TAPE: Uma biodegradável Hemostática Glue Inspirado por um Composto Ubiquitous em plantas para aplicação cirúrgica

Nós descrevemos o protocolo simples de preparar cola médica biodegradável que tem uma capacidade hemostática eficaz. A fita é um agregado supramolecular imiscível em água, preparado através da mistura de ácido tânico, um composto ubíquo encontrado em plantas, e poli (etileno) glicol, dando origem a 2,5 vezes maior aderência resistente à água em comparação com a cola de fibrina comerciais.

Este vídeo descreve o protocolo simples para a preparação de cola cirúrgica biodegradável que tem uma capacidade hemostático eficaz e uma maior força de aderência resistente à água do que os adesivos de tecidos comerciais. adesivos médicos têm atraído grande atenção como potenciais ferramentas alternativas para suturas e grampos devido à sua conveniência em uso com capacidade de invasão mínima. Embora existam vários protocolos para o desenvolvimento de adesivos de tecido incluindo aqueles comercialmente disponíveis, tais como colas de fibrina e materiais à base de cianoacrilato, em geral eles requerem uma série de sínteses químicas de moléculas orgânicas, ou métodos de proteína de purificação complicadas, em caso de materiais impulsionado-bio (ie, cola de fibrina). Além disso, o desenvolvimento de colas cirúrgicas apresentem altos propriedades adesivas, mantendo biodegradabilidade ainda é um desafio devido a dificuldades na obtenção de um bom desempenho no ambiente molhado do corpo. Nós ilustramos um novo método para preparar umcola médica, conhecida como fita, por a separação à base de peso de um agregado supramolecular imiscível em água formada depois de uma mistura física de uma molécula adesiva resistente a húmido derivado de plantas, t Annic Um cid (TA), e um bem conhecido biopolímero, poli (etileno) glicol (PEG). Com a abordagem, fita mostra a força de aderência elevada, o que é 2,5 vezes mais do que a cola de fibrina comerciais, na presença de água. Além disso, a fita é biodegradável em condições fisiológicas e pode ser utilizado como uma cola hemostático potente contra sangramento tecido. Esperamos que o uso generalizado de fita em uma variedade de ambientes médicos e aplicações de entrega de medicamentos, tais como polímeros de muco-adesão, depósitos de drogas, entre outros.

Em uma década passado, foram feitos esforços para substituir as suturas e grampos cirúrgicos atuais para fechar feridas com adesivos biodegradáveis ​​/ bioabsorvíveis devido à sua conveniência no uso e baixa capacidade de invasão de tecidos durante os tratamentos cirúrgicos. Comercialmente disponíveis Tissue-adesivos são classificadas em quatro tipos: (1) derivados de cianoacrilato ^1, (2) colas de fibrina formados por conversão enzimática de fibrinogénio em fibrina pela trombina polímeros ^2,3, (3) materiais à base de proteínas, tais como quimicamente ou fisicamente albumina de ligação cruzada e / ou gelatina ^4,5, e aqueles (4) à base de polímero sintético ^6. Apesar de terem sido utilizados em muitas aplicações clínicas, todos os adesivos têm as suas próprias desvantagens intrínsecas e os inconvenientes que podem ser obstáculos à sua utilização generalizada. colas à base de cianoacrilato mostram elevada força de adesão para os tecidos, mas a sua sub-produtos tóxicos tais como o cianoacetato e o formaldeído formado durante a degradação, muitas vezes causar sinalgraus ificant de respostas inflamatórias ^7. As colas de fibrina e albumina ou materiais à base de gelatina têm problemas de segurança no que respeita à transmissão de componentes infecciosos, tais como vírus de origem animal: plasma de sangue humano para colas de fibrina e animais, incluindo bovinos, frangos, porcos e peixes para colas à base de gelatina ^8. Embora alguns adesivos à base de polímeros sintéticos foram aprovadas pela Federal Drug Administration (FDA), a maioria dos adesivos feitos de polímeros sintéticos continuam a ter dificuldade em minimizar as etapas do processo de fabrico e obtenção de biocompatibilidade ^9. Mais importante, todas as colas sofrem de fraca resistência mecânica e adesão a tecidos molhados ^10. Recentemente, adesivos de tecido biomiméticos inspirados por mexilhões marinhos ^11-13, lagartixas ^14, gecko com mexilhão ¹⁵ e worms endoparasitas ¹⁶ foram surgindo como alternativas promissoras para colas médicas atuais, devido à sua sintonizável mecânica epropriedades adesivas com biocompatibilidade. No entanto, até hoje, ainda existem questões a serem abordadas antes de se tornarem produtos comerciais ^17.

Aqui, descrevemos um tipo inteiramente novo de cola médica chamada fita que é preparado pela ligação de hidrogénio intermolecular entre uma molécula de adesivo derivado de planta, o ácido tânico (TA), e um polímero bio-inerte de poli (etileno glicol) (PEG), como o próprio nome indica. TA é um tanino hidrolisável representante ubiquitously encontrados durante o metabolismo secundário de plantas. Ele tem atraído muita atenção devido às suas propriedades anti-oxidantes, anti-mutagénicas, e propriedades anti-cancerígenas e tem sido demonstrado que participam em interacções supramoleculares com muitos polímeros, tais como poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) e poli (N - vinilpirrolidona) (PVPON), para formar a camada por camada (LbL) filmes ^18-20 e drogas de libertação de microcápsulas ^21-23. No presente estudo, nós descobrimos que o TA pode actuar como uma eficientefragmento funcional adesiva resistente à água para formar um adesivo médico, TAPE. Por simples mistura com TA, uma incrustação não-PEG polímero torna-se uma cola supramolecular com 2,5 vezes maior força de adesão em comparação com a cola de fibrina comerciais, e esta adesão foi mantido durante até 20 ciclos de fixação e distanciamento, mesmo na presença de água . A sua capacidade hemostática foi testado num modelo de hemorragia fígado in vivo e mostrou boa capacidade hemostático para parar o sangramento dentro de poucos segundos. TAPE tem o seu significado importante em um campo relacionado como o primeiro adesivo derivado de plantas que podem revelar uma nova visão sobre a resolução dos inconvenientes de problemas atuais com abordagens bio-inspirados. Esperamos também que o uso generalizado de fita em uma variedade de aplicações médicas e farmacêuticas, tais como muco-adesivos, adesivos de liberação de drogas, molhos de cuidados de feridas, e outras devido ao seu método de preparação simples, escalabilidade, a taxa de biodegradação sintonizável, bem como ADHES resistentes wet-altamentepropriedades de íons.

Todos os cuidados com os animais e as experiências sejam realizadas em conformidade com o protocolo ético fornecido pelo KAIST (Korea Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia) IRB (Institutional Review Board).

Formação 1. TAPE

1. Para a preparação de uma solução de AT, colocar um tubo de ensaio de vidro de 4 ml de tamanho sobre um agitador magnético, e adicionar 1 ml de água destilada com uma barra de agitação. Adicionar 1 g de ácido tânico para o frasco, e dissolvê-lo em água por agitação suave a 200 rpm, durante mais de 1 h. Quando a TA está completamente dissolvido, a mistura torna-se transparente com uma cor castanha.
2. Prepara-se uma solução de PEG pela adição de 1 g de PEG em pó (4-braços, de 10 kDa, e linear, 4.6 kDa) a 1 ml de água destilada seguida por misturando-as em vortex durante alguns segundos para formar uma suspensão branca. Manter esta pasta na incubadora a 60 ° C durante 10 min. até que o branco se torna completamente claro.
   NOTA: O ponto de fusão do PEG com 10 kDa de peso molecular é de cerca de 55- 60 ° C, e a 4 kDa um é de 53 - 58 ° C. Derretido PEG se torna miscivel com a água de modo a que uma elevada concentração de PEG em água até 1 g / ml pode ser conseguido como uma solução límpida. Uma vez que uma solução clara PEG é formada a uma temperatura elevada, a solução ainda é estável à temperatura ambiente após o arrefecimento.
3. Adicionar 329 ul do PEG (4-braços, 10 kDa) solução preparada no passo 1.2 a 671 ul da solução de TA, preparado no passo 1.1 (No caso de um PEG linear com 4,6 kDa, adicionar 311 ul de uma solução PEG a 689 ul de uma solução de TA) num tubo de micro-centrifugação. Delicadamente misturar as duas soluções viscosas e mel-like com uma espátula estreita para misturá-los de forma homogénea.
   CUIDADO: Ambas as soluções são bastante viscoso, de modo que o cientista deve lentamente mas suficientemente puxar para cima e transferir as soluções com uma micropipeta.
4. Girar a mistura preparada no passo 1.3 a 12.300 xg durante 3 minutos numa centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo.
5. cuidadosamente remove tanto do sobrenadante quanto possível, utilizando uma micropipeta, e recolher o produto que já se estabeleceram: Este é o TAPE totalmente formado. Após a formação TAPE, armazená-lo no frigorífico (4-8 ° C) por até várias semanas. NOTA: TAPE podem ser esterilizados por radiação gama ou elétrons tratamento feixe antes do uso em aplicações cirúrgicas.

2. Medição da força de aderência da fita adesiva

1. Preparar dois pedaços de tecido da pele porcina com um diâmetro de 6 mm por corte com um perfurador de biópsia após a remoção de toda a gordura no tecido da pele.
   NOTA: O tecido da pele porcina foi obtida a partir de uma pele saudável flanco porcine e foi comprado de um mercado local de carne localizado em Daejeon na Coreia do Sul.
2. Aplicar cola de cianoacrilato comercial para o lado exterior de cada tecido, e anexar o tecido para a haste metálica.
   NOTA: A haste metálica é utilizado como um identificador de modo complementar um tecidosnão está directamente agarrada pela máquina. Por conseguinte, ele pode ser substituído por outros materiais de acordo com a configuração da máquina de tracção.
3. Aplicar uma gota de fita (A gota de fita é aproximadamente 3-6 mg) de um lado do tecido. Em seguida, o espalhar uniformemente FITA utilizando outro tecido entre os dois tecidos sobre os seus lados interiores, de modo que estão ligados como mostrado na Figura 2A.
4. Em seguida, anexar manualmente e separe os dois lados dos tecidos várias vezes para misturar de forma homogénea e maximizar a interface entre cada tecido e TAPE.
5. Com o UTM, cuidadosamente aperto de cada lado da haste. A força de adesão será determinada pela força necessária para separar dois tecidos ligados com fita. Em primeiro lugar, aplica uma força de 20 N durante 1 min. Em seguida, com a máquina, cada haste de puxar numa direcção oposta a uma velocidade de 1 mm / min. até que os tecidos são completamente separada.
   NOTA: Os dados vai ser dada como uma força de distância (FD) curva detectado pelo movimentode cada haste.
6. Calcula-se a resistência de adesão de fita adesiva dividindo a força máxima (kN) mostrado na curva FD conseguida no passo 2.5 pela área da superfície da amostra, isto é, de 3,14 x 0,003 (m) ^2.
7. Para monitorar a força de adesão na presença de água, adicionar 20 l de água sobre a área destacada entre dois tecidos, e anexá-los imediatamente. Com a máquina, realizar o teste de descolamento novamente.

3. Teste in vitro Degradação

1. Corte uma tampa (d = 8 mm) de tubo de micro-centrífuga, e pesar a tampa para defini-lo como W _c.
2. Encha a tampa com 150 mg de TAPE, e pesar todos juntos novamente para defini-lo como um peso total inicial W _0.
   CUIDADO: Não sobrecarregue TAPE na tampa. A altura da fita deve ser menor do que a parte superior da tampa, uma vez que pode ser uma barreira física a um fluxo de tampão PBS gerado pelo processo de agitação durante a incubação no passo 3.4.
3. A colocar o tampão contendo fita em um frasco de cultura celular (75 cm ^2), e adicionar 50 ml de tampão PBS (1x, pH 7,4) para o frasco de cultura de células de modo a fita na tampa está completamente imerso no tampão PBS, como mostrado na Figura 3A (n = 5).
4. Incubar o balão de cultura de células, preparado no passo 3.3, em um incubador com agitação orbital a 37 ° C, semelhante às condições fisiológicas, com agitação suave (50 rpm).
   CUIDADO: Mantenha a condição de agitação a 50 rpm. rpm mais alto pode causar um colapso da FITA.
5. Em cada momento, tomar a tampa com fita do frasco de cultura de células e, em seguida, seque-as, soprando gás nitrogênio. Pesar o tampão contendo fita restante. Definir o peso em cada ponto de tempo para W _t. Substituir o PBS fresco de novo, e agitá-lo novamente depois de medir W _t em cada ponto de tempo.
6. Calcule o peso restante relativa (%) a seguinte equação.
   Peso relativo remanescente (%) = (W _t - W _C) / (W ₀ - W _C) x 100%

4. Hemostática Capacidade de TAPE

NOTA: Todas as experiências com animais deve ser realizada de acordo com as orientações e protocolo de ética fornecidos pelo Ministério da Saúde e Bem-Estar coreano.

1. Para avaliar a capacidade hemostática in vivo, rever o modelo de fígado de rato hemorragia, tal como descrito na ref ^24.
2. Anestesiar quinze murganhos (ICR ratinho normal, 6 semanas, 30 - 35 g, macho) com uma injecção intraperitoneal de tiletamina-zolazepam (33,333 mg / kg) e xilazina (7,773 mg / kg) (n = 5 por grupo). Para confirmar anesthetization adequada, aperte pata do animal com cuidado e observar os movimentos tais como a retirada da pata, etc. Nenhum movimento indica que o animal é suficientemente anestesiado para fazer a cirurgia.
3. Para prevenir o ressecamento dos olhos de animais, aplicar vet pomada para os olhos suficientemente enquanto sob umanestesia. Expor o fígado através de uma incisão abdominal linha média, e picar o fígado com uma agulha de 18 G para induzir o sangramento.
4. Remover o sangue flui com uma gaze estéril e colocar 100 ul de fita adesiva ou cola de fibrina (controlo positivo) imediatamente sobre o local da hemorragia.
   NOTA: Não existe mais nenhuma sutura é necessária após a aplicação TAPE devido às suas propriedades adesivas altamente resistentes sangue nos tecidos da ferida. Para o controlo negativo, nenhum tratamento ocorre no local da hemorragia.
5. Em cada caso, colocar um filtro de papel com massa conhecida sob o fígado para recolher o sangue a partir do local danificado. Substitua o papel por uma nova a cada 30 seg para 4 vezes (ie., 2 min).
6. Medir a massa de sangue absorvido em cada papel de filtro recolhidos a cada 30 seg. Após o experimento animal, sacrificar os ratos através de CO ₂ a eutanásia asfixia.

A fita é um agregado supramolecular que estabelece-se após a centrifugação da mistura das duas soluções aquosas que contêm ácido tartárico (1 g / ml em água destilada) e PEG (1 g / ml em água destilada) com 2: 1 razão em volume (Figura 1A). A proporção de mistura é o fator chave para atingir alta força de adesão; Quando a fita é formado por uma proporção de 2: 1 de mistura, 20 unidades de o grupo hidroxilo (-OH) em 25 unidades de AT interagem com cada grupo de éter (-O-) em PEG, o que resulta na mais elevada formação de ligações de hidrogénio intermoleculares com o máximo propriedades de adesão. As restantes cinco unidades de -OH parecem ser consumida pela ligação de hidrogénio intramolecular com grupos carbonilo adjacentes (C = O) em AT (Figura 1B). Quando qualquer um dos componentes era superior a 2: 1 razão em volume, a força de adesão foi notavelmente diminuída ^25. Ligação de hidrogénio também será a interacção crítica nível molecular com os tecidos. controladoro inter- e de ligação de hidrogénio intra-molecular entre TA e PEG para a coesão, e entre a TA e os tecidos para a adesão pode ser um mecanismo plausível da fita como uma cola cirúrgica eficaz.

Para a medição da força de adesão, fita foi aplicada pela primeira vez entre cada lado epidérmico de duas peles porcinas com um diâmetro de 6 mm. Subsequentemente, foi agarrada numa máquina de tracção ligados por meio de hastes de cada lado de fora da pele de porcino, tal como representado na Figura 2A. A força necessária para separar duas peles porcinas foi medido pela máquina, na ausência (Figura 2B) e na presença de água (Figura 2C) depois de cada 5 ciclos de ligação e separação repetida, até 20 ciclos. A força de adesão num estado seco foi de cerca de 200 kPa a medição inicial, e mesmo aumentada para cerca de 250 kPa depois de 20 ciclos. Na presença de água adicionada para cada ciclo, a adesão foi de cerca de 90 kPa, que, em seguidadiminuiu para 50 kPa depois de 20 ciclos. A força de adesão em um estado molhado foi menor do que no estado seco, mas ainda era comparável com o adesivo comercial, cola de fibrina, o qual foi cerca de 70 kPa, medidos por uma configuração idêntica à nossa na ausência de água ^25.

A degradabilidade da fita foi investigada por análise gravimétrica in vitro (Figura 3). A fita foi imersa em 1x PBS (pH 7,4) a 37 ° C com agitação suave, em seguida, a massa remanescente cada tempo foi medido até 21 dias. Fotografias da fita remanescente de cada vez, também são mostrados na Figura 3B. A fita feita por mistura TA e PEG com uma proporção de 1: 1 foi completamente degradado após 13 dias, e 42% de fita feita por dois componentes com uma relação de 2: 1 foi degradada após 21 dias (Figura 3C). A velocidade de degradação está em correlação inversa com a força de adesão, porque a degradação rápida é principalmente devido aoinferior interacção intermolecular, e esta condição cria menor força de adesão no caso de fita adesiva, tal como anteriormente mencionado. Assim, o resultado foi como esperado; FITA misturados por uma proporção de 2: 1 mostrou degradação mais lenta do que por uma proporção de 1: 1, porque todos -OH reactivo em TA e todos -O- em PEG formou o maior número de ligações de hidrogénio intermoleculares. A uma razão de 1: 1, a quantidade em excesso de -O- em PEG pode enfraquecer a coesão, o que resulta na degradação mais rápida.

Finalmente, a capacidade hemostática de fita foi investigada in vivo. A fita foi aplicada em primeiro lugar no fígado do ratinho imediatamente após a lesão a partir de uma agulha G 18, como mostrado na Figura 4A. A quantidade de sangramento durante mais 30 s após o tratamento inicial foi recolhido por adsorção de sangue em papel de filtro e comparando o negativo (sem tratamento) e controlo positivo (cola de fibrina) (Figuras 4B e 4C). A quantidade total de sangramento também foi calculciado por recolher a quantidade de sangramento a cada 30 seg. até que parou. Como mostrado na Figura 4D, o sangramento foi suprimida de forma significativa pela capacidade hemostática de fita adesiva (A quantidade total de sangramento foi apenas 15,4% dos casos não tratado) em vez de um produto comercial, cola de fibrina (A quantidade total de sangramento foi de 60,7% do processo sem tratamento ).

Figura 1: Formação de TAPE (A) etapas seriadas de fazer TAPE. (Barra de escala: 0,5 cm). (B) Uma reação química de formação de TAPE via ligação de hidrogênio intra e inter-molecular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Força. A adesão dos TAPE em pele de porco (A) Um esquema de configuração de medição. (B - C) alterações força de adesão durante attach- repetido e descolamento sobre a pele de porcino (B) na ausência e (C) na presença de água. As barras de erro representam a média ± desvio padrão (DP) de 3 medições repetidas (* p <0,05, ** P <0,01, *** p <0,001 e **** p <0,0001, com um teste ANOVA de sentido único). (Re-imprimir com a permissão de ref ^25). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Degradação Taxa de TAPE em condições fisiológicas (A) Uma foto da configuração de medição.. (B) phot RepresentanteOS de fita restante em cada teste de degradação. (C) As restantes alterações% em massa após um período de tempo de incubação num tampão 1x PBS (pH 7,4) a 37 ° C foi monitorizada até 21 dias (TA: PEG = 2: 1 e 1: 1) (n = 5 , barras de erro ± DP). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4:. Capacidade hemostáticos da FITA In Vivo (A) Um foto indicando a aplicação de fita adesiva na superfície de um fígado danificado por uma agulha de 18 G. (B) fotos representativas mostrando a quantidade de sangramento um 30 seg inicial. após o tratamento de fita adesiva, assim como o negativo (sem agente hemostático) e controlo positivo (cola de fibrina). Cada quantidade quantitativa de bleeDing foi mostrado em (C). (D) A quantidade total de sangramento, coletados a cada 30 segundos até que parou. As barras de erro representam a média ± desvio padrão (DP) de 5 medições repetidas (* p <0,05, ** P <0,01, *** p <0,001 e **** p <0,0001, com unidirecional ou bidirecional ANOVA de teste). (Re-imprimir com a permissão de ref ^25). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nós desenvolvemos uma classe inteiramente nova de fita adesiva chamada hemostática inspirado pela interação molecular resistente à água de um composto polifenólicos de origem vegetal, TA. TA é um tanino hidrolisável representante que tem atraído significativa atenção devido ao seu anti-oxidantes propriedades anti-bacterianas, anti-mutagénicos e anti-cancerígenas.

O processo de fazer TAPE é extremamente simples, escalável e ambientalmente amigável, pois é apenas a mistura de uma etapa de duas soluções aquosas, seguido por centrifugação, sem quaisquer procedimentos sintéticos químicos.

O protocolo de mistura de dois componentes é o método mais comum e mais simples para formar adesivos de tecido utilizadas em produtos convencionais, tais como cola de fibrina. Ele é formado por mistura de fibrinogénio e trombina a direita antes de aplicar aos tecidos ^3. No entanto, a síntese química multi-passo é necessário para preparar os componentes de um adesivo, no caso óf cola de cianoacrilato e adesivos à base de polímeros sintéticos. Além disso, os produtos químicos altamente tóxicos são por vezes envolvido como um componente para reticular quimicamente o outro componente constituído por precursores poliméricos em materiais à base de proteínas, curado pelo glutaraldeído e cola contendo formalina e resorcinol.

Materiais curados por glutaraldeído mostrou alta na resposta inflamatória vivo em tecidos do pulmão e do fígado em estudos com animais, utilizando coelhos, embora tenha sido aprovado pela FDA para tecidos da aorta. Materiais contendo cola de formalina e resorcinol também sofre de problemas de toxicidade resultantes de formalina a reagir com os tecidos circundantes ^26.

A etapa de centrifugação é o único inconveniente de TAPE desenvolvimento como um em -forming situ, adesivo injetável no corpo, mas vantagens fartura de TAPE prometer a sua, o uso disseminado aberto. Um passo crítico da formação de fita é que a mistura dos dois componentes podeser um pouco complicado por causa de sua alta viscosidade, mas no geral, qualquer pessoa pode fazer consistentemente enormes quantidades de fita em um laboratório, sem quaisquer variações de lote para lote.

A força de adesão da fita foi 2,5 vezes maior do que a de adesivo comercial largamente usado, cola de fibrina, e sangramento massa foi suprimida com sucesso por meio da ligação resistente ao sangue de fita adesiva no local da ferida no nosso modelo de sangramento do fígado de rato in vivo. A taxa de degradação e as propriedades mecânicas da fita pode ser ainda mais sintonizável usando ramificado / PEG multi-armado, bem como uma que tem grupos terminais funcionais, tais como grupos amina, carboxilato, e epóxido. A força máxima aderência em nossos dados foi otimizado pela proporção de um tipo de PEG (4 armas, 10 kDa e 2-braços, 6,4 kDa) para TA, mas também deve ser afetada por grupos terminais funcionais, número de armas e o peso molecular do PEG.

Esperamos que TAPE também pode ter uso generalizado como um depósito de droga e adhesive remendo para fins de cicatrização de feridas, e não apenas como um agente hemostático, devido à sua capacidade de encapsular os produtos químicos, através da afinidade bem conhecidos da TA a uma variedade de macromoléculas, incluindo a albumina do soro bovino ^{27, 28 de} ADN, poli (N -isopropylacrylamide) ( PNIPAM) ^29, e íons metálicos ^30.

The authors have nothing to disclose.

This study was supported by National Research Foundation of South Korea: Mid-career scientist grant (2014002855), and Ministry of Industry, Trade, and Natural Resources: World Premier Material Development Program. This work is also supported by in part by Center for Nature-inspired Technology (CNiT) in KAIST Institute for NanoCentury (KINC).