD135 ^- HSCs. Esta população contém tanto a longo prazo e de curto prazo repovoamento HSCs (a frequência de uma célula de repovoamento dentro desta população é serTween 1/3 e 1/5). A freqüência estimada de medula óssea HSCs é calculado dividindo o número de eventos no portão HSC pelo número de eventos no portão de uma única célula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. pós-transplante modelo de análise de sangue periférico. (A) Dentro de uma única célula, selecione primeiros granulócitos ^hi SSC GR1 ^brilhantes. (B) Em seguida, selecione CD19 ⁺ CD3e ^- linfócitos B e CD3e ⁺ CD19 ^- linfócitos T. sangue periférico do rato contém uma grande proporção de linfócitos, os linfócitos B com sendo o principal tipo de células (aproximadamente 50% de todas as células do sangue periférico). CE) Desenhe fluxo 2D citometria de parcelas para cada subconjunto com CD45.2 em um eixo e por outro CD45.1. Identificar doador (CD45.2 ^+), host (CD45.1 ⁺ CD45.2 ⁺⁾ e células concorrente (CD45.1 ⁺⁾ para cada linhagem, como mostrado. É normal ter algumas células hospedeiras restantes, particularmente na população de linfócitos T como visto no painel E. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. pós-transplante modelo de análise HSC medula óssea. Dentro das células individuais, selecione hspCs e LSKs como mostrado em Figura 2. Dentro LSKs, selecione CD150 + CD135- HSCs, CD150- CD135- progenitores multipotentes (ou MPPs) e CD150- CD135 + linfóide MPPs -primed (ou LMPPs). A proporção de LMPPs é inferior após o transplante do que em ratinhos não-irradiadas. Desenhar 2D fluxo cytometry parcelas para cada subconjunto com CD45.2 sobre um eixo e por outro CD45.1. Identificar as células concorrente doador, acolhimento e para cada subpopulação, conforme mostrado. Se a irradiação e transplante for bem sucedido, deve haver muito poucos hspCs host restantes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Os resultados representativos para quimerismo no sangue periférico. (A) onde transplante bem sucedido doador HSCs são funcionalmente equivalentes às células concorrente. A grande maioria das restantes células hospedeiras (CD45.1 ⁺ CD45.2 ⁺⁾ é geralmente linfócitos T. (B) transplante bem-sucedido onde doador HSCs mostram diminuição da função, em comparação com células concorrente. Esta contribuição diminuição pode ser devida avários fatores diferentes e uma análise mais aprofundada será necessária (ver discussão). (C) transplante sem êxito com baixas frequências de ambas as células doadoras concorrente e e uma grande proporção de células hospedeiras restantes. Este tipo de resultado sugere uma menor do que a dose esperada de irradiação, injeção vencida (diminuição da viabilidade celular, diminuição do volume de injeção, injeção fora da veia da cauda), ou uma combinação destes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

O protocolo aqui descrito destina-se a avaliar a aptidão relativa de dadores (teste) HSCs contra competidor conhecido HSCs. A situação de concorrência aumenta a sensibilidade relativa do ensaio (maior probabilidade de detectar reduções moderadas na aptidão de células-tronco) e fornece um controle técnico interno para a eficácia da irradiação e injeção. No entanto, ele não deve ser utilizado como uma medida absoluta de HSC aptidão; uma diminuição na reconstituição competitivo não significa automaticamente que o HSCs não teria um bom desempenho na ausência de concorrência. Embora se possa argumentar que uma configuração competitiva é o melhor ponto de partida, como as células concorrente vai resgatar a função HSC defeituoso e todos os ratos destinatário vai sobreviver, deve-se ter cuidado com a interpretação dos resultados. Confirmando os resultados em um ambiente não-competitivo vai solidificar as conclusões.

O delineamento experimental aqui apresentada utiliza HSC equivalente quantities do total de células de medula óssea, em vez de populações puras de citometria de fluxo HSCs -sorted. É importante para equalizar o número de HSCs em todas as populações em estudo (diferentes doadores, concorrente) para eliminar a variabilidade entre os diferentes doadores e garantir que as variações na frequência HSC fenotípica não será interpretado como alterações na função HSC ^14. As vantagens da abordagem descrita aqui mais de HSCs purificadas são: melhorar a viabilidade celular, devido aos tempos de processamento mais curtos e falta de pressão externa durante a classificação; e melhorada homing para a medula óssea receptora (a presença de anticorpos em células separadas podem interferir com o seu enxerto na medula óssea, ^15). Por outro lado, a principal desvantagem é a contribuição de populações não-HSC para o resultado do transplante, em particular o papel de células progenitoras de vida curta nos pontos de tempo iniciais após o transplante. Além disso, se o tratamento ou a modificação genética altera a expressão de surface marcadores utilizados para a selecção de HSCs ^16, pode haver um número significativo de HSCs "disfarçados" numa amostra mas não na outra, o que irá influenciar os resultados. No entanto, o mesmo problema pode também ocorrer quando se utiliza HSCs purificadas e é inerente ao ensaio de transplante.

Os resultados obtidos com o presente protocolo são apenas qualitativa a nível da população. Em outras palavras, uma contribuição menor de células dadoras após transplante poderia ser devido a; um menor número de HSCs funcional da população de partida; uma capacidade diminuída das HSCs individuais para estabelecer-se na medula óssea e expandir nos primeiros dias e semanas após o transplante; ou problemas com o crescimento e a diferenciação em células maduras que são usados ​​para a detecção na periferia. Assim, é importante para não usar os resultados de um transplante competitiva isoladamente, mas para complementá-los com os ensaios que medem a proliferação celular, sobrevivência e diferenciação de HSC para circulando células sanguíneas. É também importante comparar contribuição célula do dador entre o sangue periférico (Figura 3) e medula óssea (Figura 4) Presença de HSC derivadas do doador na medula óssea combinada com a ausência de células do dador no sangue periférico seria indicativo de um bloco de diferenciação . Embora não esteja representado no exemplo, é também possível avaliar eritróide reconstituição com base em diferentes isoformas de Gpi1 ^17. Dado o grande número de eritrócitos presentes no sangue, elas representam um método altamente sensível para a detecção de células derivadas do dador, o que pode ser particularmente útil quando o transplante de baixo número de HSC ou após a sua produção, durante longos períodos de tempo. Na outra extremidade do espectro, as células mielóides são normalmente os primeiros a falha foi detectada, em parte por causa da sua baixa frequência no sangue periférico e em parte devido à sua curta semi-vida.

É possível adaptar the ensaio de repovoamento competitivo para permitir a quantificação de HSC utilizando o ensaio de diluição limitante (LDA ou). Isto exigirá um número muito maior de murganhos receptores divididos em vários grupos diferentes, onde cada grupo recebe uma proporção diferente de competidor: células do dador, quer ordenados ou não ordenados como descrito acima. À medida que o número de células do dador diminuir, haverá mais ratinhos nos quais a proporção de células derivadas do dador não atinge o limiar pré-estabelecido, em uma ou várias linhagens. Em seguida, é possível traçar a frequência dos ratos "negativo" por grupo contra o número de células do doador transplantadas e determinar a frequência de HSCs a partir do gráfico que se seguiu ^18,19.

A duração sugerido de pós-transplante seguimento varia na literatura. Usou-se ter a certeza de consenso, onde o período de 16 semanas após o transplante, foi considerada suficiente para reflectir a produção de longo prazo HSCs. No entanto, relatos recentes de "intermediate "HSCs cuja função declina logo após 16 semanas sublinharam a necessidade de uma avaliação mais rigorosa do HSC função ^17. É certamente possível estender o acompanhamento dos pacientes transplantados para além do ponto de tempo 16 semanas para satisfazer estas preocupações. Uma opção alternativa, mais uma vez com uma sensibilidade ainda mais elevadas, é o transplante secundária (Figura 1B), em que as células da medula óssea recuperado a partir de primeiros receptores de transplante são injectados em receptores secundários irradiados. o segundo transplante exerce pressão proliferativo adicional na HSCs, forçando a sua saída de dormência e permitindo que apenas as células com robusta auto-renovação para manter a sua produção. é por vezes preferível usar células dadoras classificados para ajustar melhor números HSC entre amostras diferentes para os transplantes secundários. em alternativa, é possível estabelecer uma proporção estimada de dador : HSCs concorrente da medula óssea primária (por exemplo, Figura 4) e, em seguida, comparar a saída da célula doadora em transplantes secundários para essa relação. Também é essencial para aumentar o número de células da medula óssea total transplantados, como a frequência de HSCs funcionais na medula óssea após o transplante nunca atinge os números observados em ratos não-irradiadas. É melhor para a piscina de medula óssea de mais de um destinatário principal e injetar um total de 5-10 milhões de células por destinatário secundária ^10.

Como mencionado acima, há uma série de razões pelas quais uma determinada população de dador HSCs podem mostrar diminuição da capacidade para a reconstituição a longo prazo. Uma tal razão é a capacidade de HSCs para migrar para a medula óssea após o transplante (também chamado homing) e instalar-se no nicho de medula óssea. É possível adaptar o protocolo aqui apresentado para investigar homing medula óssea e expansão de curto prazo. É necessário aumentar o número de células transplantadas (o equivalente de 5.000-10.000 HSCs parahoming ensaios e 1000-2000 HSCs para análise na primeira semana após o transplante). No ensaio de direcção, ratinhos receptores são sacrificados no interior da primeira 16-24 horas após o transplante e a quantidade de doador de HSCs que tenham atingido a medula óssea é determinado tal como descrito no presente protocolo. Para avaliar ainda mais a sua função, as células de medula óssea recuperados a partir dos receptores de curto prazo podem ser transplantados para receptores secundários como explicado na Figura 1B. A proporção de células derivadas de dador no recipiente secundário pode então ser utilizado para avaliar a capacidade de dador HSCs para migrar e estabelecer-se na medula óssea receptora.

Os principais problemas com os transplantes de medula óssea competitivas decorrem de irradiação e de injecção e apresentam-se como quer o aumento da mortalidade pós-transplante ou diminuição da eficiência reconstituição. irradiação de dose repartida, como apresentado aqui, é geralmente associada com mieloablação mais eficiente emenos toxicidade quando em comparação com uma dose única ^{de 20.} Com a dose recomendada aqui (duas vezes 450 rads), as populações linfóides e mielóides B são eficientemente suprimidos os linfócitos T, mas fazer residuais permanecem (Figura 3). Se houver qualquer motivo para suspeitar de rejeição do enxerto (camundongos doadores e receptores de diferentes origens genéticas), uma maior dose de irradiação (duas doses de 550-600 rads) e um atraso mais curto entre as duas doses (4 horas em vez do dia seguinte ) deve ajudar a eliminar linfócitos T residuais e diminuir a possibilidade de falha do enxerto devido à rejeição. injeção incorreta ou injecção no espaço perivascular em vez da veia da cauda, ​​os problemas com a viabilidade das células do doador, ou contaminação célula doadora devido à falta de cuidados durante a preparação da amostra também irá aumentar falência do enxerto e mortalidade pós-transplante. irradiação ineficaz (devido a problemas técnicos, por exemplo) resultará em diminuição da eficiência de reconstituição, mas não deve aumentar mortality. Em todas estas situações, a presença de células competidor no ensaio de ajuda para dissociar problemas técnicos (como pormenorizado aqui) a partir de um decréscimo no dador bona fide função HSC como as células concorrente deve sempre ser capaz de reconstituir o destinatário irradiado. Hospedeiros imunodeficientes também pode ser usado, por exemplo, para diminuir a necessidade de irradiação e / ou risco de rejeição do enxerto, e para avaliar a função de hsc humanas ^21-23.

Em conclusão, nós apresentamos aqui um protocolo de transplante competitiva que pode ser adaptado para vários usos diferentes conforme detalhado na discussão. A nossa abordagem utiliza os equivalentes HSC, o que diminui o tempo de processamento e melhora simultaneamente a viabilidade celular no enxerto quando comparado a separação de células. Também é uma solução prática quando o acesso a um classificador de células é limitado, e requer menos ratos, quando comparado com o ensaio quantitativo LDA, tornando-se um ponto de partida atractivo para a análise da função HSC.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Somos gratos a Roxann Hétu-Arbour para a assistência com o design figura e demonstração dos procedimentos. Pesquisa no laboratório foi apoiado por uma concessão de Transição da Fundação Cole, Descoberta conceder nenhuma. 419226-2012 das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC) e da Fundação Canadense para a Inovação (CFI Líderes Fundo conceder no. 31377). KMH é um Chercheur-Boursier Júnior para o Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).