TAPE:一种生物可降解止血胶由无处不在的复方植物外科应用的启发

我们描述制备生物可降解医用胶，有一个有效的止血能力的最简单的协议。带通过单宁酸的混合制备的水不混溶的超分子聚集体，一个无处不化合物在植物中发现，和聚（乙烯）乙二醇，与商业纤维蛋白胶相比，得到一个2.5倍的耐水附着性。

此视频描述了制备可生物降解的手术胶水具有比商业组织粘合剂的有效的止血能力和更大的耐水粘合强度的最简单的协议。医用粘合剂已经由于其在使用方便与微创备受关注的潜在的替代工具，缝线和U形钉。虽然有几种协议制定组织粘合剂包括那些市售如纤维蛋白胶水和氰基丙烯酸酯基材料，主要是它们需要一系列的有机分子，或复杂的蛋白质纯化方法的化学合成的，在生物驱动材料的情况下（ 即纤维蛋白胶）。此外，手术胶水的发展显示出高的粘合性，同时维持生物降解性仍然是一个挑战，因为在实现本体的潮湿环境良好的性能的困难。我们说明了一种新的方法来准备医用胶，称为胶带，由植物来源的，湿耐粘合剂分子的物理混合后形成的水不混溶性的超分子聚集体的重量为基础的分离，T annic 的 CID（TA），以及公知的生物聚合物，聚（乙烯）乙二醇（PEG）。随着我们的做法，录像显示粘接强度高，比在有水存在的商业纤维蛋白胶的2.5倍。此外，磁带是在生理条件下可生物降解的，并且可以用作抗组织出血一种有效的止血胶水。我们预期在各种医疗环境和药物递送的应用中，广泛使用磁带的诸如用于粘膜粘附更为聚合物，药物贮藏和。

在过去的十年中，已经进行了努力，以取代目前的手术缝合线和缝合钉关闭与生物可降解/生物可吸收的粘合剂伤口由于在外科手术处理它们在使用和低组织侵袭性的便利。市售的组织粘合剂分为四种类型:（1）氰基丙烯酸酯衍生物^1，（2）通过酶转化从纤维蛋白原形成由凝血酶^2,3至纤维蛋白聚合物的血纤维蛋白胶，（3）基于蛋白质的材料，如化学或物理交联的白蛋白和/或明胶^4,5，和（4）为基础的聚合物合成的^6。尽管它们已经在许多临床应用中使用，所有的粘合剂具有其自己固有的不足和缺陷，可以是它们的广泛使用的障碍。氰基丙烯酸酯系胶粘剂显示出高的粘合强度的组织，但它们的毒性副产物如氰基和甲醛降解过程中形成的，常会导致符号量占用度的炎症反应^7。血纤维蛋白胶水和白蛋白或明胶基材料具有关于传染性成分，如动物来源的病毒的传输安全性的问题:人血浆纤维蛋白胶水和动物包括牛，鸡，猪和鱼明胶基胶水^8。虽然一些基于合成聚合物的粘合剂已通过美国联邦药物管理局（FDA），由合成聚合物的大多数粘合剂继续在减少制造过程中的步骤和实现生物相容性⁹困难。最重要的是，所有的胶水贫困机械和粘接强度遭受湿纸巾^10。近日，由贻贝^11-13，14壁虎，壁虎与贻贝¹⁵和内寄生蠕虫启发¹⁶仿生组织粘合剂已经逐渐成为有前途的替代品，以目前的医疗胶由于其可调的机械和粘接性能与生物相容性。然而，到了今天，仍有待解决的问题，他们成为商业化产品^17日之前。

在这里，我们报告一个称为胶带全新型医疗胶是由植物来源的粘附分子，单宁酸（TA）和一个生物惰性聚合物聚（乙二醇）（PEG）之间的分子间氢键制备正如其名称所示。 TA是植物的次生代谢过程中发现普遍存在的代表水解单宁。它已引起人们的关注，因为它的抗氧化剂，抗诱变，和抗致癌特性，并已被证明参与超分子相互作用与许多聚合物，如聚（N- -isopropylacrylamide）（PNIPAM）和聚（N -乙烯基吡咯烷酮）（PVPON），以形成层-层（LBL）膜^18-20和药物释放的微胶囊^21-23。在这项研究中，我们发现，TA可以作为一个有效的行动耐水粘接性官能基团，以形成医用粘合剂，胶带。通过用TA简单混合，非结垢聚合物PEG变得与超分子胶2.5倍与商业纤维蛋白胶相比增加粘合强度，并且此粘附保持在整个装卸的多达20个循环，甚至在水存在。其止血能力上的肝出血模型的体内测试，并显示出良好的止血能力以停止在几秒钟内出血。录像带的相关领域作为第一植物性粘合剂可以揭示新的洞察解决与生物启发方法目前存在的问题的弊端其显著的意义。我们也期望在各种医疗和药物应用如粘膜粘合剂，药物释放的补丁，伤口护理敷料以及其他的广泛使用磁带，由于其制备方法简单，可扩展性，可调谐的生物降解速率，以及高湿耐adhes离子的特性。

所有的动物护理和实验是按照由KAIST（科学与韩国高等科技学院）提供的道德协议IRB（伦理审查委员会）执行。

1. TAPE形成

1. 制备的TA溶液，放置在磁力搅拌器上4ml的大小的玻璃小瓶中，并加入1毫升蒸馏水有搅拌棒。 1克鞣酸加入到小瓶中，并通过温和搅拌以200rpm以上1小时溶解在水中。当TA完全溶解，该混合物变成透明的褐色。
2. 通过由涡旋几秒到使白色浆液将它们混合加入1g的PEG粉末（4-臂，10 kDa的，以及直链的，4.6 kDa的）至1毫升蒸馏水，随后制备的PEG溶液。保持在孵化该浆料在60℃下10分钟。直到白某变得完全清楚。
   注:PEG的10 kDa的分子量的熔点为约55- 60℃，并在4 kDa的一个是53 - 58℃。熔化的PEG变成水混溶性，使得PEG的水高达1克高浓度/毫升，可以实现为透明的溶液。一旦明确PEG溶液在高温下形成的，该溶液仍然是冷却后在室温下是稳定的。
3. 添加PEG的329微升（4-臂，10 kDa）的溶液中制备1.2至671微升在步骤1.1中制备的TA溶液（在具有4.6 kDa的线性PEG的情况下，添加的PEG溶液的311微升至689微升在微型离心管中的TA溶液）。轻轻地融合与一个狭窄的铲两粘性和蜂蜜般的解决方案，它们均匀混合。
   注意:这两种解决方案都相当粘稠，所以科学家必须缓慢而充分地拉起来 ​​，用微量的传输解决方案。
4. 旋在12300 xg离心在装有固定角转子的离心分离机，在步骤1.3制备3分钟的混合物。
5. 仔细REM奥雅纳尽可能多使用微量上清液尽可能的，并收集已定下来的产品是:这是完全形成胶带。后胶带的形成，它存放在冰箱（4 - 8℃）长达数周。注 :TAPE能够用γ射线或在外科应用在使用前的电子束处理来灭菌。

2.带粘合强度的测量

1. 制备猪皮肤组织的两片由在皮肤上的组织去除所有脂肪后，用活检穿孔切割直径为6毫米。
   注:从健康猪侧翼的皮肤得到的猪皮肤组织，并从位于大田的韩国当地肉类市场购买。
2. 适用的商业氰基丙烯酸酯胶的每个组织的外侧，并且组织附着到金属杆。
   注:金属杆被用作补充手柄，使织物a重不直接由机器夹住。因此，它可以用下面的拉伸机的结构的其他材料来代替。
3. 应用带的压降（TAPE一滴大约为3 - 6毫克）于组织的一侧。然后，散布在胶带均匀地使用在其内两侧的两个组织之间的另一个组织，以便它们所连接， 如图2A所示 。
4. 然后，手动附加和分离组织双方几次混匀并最大限度地提高各组织和磁带之间的接口。
5. 用UTM，小心地夹住杆的每一侧。的粘接强度将通过分离附着有胶带两种组织所需的力来确定。首先，应用的20 N的力1分钟。接着，用机，以1mm /分的速度拉在相反方向上各棒。直至组织完全分离。
   注意:数据将给出的力-距离由运动检测（FD）曲线的每个杆。
6. 除以在步骤2.5通过样品表面区域取得的FD曲线所示的最大力（kN）计算带的粘合强度，也就是3.14×（0.003米^）2。
7. 对于在水的存在下监测的粘接强度，加入20微升的水在分离的区域两种组织之间，并立即附加它们。随着机，再次进行测试支队。

3. 体外降解测试

1. 切微型离心管的盖子（D = 8 MM），并权衡帽将其定义为W _C。
2. 装满150毫克磁带的帽子，再权衡所有一起将其设置为一个总的初始重量W _0。
   注意:不要在帽超载TAPE。带的高度应该比盖的顶部低，因为它可以是一个物理屏障以在步骤3.4中孵育期间由搅拌过程中产生的PBS缓冲液的流。
3. 把含有TAPE到细胞培养瓶的帽（75 ^平方厘米），并加入50毫升的PBS缓冲液（1×，pH 7.4）中，以细胞培养烧瓶，以便在盖的磁带完全浸入PBS缓冲液，如在图3A所示（N = 5）。
4. 孵育在步骤3.3中，在37℃，类似于生理条件的轨道摇动孵化器中制备的细胞培养瓶中，在温和搅拌下（50rpm）进行。
   注意:保持搅拌条件以50rpm。更高的转速可能导致TAPE的崩溃。
5. 在每个时间点，采取与从细胞培养烧瓶TAPE帽，然后通过吹氮气干燥。称量装有剩余磁带上限。在每个时间点为W _t将重量。再次更换新鲜的PBS，并在每个时间点测量W¯¯ _吨后再次摇晃。
6. 计算相对其余重量（％）在下面的等式。
   相对剩余重量（％）=（W _吨 - W _{C）/（W 0} - W _C）×100％

4.带止血能力

注:所有的动物实验应按照卫生和福利部韩国提供的准则和道德协议来完成。

1. 为了评估在体内的止血功能，如参考文献²⁴中描述审查出血鼠肝模型。
2. 麻醉15只小鼠（正常ICR小鼠，6周，30 - 35克，雄性）以替来他明 - 唑拉西泮（33.333毫克/千克）和赛拉嗪（7.773毫克/千克）的腹膜内注射（N =每组5只）。要确认正确的麻醉，轻轻一捏动物的爪子和观察运动，如抽出爪子等 ，没有动作表明，该动物是充分麻醉做手术。
3. 为防止动物的眼睛干涩，下充分而申请的兽医药膏眼睛感知。暴露经由中线腹部切口肝脏，并用18G的针以诱导出血刺肝脏。
4. 除去流动的血液用无菌纱布，并把100微升TAPE或纤维蛋白胶（阳性对照）的立即在出血部位。
   注:在应用胶带后，需要因对伤口组织中的高血耐粘接性能没有进一步的缝合。为阴性对照，无处理发生在出血的部位。
5. 在每一种情况下，把一个滤纸与已知质量的肝脏下方，以收集来自损伤部位的血液。用新的，每30秒，4次（ 即 ，2分钟）更换纸张。
6. 测量所收集的每30秒每滤纸吸收血液的质量。动物实验后，通过牺牲_二氧化碳窒息安乐死的老鼠。

带是超分子聚集体离心含有TA（1微克/毫升蒸馏水中）和PEG（1微克/毫升的蒸馏水中）与2两种水溶液的混合物后稳定下来:1的体积比（ 图1A）。混合比是在实现高粘附强度的关键因素;当带通过一个2形成的:1混合比，20个单位在25个单位的TA的羟基（-OH）的与PEG各醚基（-O-）相互作用，导致最高的分子间氢键形成具有最大粘附性能。 -OH的其余五个单位似乎通过与TA（ 图1B）相邻的羰基（C = O）的分子内氢键被消耗掉。当各组分的任一个是在过量的2:1的体积比，粘合强度显着降低^25。氢键也将与组织中的关键分子水平的相互作用。控制ダ和TA和PEG之间的分子内氢键的凝聚力，TA和的粘附组织之间可能是带的可行的机制作为有效手术胶水。

用于测量粘合强度，二猪皮肤的各表皮边之间首先被施加有直径为6mm磁带。随后，将其通过连接各猪皮肤外，如在图2A中描绘的杆夹持拉伸机上。分离2的猪皮肤所需的力是由在不存在（ 图2B）和水的存在（ 图2C）的机反复安装拆卸的每5个循环后测定，最多20个循环。在干燥状态下的粘合强度为约200kPa的初始测量，和20次循环后，甚至提高到约250千帕。在加入到各循环水的存在下，附着力为约90千帕，然后20次循环后降低到50千帕。在湿状态下的粘接强度显着低于在干燥状态，但它仍然是与商用粘合剂，纤维蛋白胶，这是约70千帕通过在没有水²⁵相同我们设定测量可比。

带的降解通过体外 （ 图3）重分析研究。胶带在37℃下浸渍于1×PBS（pH7.4）中并轻轻搅拌，然后每次剩余质量测定21天。每次剩余磁带的照片也示于图3B。通过混合TA和聚乙二醇与1取得的磁带:1的比例为13天后完全降解，和由两种组分用2制成带的42％:1的比例进行后21天（ 图3C）降解。降解率是在与粘合强度逆相关，因为更快的降解主要是由于下的分子间的相互作用，这种情况产生在带的情况下，降低粘合强度，如前所述。所以结果如预期; TAPE由混合2:1的比例显示出比由1降解速度慢:1的比例，因为TA的所有反应-OH和PEG所有-O-形成分子间氢键的最高数字。以1:1的比例，-O-的在聚乙二醇过量可能削弱粘结性，从而导致更快的降解。

最后，带的止血能力在体内进行了研究。磁带首先被施加在小鼠肝脏从18G的针损伤后，立即如图4A所示 。出血的治疗后的最初的30秒期间的量通过吸附血液到滤纸和比较负（无处理）和阳性对照（纤维蛋白胶）（ 图4B和4C）搜集。出血总量也演算通过收集出血，每30秒的量ated。直到它停止。如在图4D中所示，出血显著由带的止血能力抑制（总出血量为未处理的情况下只有15.4％），而不是市售品，纤维蛋白胶（总出血量为未处理的情况下60.7％ ）。

图1:带组 （A）使胶带系列步骤。（比例尺:0.5厘米）。 （B），通过分子内和分子间氢键的形成TAPE一个化学反应。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:测量设置对猪皮肤胶带粘结强度 （A）的方案。 （B - C）上，在水的存在的情况下和（C）的猪皮肤（B）的重复attach-和拆卸期间粘合强度的变化。误差棒代表的3次重复测量的平均值±标准偏差（SD）（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001和**** P <0.0001，单向ANOVA检验）。 （从文献²⁵许可重新打印。） 点击此处查看该图的放大版本。

图3:在生理情况下TAPE降解率 （A）测量设置的照片。 （B）代表辐透在每个降解试验录像带剩余的操作系统。 （C）在37℃下一段时间在1×PBS缓冲液孵育（pH 7.4）中后剩余的％质量变化监测21天（TA:PEG = 2:1和1:1）（N = 5 ，误差棒±SD）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4:TAPE 体内 的止血能力 （A）中的照片显示磁带由一个18G的针头损坏肝脏的表面上的应用。 （B）的代表性的照片，其显示出血的最初的30秒的量。在处理带中，以及负（无止血剂）和阳性对照（纤维蛋白胶）之后。 blee的每个定量量定示于（C）。 （D）的总量的出血，收集每30秒，直到它停止。误差棒代表平均值±标准偏差的5次重复测量（SD）（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001和**** P <0.0001，单向或双向ANOVA检验）。 （从文献²⁵许可重新打印。） 点击此处查看该图的放大版本。

我们开发了一个全新的由植物衍生的多酚化合物，TA的抗水分子相互作用的启发止血胶粘剂命名的胶带。 TA是一个代表可水解单宁已显著受到关注，因为它的抗氧化，抗菌，抗诱变，和抗致癌特性。

使磁带的过程是非常简单的，可扩展和环境友好的，因为它仅仅是两种水溶液随后不经任何进一步的化学合成方法离心的一步法混合。

双组分混合协议是形成在常规的产品，如纤维蛋白胶用于组织粘合剂最典型的，最简单的方法。它是由权适用于组织前³混合纤维蛋白原和凝血酶形成。然而，需要多步化学合成制备的情况下°的粘合剂的部件˚F氰基丙烯酸酯胶和合成聚合物类粘合剂。此外，高毒性的化学物质有时被涉及作为一种成分，以化学交联在基于蛋白质的材料包括聚合物前体的其它组分，由戊二醛和胶含有福尔马林和间苯二酚固化。

通过戊二醛固化材料表现出在使用兔在动物研究肺和肝脏组织体内的炎症反应的高，虽然它已为主动脉组织被FDA批准。含有甲醛和间苯二酚也材料胶从福尔马林与周围组织²⁶反应而产生的毒性问题困扰。

离心机步骤是带发展成为原位 -forming，注射粘接在身体唯一的缺点，但磁带的丰硕优势保证其开放的，广泛使用。的胶带形成的一个关键步骤是，两种组分的混合可能可能有点棘手，因为他们的高粘度的，但总体来说，任何人都可以始终如一地使胶带大量在实验室没有任何批与批之间的变化。

带的粘合强度比广泛使用的商用粘合剂，血纤蛋白胶的高2.5倍，并且大规模出血成功地被胶带对体内我们的小鼠肝出血模型中的伤口部位的耐血附着抑制。降解率和磁带的机械性能可以通过使用支化/多臂PEG以及一种具有末端官能团如胺，羧酸酯，和环氧化物进一步可调的。在我们的数据的最大粘合强度由一种聚乙二醇的比率优化（4-臂，10 kDa和2臂，6.4 kDa的）到TA，但它也应该由最终的官能团的影响，臂数和分子量的PEG。

我们预计，胶带也可以有广泛用作药物贮存库和adhesiv对伤口愈合的目的，而不是仅仅作为止血剂，由于其封装经由TA的公知的亲和力的化学物质，以各种大分子，包括牛血清白蛋白²⁷的DNA ^28，聚（N- -isopropylacrylamide）能力È补丁（ ^{PNIPAM）29，}和金属离子^30。

The authors have nothing to disclose.

This study was supported by National Research Foundation of South Korea: Mid-career scientist grant (2014002855), and Ministry of Industry, Trade, and Natural Resources: World Premier Material Development Program. This work is also supported by in part by Center for Nature-inspired Technology (CNiT) in KAIST Institute for NanoCentury (KINC).