Method Article
A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.
Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.
Os herbicidas são a medida controle de plantas daninhas mais amplamente utilizado, sendo responsável por até 50% do mercado global de proteção de plantas 1. Eles são ferramentas relativamente baratas, evitar práticas de cultivo do solo e demorado de trabalho intensivo, e, finalmente, resultar na produção de custo-eficaz, segura e rentável comida 2. No entanto, a grande variabilidade genética fenológico e presente em muitas espécies de plantas daninhas, em conjunto com um excesso de confiança no uso de herbicidas, freqüentemente resulta na seleção de populações de plantas daninhas resistentes a herbicidas. A introdução de herbicidas selectivos com um alvo metabólica muito específico 3-5 aumentou dramaticamente o número de casos de resistência ao longo dos anos. Até o momento, 240 espécies de plantas daninhas dicotiledôneas (140 e 100 monocotiledôneas) no mundo todo desenvolveram resistência a diferentes herbicidas Sites de Ação (SoA) 4. Esta é uma grande preocupação para manejo de plantas daninhas e mais em geral, para a produção agrícola sustentável.
e_content "> A detecção precoce da resistência, com base em testes confiáveis, freqüentemente realizados em casa de vegetação, é um passo fundamental para manejo de ervas daninhas resistentes a herbicidas. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidas de acordo com os objectivos, necessário nível de precisão, o tempo e os recursos disponíveis, como bem como as espécies de ervas daninhas considerados 12/06. No entanto, quando é requerida a confirmação do estado de resistência de um novo biótipo de ervas daninhas (isto é, um grupo de indivíduos que partilham várias características fisiológicas, incluindo a capacidade de sobreviver a um ou mais herbicidas pertencentes a um grupo particular utilizado a uma dose que normalmente controlá-los), uma planta inteira robusta bioensaio tem de ser realizada num ambiente controlado, 4, 11.Um biótipo raramente é resistente a apenas um herbicida. Cada biótipo é, portanto, caracterizada por um determinado padrão de resistência, isto é, o número e tipo de SOA dos herbicidas é resistente a, e por uma dada resistêncianível de cada herbicida 13. A determinação precoce e confiável do padrão de cruz ou resistência múltipla 5, 14 é importante para o manejo da resistência de campo.
Vale ressaltar que a resistência a herbicidas tem nada a ver com a tolerância natural que algumas exposições de plantas daninhas em relação a alguns herbicidas, por exemplo, espécies dicot vs. herbicidas inibidores da ACCase, espécies monocotiledôneas vs. 2,4-D, Equisetum arvense vs. glifosato.
Este artigo apresenta uma abordagem robusta para testar biótipos resistentes a herbicidas putativo amostradas em campos onde mau controle por herbicida (s) haviam sido relatados. Variantes relevantes para os protocolos padrão em relação às espécies de plantas daninhas envolvidos são apresentados. As vantagens sobre as técnicas alternativas / protocolos baseados em inteiros quer bioensaios vegetais utilizando apenas uma dose de herbicida 15, ou o tratamento de sementes em placas de Petri de 8 estão relacionados com a maior reliability e inferir a possibilidade de o nível de resistência devido à inclusão de duas doses do herbicida nas experiências. No entanto, para o teste de resistência de rotina, os mesmos métodos podem ser aplicados no apenas uma dose do herbicida, assim reduzindo os custos.
Bem como permitindo a confirmação do estado de resistência, a informação obtida pode ser usada para optimizar tanto as seguintes etapas de pesquisa e / ou a concepção de estratégias de gestão da resistência de som.
1. As sementes de amostragem e armazenamento
2. Semente quebra de dormência
NOTA: dormência das sementes fornece um mecanismo flexível e eficiente que permite que as ervas daninhas se adaptar e persistem em agro-ecossistemas. Para quebrar a dormência e permitir a germinação de sementes, protocolos diferentes têm de ser utilizados dependendo das espécies de ervas daninhas, isto é, o tipo de dormência 16.
Existem três maneiras principais para remover dormência:
A germinação 3. Semente
4. das mudas e Crescimento
5. tratamentos herbicidas
6. Coleta e análise dos dados
Para avaliar o estado de resistência de uma população resistente putativo, é fundamental para incluir um controlo susceptível no ensaio, a fim de verificar a eficácia do herbicida. Os resultados de um teste de rastreio realizados em P. populações rhoeas, uma erva daninha infestante campos de trigo, são relatados na Figura 2, onde a eficácia de quatro herbicidas em pós-emergência sobre um cheque suscetível (09-36) e sobre a suspeita de um resistente (10-91) são apresentados. População 09-36 foi completamente controlado pelos inibidores da ALS iodossulfurão enquanto apenas uma planta sobreviveu de dose 1x dos outros dois herbicidas testados ALS, florasulame e tribenurão-metilo (Figura 2). Em vez disso, cerca de 60% das plantas da população 10-91 sobreviveram ambas as doses do herbicida de iodossulfurão e tribenurão-metilo e cerca de 50% sobreviveram a dose de 1x florasulame. Estes resultados confirmam que a população 10-91 é altamente resistente (RR) para iodossulfurão e tribenurão-metilo e resistente(R) a florasulame. Uma resposta diferente foi observada com 2,4-D, um herbicida tendo uma SOA diferente (isto é, simula um auxina endógena), amplamente utilizado para controlar as ervas daninhas dicotiledóneas em trigo. Apenas 33% das plantas da verificação de S foram mortos com este herbicida na dose 1x eo valor VEB era> 20% (Figura 2). A falta de eficácia na população de seleção não confirma se a população 10-91 é resistente ao herbicida ou não. Neste caso, recomenda-se a realização da experiência e novamente se os resultados forem confirmados, a alteração da população S. Um exemplo de um bom controlo da verificação susceptível é apresentado na Figura 3. A Echinochloa spp. população 07-16L foi completamente controlado por todos os herbicidas na dose recomendada campo (1x). Neste caso, é possível afirmar que a população 08-42 é altamente resistência cruzada a todos os inibidores de ALS testados, ou seja, azimsulfuron, bispiribac-Na, imazamox e penoxsulam. O ch tratado não-eck de ambas as populações é relatado à esquerda. Estas plantas são utilizados para calcular o VEB; a quantidade de biomassa é estimada visualmente por bandeja bandeja dando uma pontuação de 10 para a verificação não-tratadas e em seguida atribuindo uma pontuação de 0, para a replicar sem qualquer tecido da planta verde, a 10 quando a biomassa é comparável ao tratamento não- verificar (Figura 3).
Outro exemplo de saída é apresentado na Figura 4, onde a sobrevivência da planta de Lolium spp. ao glifosato é mostrado. As populações testadas foram coletados em sistemas de cultivo à base de trigo, onde o glifosato está exercendo pressão de seleção diferente (ou seja, ocasionalmente ou 1-2 tratamentos por ano ou 3-mais vezes por ano). As plantas foram pulverizadas na fase de perfilhamento cedo (BBCH 14-21), utilizando duas doses de glifosato: 480 e 1.440 g ea ha -1, que representam a dose máxima recomendada campo mínimo e para as ervas daninhas anuais (ou seja, terófitos) em que o crescimento stidade. Os dados foram recolhidos quatro semanas após tratamento. Com base em ambos os experimentos, sete das populações testadas tiveram uma taxa de sobrevivência de 80% ou mais populações (343, 383, 384, 403, 509, 512 e 537) com a dose mais baixa aplicada, mas apenas 50% de plantas de populações 403 e 509 sobreviveu à dose mais elevada de glifosato. Uma população tinha uma taxa de sobrevivência de cerca de 40% em 1x de dose, enquanto que apenas alguns plantas de população 509 sobreviveram a dose mais baixa e população 508 foi totalmente controlada em qualquer dose. Em resumo, estas experiências mostraram diferentes níveis de resistência ao glifosato que reflectiam frequentemente a história domínio da utilização de herbicidas. O nível de resistência ao glifosato foi maior para as populações que tinham sido tratados mais intensamente, ou seja, o número de aplicações de campo por ano e o número de anos de pressão de selecção foi mais elevada.
O protocolo descrito por um herbicida (Figura 4) pode ser aplicada a muitos outros que têm difealugar SoA; Deste modo, o padrão de resistência de uma ou mais populações podem ser determinadas. Um exemplo de resistência variabilidade padrão de Echinochloa spp. populações é relatado na Tabela 1. Os registros históricos de uso de herbicidas e manejo da cultura obtida a partir do agricultor indicaram que os herbicidas inibidores da ALS foram o agente selecionador (ou seja, penoxsulam ou imazamox). O teste de resistência foi, portanto, realizada com três inibidores da ALS (azimsulfurão, herbicida penoxsulam e imazamox) pertencentes a diferentes famílias de produtos químicos, e um herbicida ter outro SoA, o profoxidime herbicida inibidor de ACCase. A verificação susceptível (07-16L) foi completamente controlado por todos os herbicidas testados (Tabela 1). Foram detectados três padrões de resistência: treze populações resultou como sendo resistentes somente a inibidores de ALS, quatro populações resultou de ser resistente somente ao profoxidime inibidor ACCase, e três populações apresentaram um múltiplo padrão de resistência tanto ao profoxidime inibidor ACCase e inibidores de ALS. Dentro de cada padrão de resistência que é possível distinguir diferentes biótipos, por exemplo, quatro populações resistentes a inibidores da ALS sobreviveram apenas tratamentos com o azimsulfurão sulfonilureia, enquanto duas das populações multirresistentes sobreviveu apenas o tratamento com o inibidor ALS azimsulfurão, mas foram bastante controlados por penoxsulame e imazamox.
Figura 1. Exemplo de C. difformis, uma espécies de plantas daninhas que infestam o arroz em casca, experiência set-up. bandejas de poliestireno são colocadas em recipientes plásticos e bloqueado por hastes de aço inoxidável parafusado para impedi-los flutuando. A água é mantida a 1-2 cm abaixo do nível da superfície do solo para imitar as condições de arroz em casca. A fotografia foi tomada quatro semanas após o tratamento.p_upload / 52923 / "target =" _ blank 52923fig1large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Resposta de duas P. rhoeas populações de herbicidas pós-emergência. Efeito do iodossulfurão, tribenurão, florasulame e 2,4-D testados na dose recomendada campo (1x) e três vezes que (3x) na sobrevivência das plantas (as barras azuis) e biomassa estimativa visual ( VEB; barras vermelhas) da verificação de suscetíveis (09-36) e de uma população resistente (10-91). A avaliação foi feita de quatro semanas após o tratamento com herbicida. A sobrevivência da planta e VEB são expressos como percentagem do número de plantas tratadas e VEB dos controlos tratados com não (%). A linha horizontal a 20% de sobrevivência das plantas representa o limiar de discriminação entre as populações resistentes e suscetíveis quando as plantas são tratadas em 1x dose. As barras verticaisrepresentam erros padrão calculados sobre o valor médio das duas repetições. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os resultados visuais de uma triagem em dois Echinochloa spp. populações. A verificação susceptíveis, 07-16L (S), e a população resistente, 08-42, foram testados com quatro inibidores de ALS (reportada à direita) em duas doses, 1x e 3x, relatados (na parte inferior). Para a verificação de S apenas resultados de 1x doses são relatados, porque todas as plantas já foram controlados em que dose. Três exemplos de pontuação VEB são relatados em vermelho: 0 = todas as plantas mortas, 10 = todas as plantas sobreviveram e biomassa é comparável com o cheque não-tratados (NT) (reportado à esquerda), 5 = biomassa é cerca de metade do que em uma bandeja do tratado não-verificar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Percentagem de sobrevivência das plantas durante dez Lolium spp. populações testadas com a sobrevivência glifosato. Planta gravado em dois experimentos (barras azuis e bares laranja para exp. I e II, respectivamente). Os dados são expressos como uma percentagem (%) do número de plantas tratadas. Dois controlos sensíveis foram totalmente controlada na dose 1x e portanto não são relatados no gráfico. Foram testadas duas doses, o mínimo (1x = 480 g ea ha -1) e máximo (3x = 1.440 g ea ha -1) doses referidas no rótulo do produto. A linha horizontal a 20% de sobrevivência das plantas representa o limiar de discriminação entre as populações resistentes e suscetíveis quando as plantas estavam deleiteed em 1x dose. As barras verticais representam erros padrão calculados sobre o valor médio das duas repetições. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Resistência estado de vinte e uma populações de Echinochloa spp. Verificação Suscetíveis (07-16L) é relatada em negrito. Os níveis de resistência são referidos para cada um dos quatro herbicidas testados (um inibidor ACCase, profoxidime, e três inibidores de ALS, azimsulfurão, penoxsulam e imazamox) de acordo com quatro categorias: S = menos de 5% das plantas sobreviveram à dose de herbicida 1x, SR = sobrevivência das plantas variou de 5% a 20% em 1x dose do herbicida, R = mais de 20% das plantas sobreviveram os 1x dose do herbicida, RR = sobrevivência da planta era mais do que 20% na dose de herbicida1x e mais de 10% na dose de 3x. Diferentes padrões de resistência são realçados: vermelho = resistência apenas à inibidor ACCase, amarelo = resistência única aos inibidores da ALS (s), laranja = resistência ao inibidor ACCase e a pelo menos um inibidor de ALS.
Várias medidas no âmbito dos protocolos são críticos para uma avaliação bem sucedida de resistência a herbicidas em uma população: 1) sementes devem ser coletadas quando madura a partir de plantas que sobreviveram ao tratamento (s) herbicida. Maturação das sementes na planta mãe é crucial para evitar dificuldades na germinação das sementes mais tarde; 2) É recomendado o armazenamento adequado das sementes para evitar a proliferação de fungos que possam impedir a germinação; 3) mudas devem ser tratadas na fase de crescimento para a direita, tal como indicado no rótulo da embalagem herbicida. Deve ser tomado cuidado de modo que as plantas a ser tratada, atingiram, aproximadamente, a mesma fase de crescimento; 4) as soluções do herbicida deve ser preparado e manuseado com precisão de modo que as plantas são pulverizadas com a concentração correcta de ingrediente activo, por conseguinte, evitar os erros não verificáveis; 5) depois de cada tratamento herbicida, recomenda-se limpar completamente o gabinete de pulverização e copos usados para preparar as soluções para evitarcontaminação na seguinte tratamento herbicida, especialmente quando herbicidas altamente biologicamente activos estão envolvidos.
Os protocolos aqui apresentados podem ser rapidamente adaptados a uma vasta gama de espécies de ervas daninhas, com as modificações necessárias de acordo com a espécie de interesse e herbicidas. Em particular, os métodos para quebrar a dormência das sementes e para a germinação são passos que devem ser reexaminadas para cada nova espécie de plantas daninhas (ver secções 2 e 3). Equipamento de pulverização, por vezes, necessita de ajustes quando diferentes herbicidas são usados, por exemplo, o glifosato requer diferentes configurações do gabinete de pulverização (ver secção 5.3) e as plantas são tratadas numa fase de crescimento mais tarde do que a maioria dos herbicidas.
O tempo e espaço necessário para realizar estes protocolos podem ser um factor limitativo e pode não ser adequado para testes de rotina. No entanto, para limitar os custos, apenas uma dose de herbicida podem ser usadas. Desta forma, a informação pode ainda ser obtido na se tele população é resistente. Uma limitação da abordagem potencial está relacionado com o facto de que não há controlos resistentes estão incluídos nas experiências. Na verdade, devido ao grande número de biótipos avaliadas (ou seja, diferentes espécies envolvidas e herbicidas), muitas verificações devem ser incluídos em cada experiência, de modo a aumentar os custos.
No entanto, as vantagens sobre as técnicas / protocolos alternativos baseados em bioensaios planta inteira usando apenas um herbicida de dose 15 está relacionado com a maior fiabilidade e a possibilidade de se inferir o nível de resistência. Testes rápido e menos dispendioso de pesquisa de diagnóstico também têm sido desenvolvidos, in vivo ou in vitro (por exemplo, os bioensaios prato de Petri 8, ensaios espectrofotométricos de herbicida enzima alvo 29). No entanto, eles só fornecem informações qualitativas e exigir algum trabalho preliminar, às vezes trabalhoso, identificar a dose herbicida para discriminar entre resplantas istant e suscetíveis. Os ensaios in vitro também têm de ser adaptados de acordo com o princípio ativo utilizado.
The authors declare that they have no competing financial interests.
The research was supported by the National Research Council (CNR) of Italy. The authors thank GIRE members for collecting seed samples and are grateful to Alison Garside for revising the English.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Paper bags | Celcar SAS | ||
Plastic dishes | ISI plast S.p.A. | SO600 | Transparent plastic |
Sulfuric acid 95-98% | Sigma-Aldrich | 320501 | |
Non-woven fabric | Carretta Tessitura | Art.TNT17 | Weight 17 g m-2 |
Chloroform >99.5% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
Potassium nitrate >99.0% | Sigma-Aldrich | P8394 | |
Plastic containers | Giganplast | 1875/M | 600 x 400 x 110 mm |
Plastic trays | Piber plast | G1210A | 325 x 265 x 95 mm |
Polystyrene trays | Plastisavio | S24 | 537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4) |
Copper sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
Agriperlite | Blu Agroingross sas | AGRI100 | |
Peat | Blu Agroingross sas | TORBA250 | |
Germination cabinet | KW | W87R | |
Nozzles | Teejet | XR11002-VK, TP11001-VH | The second type of nozzles are used only for glyphosate |
Barcode generator | Toshiba TEC | SX4 | |
Labels with barcode | Felga | TT20200 | Stick-in labels with rounded corners |
Barcode reader | Cipherlab | 8300-L | Portable data terminal |
Bench sprayer | Built in house | ||
Herbicides included in the results: | |||
Commercial product | Active ingredient | Company | Comments |
Altorex | imazamox | BASF | |
Azimut | florasulam | Dow AgroSciences | |
Biopower | Bayer Crop Science | Surfact to be used with Hussar WG | |
Dash | BASF | Surfact to be used with Altorex | |
Granstar | tribenuron-methyl | Dupont | |
Gulliver | azimsulfuron | Dupont | |
Hussar WG | iodosulfuron | Bayer Crop Science | |
Nominee | bispyribac-Na | Bayer Crop Science | |
Roundup | glyphosate | Monsanto | |
Trend | Dupont | Surfact to be used with Granstar and Gulliver | |
Viper | penoxsulam | Dow AgroSciences | |
Weedone LV4 | 2,4-D | Isagro |
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