Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

-Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D.

O microambiente mecânica tenha sido mostrado que actua como um regulador essencial do comportamento de crescimento tumoral e a sinalização, que é em si remodelada e modificada como parte de um conjunto de interacções, bidireccional mechanosensitive complexos. Enquanto o desenvolvimento de modelos de tumor 3D biologicamente relevantes tenham facilitado os estudos mecanísticos sobre o impacto da reologia da matriz sobre o crescimento do tumor, o problema inverso de alterações de mapeamento do ambiente mecânica induzida por tumores permanece um desafio. Aqui, descrevemos a implementação de rastreamento de partículas microrheology (PTM), em conjunto com modelos 3D de câncer de pâncreas, como parte de uma abordagem robusta e viável para monitorar longitudinalmente mudanças físicas no microambiente tumoral, in situ. Esta metodologia integra um sistema de preparação in vitro modelos 3D incorporados em uma matriz extracelular modelo (ECM) andaime de colágeno tipo I com sondas marcadas com fluorescência distribuída uniformemente para pomedições microrheology dependentes do tempo em todo o espécime ção-e. in vitro tumores são banhados e sondado em condições paralelas usando placas de imagem multipoços. Baseando-se em métodos estabelecidos, vídeos de movimentos sonda traçadores são transformados através da Relação Generalizada Stokes Einstein (GSER) para relatar o módulo de cisalhamento complexo viscoelástico dependente da freqüência, G * (ω). Como essa abordagem é baseada em imagem, caracterização mecânica também é mapeado sobre grandes campos espaciais de luz transmitida simultaneamente para relatar mudanças qualitativas no tamanho e fenótipo tumoral 3D. Os resultados representativos mostrando contrastante resposta mecânica em sub-regiões associadas com a degradação da matriz localizada induzida por invasão, bem como a calibração do sistema, dados de validação são apresentados. Também são apresentados os resultados indesejáveis ​​de erros experimentais comuns e solução de problemas dessas questões. O formato cultura chapeamento 3D de 96 poços implementado neste protocolo é conducive a correlação de medições microrheology com testes de rastreio terapêuticos ou de imagem molecular para ganhar novos insights sobre o impacto de tratamentos ou estímulos bioquímicos no microambiente mecânica.

Fica claro a partir de um crescente corpo de evidências na literatura de que as células cancerosas, como acontece com as células epiteliais de mamíferos não-malignas, são altamente sensíveis às propriedades mecânicas e biofísicos da matriz extracelular circundante (ECM) e outros componentes do microambiente ^1-9. Estudos sobre os mecanismos elegantes forneceram insights sobre o papel da rigidez extracelular como um parceiro de sinalização mechanosensitive complexo que regula o comportamento crescimento maligno e morfogênese ^2,3,10,11. Este trabalho foi facilitado, em especial, pelo desenvolvimento de 3D ​​em modelos tumorais in vitro que restauram biologicamente arquitectura dos tecidos relevantes e podem ser cultivadas em materiais de andaime com mecânicos ajustáveis ​​e fotografada por microscopia óptica ^12-19. No entanto, o outro lado dessa caixa de diálogo mechanoregulatory entre tumor e microambiente, através do qual as células cancerosas, por sua vez alterar a reologia de seu entorno, permanece um tantomais difíceis de estudar. Por exemplo, durante os processos de invasão, as células na periferia do tumor podem sofrer epitelial para mesenquimal (EMT) e aumentar a expressão de metaloproteases de matriz (MMPs), que provocam a degradação do local ECM ^20-22, que por sua vez influenciam o comportamento de crescimento de mechanosensitive outras células tumorais proximais. Através de uma variedade de processos bioquímicos, células cancerosas discar continuamente a rigidez local do seu meio ambiente para cima e para baixo para se adequar a diferentes processos em momentos diferentes. A metodologia descrita aqui é motivado pela necessidade de ferramentas analíticas que relatam alterações locais na rigidez e conformidade do ECM durante o crescimento, que podem ser integrados com modelos de tumor 3D e correlatos longitudinalmente com alterações bioquímicas e fenotípicas sem terminar a cultura.

Em busca de uma técnica adequada para implementar neste contexto, microrheology partícula-tracking (PTM) emerge como um forte candidato.Este método, foi pioneira originalmente por Mason e Weitz ^23,24, usa o movimento de sondas de rastreamento incorporado em um fluido complexo para relatar o complexo módulo dependente da freqüência viscoelástico de cisalhamento, G * (ω) em escalas de comprimento micro. Esta abordagem geral foi desenvolvido com múltiplas variações adequadas para diferentes aplicações em soft-Matéria Condensada, colóides, biofísica e física polímero ^25-31. PTM tem certas vantagens em relação a outros métodos, uma vez que as leituras da viscoelasticidade local são fornecidos pela imagem de vídeo não-destrutiva das sondas marcadoras bioquimicamente inactivos que são incorporados no momento da preparação da cultura e permanecem no lugar durante longos períodos de crescimento. Isto está em contraste com as medições padrão de ouro com um reómetro de cisalhamento oscilatório a granel, o que requer, necessariamente, de terminação da cultura e relata a reologia macroscópica volume da amostra, em vez de medições pontuais dentro do tumor microenvir 3D complexoente. De fato, vários estudos têm ilustrado a utilidade de interpretar as medições dos movimentos da sonda tracer ou em torno de células de câncer ou não câncer de medir deformações associadas com a migração de células ^32, estresse mecânico induzido por um esferóide expansão ^33, reologia intracelular ^34,35, e mapear tensões mecânicas e deformações em tecidos artificiais ^36, e relação entre o tamanho dos poros e velocidade invasão ^37. Outras técnicas adequadas para microrheology, como a microscopia de força atômica (AFM) pode ser implementado, mas principalmente para os pontos de sondagem na superfície da amostra e também podem representar problemas de esterilidade da cultura que complicam medições longitudinais ^38.

Aqui, nós descrevemos um protocolo abrangente que inclua métodos para o crescimento do tumor de esferóides 3D aptos a serem transferidos em ECM com sondas fluorescentes embutidas para vídeo partícula de rastreamento e análise de métodos para o mapeamento confiável espacialmudanças na microrheology mais tempo em cultura. Na presente implementação, modelos de tumores em 3D são cultivadas em formato de vários poços com vistas à incorporação de medidas microrheology com outros ensaios tradicionais (por exemplo, de citotoxicidade), que este formato é propício para. Nesta ilustração representativa de essa metodologia de cultura in vitro esferóides 3D utilizando PANC-1 de células, de uma linha celular de cancro pancreático estabelecido conhecido para formar esferóides ^39, mas todas as medições aqui descritas são amplamente aplicável ao estudo de tumores sólidos utilizando uma variedade de linhas celulares adequado para cultura 3D. Como esse método é baseado em imagem latente inerentemente é ideal para co-registro de dados microrheology de alta resolução com grandes campos de luz transmitida de vista que relatam alterações no crescimento celular, migração e fenótipo. A implementação da PTM integrado com microscopia de luz transmitida desta forma assume posicionamento reprodutível dos wh estágio do microscópioich está normalmente disponível em epifluorescência widefield comercial microscópios biológicos motorizados. O protocolo desenvolvido abaixo pode ser implementado com qualquer fluorescência automatizada microscópio biológico a equipados. Este é um método intensivo de dados inerente, o que exige a aquisição de gigabytes de dados de microscopia de vídeo digitais para processamento offline.

No seguinte protocolo, Protocolo 1 refere-se a uma preparação inicial de esferóides de tumor que é descrito aqui, utilizando sobreposição de agarose, mas podem ser substituídos com uma variedade de outros métodos, tais como a gota em suspensão ^40, ou cultura rotativa ⁴¹ técnicas. Protocolo 2 descreve o processo de incorporação de esferóides de um andaime do colagénio embora alternativamente, in vitro tumores 3D pode ser cultivada por encapsulação ou a incorporação de células ressuspensas em ECM ^12,15, em vez de simples esferóides não aderentes pré-formados. Protocolos subsequentes descrevem os procedimentos para obtaining medições microrheology resolvida no tempo através da aquisição e processamento de dados de microscopia de vídeo, respectivamente. O processamento de dados é descrito usando MATLAB, fazendo uso de rotinas de código aberto para a PTM construído em algoritmos originalmente descritos por Crocker e Grier ^42, que também foram amplamente desenvolvidos para diferentes plataformas de software (ver http://www.physics.emory.edu/ ~ semanas / IDL /).

1. Esferóides Cultivar tumorais

1. Misturar 10 ml de água de grau de cultura de células com 0,1 g de agarose para obter uma solução de agarose a 1%.
2. Solução de agarose de calor acima dos 70 ° C (cerca de 14 segundos num forno de microondas padrão ou usando uma placa de aquecimento) antes de alíquotas de 40 ul de solução de agarose a um poço numa placa de 96 poços.
3. Incubar a placa a 37 ° C durante pelo menos 1 hora, enquanto a colheita de células utilizando técnicas padrão.
4. Usar um hemacitómetro para determinar a concentração de células na suspensão.
5. Dilui-se a suspensão de células a 1000 células / ml e adicionar 100 ul desta diluição para o poço que contém o leito de agarose curado.
6. Colocar a amostra num agitador durante a noite numa incubadora a 37 ° 5% de CO ₂ e C.
7. Remova a amostra de agitador e adicionar 100 ml de meio de cultura celular.
8. Incubar esferóides até diâmetro desejado é atingido. Por exemplo, após 9 dias, um spHeroid será de cerca de 450 m de diâmetro. Durante este tempo, o meio de crescimento fresco pode ser adicionado aos poços de aspiração, mas deve ser evitado uma vez que isto irá resultar na remoção do esferóide.

2. Preparando Spheroids tumorais 3D incorporado em ECM

1. Prepara-se uma estação de trabalho com materiais necessários dentro de uma câmara de fluxo laminar.
2. Prepara-se uma mistura diluída de 1 um de diâmetro sondas marcadoras fluorescentes modificadas com carboxilato adicionando sondas banco de 2 partes (2% de sólidos) a 25 partes de água estéril.
3. Remover uma garrafa de 3,1 mg / ml de colágeno bovino do frigorífico e coloque-o no gelo.
4. Alíquota de 125 mL de colágeno em um vazio frasco de 2 ml.
5. Adicionar 50 ul de solução diluída de sonda traçador para o frasco contendo o colagénio e vortex brevemente para distribuir sondas.
6. Adicionar 235 ul de meio de cultura de células apropriado contendo vermelho de fenol (o qual vai ficar amarelo) para um volume total de 410 ml e vortex brevemente antes de retirar 205 ml (metade do volume total) e colocá-lo em um novo frasco de 2 ml. Frasco 1 conterá o esferóide de tumor e Frasco 2 será uma mistura de controlo.
7. Adicionar ~ 2 mL de NaOH a 1 M para o recipiente 1 para trazer novamente a solução até um pH neutro (meios de cultura contendo vermelho de fenol deve retornar a vermelho). Note-se que isto fará com que a mistura para iniciar a cura se não for mantido em gelo. Vortex brevemente para misturar, em seguida, retornar para rack de gelo imediatamente.
   NOTA: O esferóide é pouco visível a olho nu, após 9 dias de cultura e de sua retirada da cama de agarose é uma tarefa delicada. O uso de um microscópio de dissecção pode ser útil para alguns utilizadores. Manter a integridade do esferóide durante a transferência é primordial.
8. Usando uma pipeta de ponta em toda a boca, retire 40 mL de mídia do poço contendo o esferóide tumor. Guarde este 40 mL durante a realização da próxima etapa.
9. Verificar o poço para ver se o esferóidefoi removido no passo anterior. Se foi, adicionar 40 ul contendo o esferóide para o recipiente 1. Se não, colocar os 40 ul de volta para dentro do poço e repetir o passo anterior.
10. Agitar suavemente Vial 1 (não arrisque vórtex, pode danificar o esferóide) antes de transferir a mistura em 60 porções ul em três poços separados de uma placa de 96 poços. Inspeccionar cada poço com um microscópio, após a adição de mistura para determinar o que também contém o esferóide.
11. Adicionar ~ 2 mL de NaOH 1 M e 40 ul de meio de cultura de células para o frasco de 2 e vórtice antes aliquotamento 60 ul desta mistura a um poço vazio na placa de 96 poços e rotulagem como um controlo.
12. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C para curar durante pelo menos 1 hr.

3. Construir Rede de Pontos de exemplo e ter um vídeo em cada ponto

1. Transfira a amostra a partir da placa da incubadora para a platina do microscópio. Permita 10 minutos para que a amostra Equilibrate com a temperatura ambiente, se uma fase aquecida não está disponível.
2. Observar a amostra com baixas lentes objetivas movidos para ter certeza que está intacto e pronto para a imagem latente. Determinar a posição do tumor para dentro do poço.
3. Decida quantos pontos de amostragem para tomar. Normalmente, os 20 pontos de amostragem em cada poço, distribuídos em anéis concêntricos em torno do esferóide produzirá resultados adequadamente detalhados.
4. Mova o palco para cada posição desejada e usar microscópio interface de software para gravar as coordenadas xey (ou registro de coordenadas manualmente se a interface do software não estiver disponível).
5. Ligue o microscópio para uma lente objetiva de alta potência (tipicamente 100X) e selecione o cubo filtro apropriado para o comprimento de onda de excitação das sondas traçadores. Use a lista de pontos criados no passo 3,4 para passar para o primeiro ponto na grade.
6. Ajuste o foco para encontrar o fundo do poço, então mover-se para encontrar um campo de visão (FOV) contendo vários trac em focoer sondas.
7. Observe o histograma de intensidade e ajuste a intensidade e tempo de exposição para obter a maior gama dinâmica possível, assegurando que a imagem não fique saturada.
8. Obter uma seqüência de vídeo em uma taxa de quadros de 20-30 milissegundos por quadro (cerca de 800 quadros ou 16-24 seg de comprimento é recomendado para obter estatísticas suficientes para cálculo MSD robusto equilibrada com a necessidade de minimizar o tempo de aquisição em cada ponto de grade espacial) e salvar com uma convenção adequada. Durante a gravação, não toque no microscópio ou mesa.
9. Repita os passos de 3,6-3,9 para cada ponto de amostra na grade.
10. Repita os passos 3,3-3,10 para cada poço na experiência.

4. Analisar dados em vídeo para Calcular Propriedades reológicas em cada ponto amostral

1. Copie todos os dados de vídeo para uma pasta de análise (possivelmente em um computador diferente).
2. Dados de imagem importar para MATLAB ou outro software de análise.
   NÃOTE: vasta documentação sobre o conjunto de rotinas de monitoramento de partículas MATLAB adotadas aqui está disponível em http://people.umass.edu/kilfoil . Recomenda-se o uso de uma função de chamada personalizado para o processamento de múltiplos arquivos em diferentes posições automatizar.
3. Calibrar o software através da análise de vários frames do vídeo para determinar de forma adequada selecção e de rejeição de parâmetros (tamanho, passa-banda, etc) para a identificação de posições centrais sonda. Extensa fundo para estas etapas cruciais é descrito por Crocker e Grier.
4. Use o software para determinar automaticamente a cada posição da sonda para todos os quadros de vídeo e, em seguida, vincular essas posições em trajetórias.
5. Use os dados para calcular a trajetória quadrado médio de deslocamento (MSD) em função do tempo de atraso, sendo certo de aplicar o fator de calibração espacial adequada (mM por pixel) para a lente objetiva específica, qualquer binning pixels, etc (normalmente realizadoem meta-dados).
6. Calcule G * (usando a relação generalizada Stokes-Einstein levados em consideração os limites de aplicabilidade da GSER para um determinado amostra ^24,28,43. Alternativamente, os usuários podem querer interpretar propriedades ECM diretamente do MSD pela simples comparação de escala lei de potência, planalto valores, índices de heterogeneidade ou de outros parâmetros.
7. Repita os passos 4.2 através de 4.6 para cada fov no experimento.
8. Co-registro de dados de posição a partir do passo 3.4 com respectivos módulos viscoelásticos em uma freqüência específica de interesse. Dependendo do fabricante do microscópio utilizado, este passo pode ser facilitada por uma rotina personalizada que lê metadados microscópio ou posição de dados podem ser tabulados manualmente.
9. Use funções de interpolação 3D para gerar um mapa de reologia espacial da ECM.

Para verificar a validade do G * (ω) medições em posições localizadas dentro de um microambiente do tumor modelo complexo, dois experimentos de validação iniciais foram realizados. Em primeiro lugar, procurou-se validar nossas medidas contra o "padrão ouro" de reometria de cisalhamento oscilatório granel. Foram preparadas amostras idênticas de matriz de colagénio (sem células) a uma concentração de colagénio de 1,0 mg / ml. Estas amostras foram sondadas com um reómetro de massa (TA Instruments AR-G2, utilizando 40 milímetros de geometria de placas paralelas) e pela PTM (utilizando os mesmos parâmetros que ao longo deste protocolo) e as medições resultantes de G '(ω) e G "(ω ) foram comparadas (Figura 2A). Foi encontrada uma excelente concordância entre as duas medições. Em segundo lugar, para estabelecer a capacidade deste protocolo para medir as mudanças pontuais no ECM reologia que preparamos uma matriz de colágeno 1,0 mg / ml e contas traçadores incorporados. A amostra foi então tratada com uminjecção centralizada de 5 ul de dispase (Figura 2B), que digere o colagénio rapidamente. Após incubação durante 3 horas para permitir a digestão de colagénio localizado a ocorrer, os dados de vídeo foi feita a distâncias variáveis ​​do local da injecção, e as medições de G '(ω) e G "(ω) foram realizados em cada caso. A magnitude de G "(ω = 1 rad / s) verificou-se ser maior do que a de G '(ω = 1 rad / s) no local da injecção. As medições efectuadas em distâncias crescentes a partir do local de injecção foram encontrados a ter uma dimensão crescente de L *, bem como uma proporção crescente de G 'a G "(Figura 2C). O tamanho da região altamente degradada de ~ 2 mm de largura consistente com uma distância estimada de difusão de uma proteína com hidrodinâmico raio R _H = 1 nm (o peso molecular de dispase é 32,5 kDa) através de colagénio digerido com viscosidade de η = 10 ^{- 3} Pa · s a 37 ° C: , onde . Portanto, os resultados estão de acordo com o abrandamento esperado da matriz perto do local da injeção, e demonstrar a nossa capacidade de fazer medições precisas, localizadas de reologia da matriz.

Os dados representativos de um modelo de tumor 3D preparado de acordo com este protocolo é demonstrado na Figura 3. Dados vídeo foi recolhido em 19 locais fixos no interior da armação de colagénio, formando uma rede grosseira em torno do tumor (Figura 3A). Esta cota de dados foi combinado com valores calculados de G '(ω) para criar um mapa espacial do ECM rigidez (Figura 3B). Este mapa espacial revela claramente uma zona de rigidez aumentada imediatamente proximal ao esferóide tumor no dia 2, o que pode ser correlacionado com a deposição de colagénio IV, laminina um Vd de outros componentes de membrana basal depositados pelo próprio esferóide ^17,18,44,45, ou compressão local da ECM por esferóide expansão.

Crescimento do tumor e da matriz eventos de invasão foram monitorados ao longo de 4 dias. Duas regiões foram identificados como tendo ou não evidência de células invasivas na periferia do tumor, ou provas de invadir células pronunciado (Figura 3C). Medições da PTM foram tomadas em regiões 1 e 2, mais de 4 dias. Por volta do dia 4, houve uma diferença significativa no G '(reportada a 1 rad / s) entre as duas regiões (Figura 3D). Medidas em função da frequência de G 'e G "para as regiões 1 e 2 no dia 4 mostram abrandamento significativo da ECM em região 2, a região invasivo (Figura 3E). No dia 4 região duas exposições uma resposta viscoelástica como líquido, evidente pelo dimensionamento viscoso do enredo G "(Figura 3E).

Representante sub-ótimoresultados de erros experimentais e análise comuns são mostrados na Figura 4. Talvez a mais óbvia fonte de erro se situa na estabilidade da configuração em que a microscopia de vídeo é realizada. Se a bancada do laboratório é deslocada ou se há alguma outra fonte externa de vibração, as trajectórias de esferas pode ser artificialmente influenciada, o que resulta num desvio nos dados. Deriva faz com que o MSD para aumentar dramaticamente a alta lag vezes (Figura 4A), o que também faz com que o L '(ω) e G "(ω) valores calculados para aumentar acentuadamente a baixas frequências (Figura 4B). A deriva pode ser reduzido através do uso de um pneumático, ar amortecido bancada do laboratório, e, basta tomar cuidado para não bater a configuração enquanto vídeos estão sendo gravados. Além disso, a deriva pode ser removido durante o pós-processamento utilizando rotinas de software. Estas rotinas são adequados para a remoção de desvio que é de aproximadamente uniforme ao longo de um intervalo de tempo conhecido. Desvio irregular (talvez causadapor esbarrar no palco durante a aquisição de dados) é mais problemático. Por isso, é importante certificar-se de que a amostra permanece isolado mecanicamente a partir do ambiente durante a coleta de dados.

Outra fonte potencial de resultados obscuros vem de interpretação indevida de heterogeneidade da amostra. Embora a capacidade de observar e quantificar a heterogeneidade espacial em uma amostra é de fato um dos pontos fortes notáveis ​​da PTM ²⁶ (e algo que se perde na massa de reologia medições tradicionais), agrupamento indevido de aglomerados de trajetórias de sondas pode levar a conclusões incorretas. Dado que as mudanças na ECM rigidez relatados por esta metodologia são inerentemente heterogêneo, como é o material em si, em qualquer campo de visão, poderia haver algumas sondas traçadores que não são elasticamente confinados por fibras colágenas e, portanto, livres para explorar estocasticamente água maior -cheia poros (Figura 4C). Estas sondas "soltas" exposição mobility aproximadamente consistente com um ambiente puramente viscoso. Como os dados para todas as sondas é a média antes módulos viscoelásticos são calculados, tendo algumas sondas soltos em uma determinada região de amostragem (campo de visão) pode produzir freqüência parcelas dependentes de G * (ω) que variam descontroladamente (Figura 4D).

Calibração de software inadequada pode levar a erros durante a coleta e análise de vídeo. Durante a recolha de dados de vídeo, é importante observar o histograma de intensidade e ajustar o tempo de exposição para obter a maior gama dinâmica possível, assegurando que a imagem não fique saturada. A análise calcula posições centrais refinado para cada sonda tracer, integrando o valor da intensidade de cada pixel. Se a imagem está saturada, essa integração vai ser menos precisas devido a uma seção de 'flat top "do perfil de intensidade. Além disso, a calibração achado característica é um passo extremamente crítico para garantir resultados precisos. A escolha adequada dos parâmetros de seleção é primordial. Este processo tem sido descrito extensivamente por Crocker e Grier ^42, Savin e Doyle ^43, e outros.

Figura 1. Esquemática do procedimento experimental. (A) de tumor esferóides são formados em camas de agarose, e em seguida transferidas para uma matriz em 3D contendo sondas marcadoras incorporados. (B) dados de vídeo é feita em vários pontos no interior do poço da amostra, tanto adjacente ao e longe do esferóide tumor. (C) O movimento estocástico das sondas em cada um de vídeo são analisadas a fim de determinar as propriedades reológicas do local da matriz em cada ponto de amostra. Esses dados são compilados em um mapeamento espacial de ECM rigidez em todo o bem.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Verificação de medições. (A) Os componentes de L * (ω) são mostradas aqui. Os valores calculados de G '(ω) e G "(ω) utilizando PTM são muito semelhantes aos obtidos através de um reómetro de grandes quantidades. (B) 5 ul de dispase foi adicionada ao centro de um poço com um raio r = 8,5 mm contendo 1,0 mg / mL de colagénio para medir as variações espaciais na L * (ω). (C) Os valores calculados de G '(ω) e G "(ω) no local da injeção dispase, 1,5 mm do local, e 3 mm a partir do site. Além disso, uma medição de controlo foi realizada num poço contendo o mesmo gel de colagénio but sem tratamento dispase. Perto do local de tratamento com G '(ω) é menor do que L "(ω). Como o gel é amostrado mais longe do local de tratamento os valores de G '(ω) se tornar maior do que L "(ω), e a magnitude de L * (ω) aumenta. As medidas foram realizadas 2,5 horas após a injeção dispase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Quantificar mudanças na reologia ECM concomitante com o início da invasão matriz local. (A) O poço contendo uma PANC-1 esferóide 3D ​​é sondado em vários locais em todo o ECM colágeno em torno do tumor. (B) Coordenar os dados são combinados com calculated L '(ω) para cada local para produzir um mapa de ECM rigidez espacial. (C) O crescimento do tumor e comportamento invasão foram monitorados ao longo de 4 dias. Duas regiões foram identificados como tendo ou nenhuma interação com células invasoras (região 1, azul asterisco) ou interação forte com invadindo células ramificadas que espontaneamente a partir da grande massa principal multicelular esferóide (região 2, asterisco vermelho). Medições (D) reológicas foram realizadas em regiões 1 e 2, mais de 4 dias. No quarto dia, houve uma diferença significativa no G '(reportada a 1 rad / s) entre as duas regiões. (E) Freqüência medidas dependentes de G '(ω) e G "(ω) para as regiões 1 e 2 no dia 4 mostram abrandamento significativo do ECM na região 2, precisamente correlacionada com a presença de populações invasoras. G '(ω) e G "valores (ω), calculados usando um ajuste da lei de potência de dados MSD são mostrados como cheias e vazia res de pontopectivamente. No dia 4, região duas exposições uma resposta viscoelástica como líquido, como é evidente pelo dimensionamento viscoso do enredo G "(ω) ea ausência da linha de ajuste para G '(ω). Clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

Figura 4. Dados de resultados sub-óptimos, devido à deriva e interpretação incorreta de heterogeneidade ECM. (A) A MSD de uma sonda tracer confinado em um material complexo segue potência lei de escala <Δr ² (τ)> ~ ^τ α (0 ≤ α ≤ 1). Assim, os valores de MSD deve abordar um platô em longos tempos de atraso. Deriva na amostra pode eliminar artificialmente esse comportamento, leading para escalada valores MSD às vezes longas lag. (B) O intervalo de tempo longo deriva no MSD fará com que os valores de G '(ω) e G "(ω) a tornar-se significativamente errónea a frequências curtas. A deriva pode ser eliminado ou reduzido, quer por garantir que a amostra é isolado mecanicamente durante a coleta de dados ou usando rotinas de software para remover deriva durante a análise. (C) Mesmo em um pequeno campo de visão, duas variedades distintas de trajetórias de sondas podem estar presentes. Neste exemplo, a maioria das sondas estão confinados na matriz, mas algumas são 'solta' - as suas trajectórias são muito menos restrito. (D) A tentativa de interpretar os dados MSD tanto constrangido e sondas sem restrições, ao mesmo tempo, sem interpretação adequada da heterogeneidade da amostra vai confundir medidas de módulos viscoelásticos. favor click aqui para ver uma versão maior desta figura.

Neste protocolo, apresentamos uma estratégia robusta e amplamente aplicável para longitudinalmente rastreamento de alterações locais na ECM rigidez em modelos de tumores em 3D. Nós prevemos que esta metodologia poderia ser adotada por biólogos câncer e biofísicos interessadas em comportamento mechanosensitive implicados na remodelação da matriz durante o crescimento de tumores e processos de invasão. A quantificação precisa da cinética de degradação da matriz poderia ser particularmente útil para aqueles que estudam a atividade de metaloproteases de matriz, lisil oxidase ou outras espécies bioquímicas relevantes em modelos de tumores em 3D que estão diretamente ligados a remodelação da matriz. Além da aplicação de modelos de tumor 3D descrito aqui, pode-se imaginar ainda mais a implementação desta abordagem em conjunto com outros sistemas modelo doença em que a modificação de reologia da matriz ao longo do tempo desempenha um papel importante ^46,47. A utilidade deste método continua a ser melhorada através de uma melhoria do software que mais automáticoo e o processo e permitir o aumento estudos rendimento. Isto irá resultar em instantâneos cada vez mais pormenorizadas sobre a paisagem física de muitas amostras, em simultâneo, para o uso em formatos multi-poços.

Descrevemos aqui especificamente a implementação de passiva microrheology partícula de rastreamento em modelos de tumor em 3D, o que é bem adequado para a medição de resposta viscoelástica linear na gama de ~ dezenas de Pascal típicos de produtos comercialmente disponíveis da matriz extracelular (colagénio bovino, extractos EHS-tumorais ou scaffolds de nanofibras comerciais). A observação de estocástica, movimento accionado termicamente, mesmo com elevadas óptica abertura numérica para quantificar pequenos deslocamentos da sonda, é inerentemente limitadas ao regime linear destes ambientes ECM relativamente macios, mas os investigadores que desejam sondar materiais mais rígidos pode ser capaz de se adaptar este protocolo para uso com manipulações ativos via óptica ⁴⁸ ou magnético trapping ⁴⁹ de sondas. Since as pinças ópticas ou magnéticas sondar um único ponto dentro de uma amostra e que não afecta a integridade da amostra, estas técnicas podiam ser possivelmente incorporada no protocolo acima, para obter medições de amostras longitudinais mais rígidas.

É importante observar que outras forças geradas células pode também contribuir para os movimentos de sondas marcadoras em várias escalas de tempo. Por exemplo, durante a migração de células que ocorrem ao longo de horas e dias em cultura, grupos de sondas será empurrado e puxado devido aos movimentos das células e é de facto este movimento que é utilizado em microscopia de força de tração ^50,51. Os movimentos da sonda accionado termicamente que são analisados ​​para se obter dados microrheology ter lugar na ordem de segundos, uma escala de tempo claramente separável. Embora, também é verdade que a dinâmica mais lentas de tensões e deformações associadas às forças de tração podem contribuir para mudanças locais em reologia ^36, uma força desta imagem-based abordagem reside na capacidade de correlacionar as alterações visuais e reológicas na amostra. Por exemplo, nos resultados representativos na Figura 3, um evento de invasão da matriz e célula óbvio migração está correlacionada com uma mudança de G 'de cerca de quatro ordens de grandeza durante o tempo esta migração tem lugar.

O protocolo descrito aqui assume que os usuários têm acesso a um microscópio com um palco motorizado que fornece o posicionamento reprodutível da amostra. Laboratórios que não têm esta instrumentação ainda poderia fazer medições de ponto utilizando marcas ou outros sinais visuais do suporte com a amostra ou amostra para permitir medições repetidas no mesmo ponto, embora provavelmente seria difícil de alcançar a mesma reprodutibilidade de posicionamento, como mostrado na medições longitudinais representativos aqui. Para efeitos destes resultados representativos acima, posicionando no eixo z foi mantido aproximadamente constante. No entanto, o protocolo de could também ser alterado para incluir medidas adicionais ao longo do eixo z, a fim de criar um mapa 3D reológico da amostra. O método também pode ser modificado para utilizar uma confocal de varredura a laser ou uma técnica multiphoton para 3D seccionamento embora velocidades de digitalização iria impor uma limitação dos limites de frequência superiores acessíveis que pode ou não pode ser problemático para uma determinada aplicação.

Neste método, uma restrição de tempo significativo é imposta pela necessidade de devolver células vivas para a incubadora. Sem um time-lapse estação meteorológica gabinete para controlar a temperatura, umidade e níveis de CO _2, a imagem tempo de aquisição deve ser minimizado. Mesmo com o equipamento adequado, coleta de dados leva-se grandes quantidades de tempo e memória digital, que são ambos sujeitos a limitações práticas. Por exemplo, com microscópio e câmera utilizada neste estudo, que levaria cerca de 35 horas para levar os cerca de 4.000 vídeos necessário mapear um único bem em um 96Bem-placa usando uma lente objetiva de 100X sem espaço entre campos de visão. Esses fatores impõem restrições sobre o número de pontos de dados que pode ser realisticamente recolhidos. O nível de detalhe é, portanto, sujeito às restrições práticas impostas pelo tempo disponível para a coleta de dados, espaço de armazenamento de dados ea disponibilidade de uma habitação ambiental.

A capacidade de quantificar mudanças na ECM reologia poderia ser mais integradas ao lado de métodos baseados em imagem para quantificação da resposta terapêutica em modelos de tumores 3D ^17,18,52,53. O modelo de sistema de cultura 3D multi-well adotado em ambos os métodos sugere uma implementação paralela fornecendo correlação entre a resposta citotóxica e modificação do ambiente mecânico. Isso pode facilitar o desenvolvimento de novas estratégias que visam explicitamente o fenótipo mecânica ou elucidar o impacto da terapêutica existentes nesta capacidade. Essa visão pode ser diretamente relevantes para approaches para melhorar a entrega da droga através do estroma tumor rico em colágeno denso. Por exemplo, no contexto da ilustração representativa deste protocolo aqui apresentado com modelos in vitro de tumores pancreáticos, a avaliação da degradação da matriz seguinte intervenções podem ser utilizadas no rastreio de regimes de depleção do estroma, uma cada vez mais importante paradigma terapêutico para o cancro do pâncreas ^54.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Agradecemos a partilha de código aberto do MATLAB código de rastreamento de partículas fornecido por Maria Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), juntamente com o código anterior IDL e extensa documentação fornecida por John C. Crocker e Eric R. Weeks. Este trabalho foi possível graças ao financiamento do Instituto Nacional do Câncer (NCI / NIH), K99CA155045 e R00CA155045 (PI: JPC).