מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

microrheology מעקב חלקיק יכול להיות בשימוש למי שאינו הרסני לכמת ומרחבית מפת שינויים בתכונות מכאניות מטריצה ​​תאית במודלי גידול 3D.

Microenvironment המכני הוכח לפעול כרגולטור חיוני של גידול בצמיחת התנהגות ואיתות, אשר עצמו שופץ והותאם כחלק מסדרה של יחסי גומלין מורכבים, דו כיוונית mechanosensitive. בעוד שהפיתוח של מודלים 3D גידול ביולוגי רלוונטיים הקל מחקרים מכניסטית על ההשפעה של rheology מטריצה ​​על צמיחת גידול, הבעיה ההפוכה של שינויי מיפוי בסביבה מכאנית הנגרמת על ידי גידולים נותרת מאתגרת. כאן, אנו מתארים את יישום microrheology מעקב חלקיקים (PTM) בשילוב עם מודלים 3D של סרטן לבלב כחלק מגישה חזקה וברת קיימא עבור אורכי ניטור שינויים פיזיים בmicroenvironment הגידול, באתרם. המתודולוגיה שתוארה כאן משלבת מערכת של הכנה במבחנה המודלים 3D המשובץ במטריצה ​​תאית מודל פיגום (ECM) של סוג קולגן אני עם בדיקות שכותרתו fluorescently מפוזרות באופן אחיד לפוsition ומדידות microrheology תלוי זמן לאורך כל הדגימה. במבחנה גידולים הם מצופים ונחקרו בתנאים מקבילים באמצעות צלחות הדמיה multiwell. ציור על שיטות מבוססות, קטעי וידאו של תנועות חללית נותב הופכים באמצעות היחס כלליים סטוקס איינשטיין (GSER) לדווח מודולוס מורכב התדירות תלויה הגזירה viscoelastic, G (ω) *. מכיוון שגישה זו היא מבוסס הדמיה, אפיון מכאני ממופה גם הוא על שדות המרחבית מועבר אור גדולים לדווח בו זמנית שינויים איכותיים בגודל גידול 3D ופנוטיפ. נציג תוצאות מראים מנוגד תגובה מכאנית בתת אזורים הקשורים בשפלה מקומית-Induced פלישת מטריקס, כמו גם כיול מערכת, אימות נתונים מוצגים. תוצאות בלתי רצויות מטעויות ניסיוניות נפוצות ופתרון בעיות בנושאים אלה גם מוצגות. פורמט ציפוי תרבות 96 היטב 3D מיושם בפרוטוקול זה הוא גonducive למתאם של מדידות microrheology עם מבחני מיון טיפוליים או הדמיה מולקולרית כדי לקבל תובנות חדשות על השפעה של טיפולים או גירויים ביוכימיים בmicroenvironment המכני.

זה ברור מגוף הולך וגדל של ראיות בספרות שתאי הסרטן, כמו בתאי האפיתל של יונקים שאינם ממאירים, הם רגישים מאוד לתכונות מכאניות וbiophysical של מטריקס סביב תאי (ECM) ורכיבי המיקרו אחרים ^1-9. מחקרים מכניסטית אלגנטיים סיפקו תובנות לתוך התפקיד של קשיחות תאית כשותף איתות mechanosensitive מורכב המווסת את ההתנהגות ממארת צמיחה והמורפוגנזה ^2,3,10,11. עבודה זו כבר בהנחייתם בפרט על ידי הפיתוח של 3D במודלי גידול מבחנה שלשחזר ביולוגי ארכיטקטורת רקמה רלוונטית וניתן לגדל בחומרי פיגום עם מכניקה מתכונן וצלמו ידי מיקרוסקופיה אופטית ^12-19. עם זאת, הצד השני של הדו שיח הזה בין mechanoregulatory גידול והמיקרו, שדרכו תאי הסרטן בתורו לשנות את rheology של סביבתם האחר, נותר במידה מסוימתקשה יותר ללמוד. לדוגמא, במהלך תהליכי פלישה, תאים בפריפריה של גידול עשויים לעבור אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) ולהגדיל את הביטוי של metalloproteases המטריצה ​​(MMPs) שגורמים להשפלה מקומית של ^20-22 ECM, אשר בתורו משפיע mechanosensitive צמיחת התנהגות של תאים סרטניים הפרוקסימלי אחרים. באמצעות מגוון רחב של תהליכים ביוכימיים, תאים סרטניים לחייג הרף הקשיחות המקומית של הסביבה שלהם למעלה ולמטה כדי להתאים את התהליכים שונים בזמנים שונים. המתודולוגיה שתוארה כאן היא מונעת על ידי הצורך בכלים אנליטיים הלדווח על שינויים מקומיים בנוקשות והציות של ECM בצמיחה, שיכול להיות משולב עם מודלים גידול 3D וקורלציה אורכים עם שינויים ביוכימיים ופנוטיפי ללא הפסקת התרבות.

בחיפוש טכניקה מתאימה ליישום בהקשר זה, microrheology חלקיקי המעקב (PTM) מתגלה כמועמד חזק.בשיטה זו, הייתה חלוצה במקור על ידי מייסון וייץ ^23,24, משתמש בתנועה של בדיקות מעקב מוטבעות בנוזל מורכב לדווח מודולוס התדירות תלויה מורכב הגזירה viscoelastic, G * (ω) בקני מידת אורך מיקרון. גישה כללית זו פותחה עם וריאציות מרובות מתאימות ליישומים שונים בעניין, קולואידים, ביופיסיקה-מרוכז רכה ופיסיקה פולימר ^25-31. יש PTM יתרונות מסוימים ביחס לשיטות אחרות, שכן מונה המציין viscoelasticity המקומי מסופק על ידי וידאו הדמיה שאינה הרסנית של בדיקות מעקב ביוכימית פעילה המשולבות בעת הכנת התרבות ולהישאר במקום לאורך תקופות ממושכות של צמיחה. זאת בניגוד למדידות תקן זהב עם rheometer oscillatory גזירה בתפזורת, שבהכרח דורש הפסקת התרבות ומדווח rheology מקרוסקופית התפזורת של המדגם ולא מדידות נקודה בתוך microenvir גידול 3D המורכבonment. ואכן מספר מחקרים הדגימו את התועלת של פרשנות מדידות של תנועות חללית נותב או סביב תאים סרטניים או שאינו סרטניים למדוד עיוותים הקשורים לתא הגירה ^32, לחץ מכאני הנגרם על ידי אליפטית הרחבת ^33, rheology תאיים ^34,35, ו למפה לחצים מכאניים וזנים ברקמות מהונדסות ^36, ויחס בין גודל הנקבובית ומהירות פלישת ^37. טכניקות אחרות מתאימות לmicrorheology, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ניתן ליישם, אבל בעיקר לחיטוט נקודות במדגם השטח וגם עלולות להוות בעיות עקרות התרבות שתסבכנה מדידות אורך ^38.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מקיף הכולל שיטות לצמיחה של הספרואידים גידול 3D מתאימים להעברה לECM עם בדיקות ניאון משובצות לשיטות וידאו חלקיקי מעקב וניתוח לאופן מהימן מיפוי מרחבישינויים בmicrorheology לאורך זמן בתרבות. ביישום הנוכחי, מודלים 3D גידול גדלים בפורמט multiwell עם נוף לכיוון שילוב של מדידות microrheology עם מבחני אחרים מסורתיים (למשל, cytotoxicity) שהפורמט הזה הוא תורם ל. באיור נציג זה של במבחנה הספרואידים זה אנו המתודולוגיה תרבות 3D באמצעות PANC-1 תאים, שורת תאי סרטן לבלב הוקמה הידועה כדי ליצור הספרואידים ^39, אבל כל המדידות שתוארו במסמך זה הן החלים רחב ללמוד בגידולים מוצקים תוך שימוש במגוון של שורות תאים מתאים לתרבות 3D. מכיוון שהוא מבוססת הדמיה בשיטה זו המיסוד הוא אידיאלי לשיתוף רישום של נתונים microrheology ברזולוציה גבוהה עם שדות מועברים האור גדולים של דעה כי לדווח על שינויים בצמיחת תאים, הגירה ופנוטיפ. יישום PTM משולב עם מיקרוסקופ אור להעביר בדרך זו מניחה מיצוב לשחזור של Wh הבמה מיקרוסקופich הוא בדרך כלל זמין במיקרוסקופים ביולוגיים epifluorescence widefield המסחרי ממונעים. הפרוטוקול שפותח בהמשך יכול להיות מיושם עם כל מיקרוסקופ ביולוגי הקרינה אוטומטית מצויד באופן סביר. זוהי שיטה עתירת נתונים מיסודו, שדורשת רכישה של ג'יגה בייט של נתונים במיקרוסקופ וידאו דיגיטליים לעיבוד מקוון.

בפרוטוקול הבא, פרוטוקול 1 נוגע להכנה הראשונית של הספרואידים גידול אשר מתואר כאן על ידי שימוש בכיסוי agarose אבל יכול להיות תחליף עם מגוון רחב של שיטות אחרות כגון ירידה תלויה ^40, או תרבות סיבובית ⁴¹ טכניקות. פרוטוקול 2 מתאר את התהליך של הטבעת הספרואידים בפיגום קולגן אם כי לחלופין, במבחנה גידולי 3D יכולים להיות גדלו באנקפסולציה או הטבעה של תאי resuspended בECM ^12,15, ולא הספרואידים אינם חסיד מראש יצרו אחת. הפרוטוקולים הבאים מתארים נהלים לobtaining מדידות microrheology זמן נפתר על ידי הרכישה ועיבוד של נתונים במיקרוסקופ וידאו, בהתאמה. עיבוד נתונים מתואר באמצעות MATLAB, מה שהופך את השימוש בגרות קוד פתוח לPTM הבנוי על אלגוריתמים שתוארו במקור על ידי קרוקר וגריר ^42, שיש גם פותחו בהרחבה לפלטפורמות תוכנה שונות (ראה http://www.physics.emory.edu/ ~ שבועות / IDL /).

1. Spheroids גידול Culturing

1. מערבבים 10 מיליליטר של מים כיתה תרבית תאים עם 0.1 גרם של agarose כדי להשיג פתרון agarose 1%.
2. פתרון agarose חום לעיל 70 מעלות צלזיוס (בערך 14 שניות במיקרוגל רגיל או באמצעות צלחת חימום) לפני aliquoting 40 μl של פתרון agarose לתוך באר בצלחת 96 היטב.
3. דגירה צלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 ואילו קצירת תאים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות.
4. השתמש hemacytometer כדי לקבוע את הריכוז של תאים בתרחיף.
5. לדלל השעיה תא ל1,000 תאים / מיליליטר ולהוסיף דילול זה 100 μl הלמכיל גם מיטת agarose נרפאה.
6. מניחים את המדגם על שייקר לילה בחממה שנקבעה על 37 ° C ו 5% CO _2.
7. הסר מדגם מייקר ולהוסיף של תקשורת בתרבות תא 100 μl.
8. דגירה הספרואידים עד לקוטר רצוי. לדוגמא, לאחר 9 ימים, spheroid יהיה כ 450 מיקרומטר קוטר. במהלך תקופה זו, תקשורת צמיחה טרי ניתן להוסיף לבארות, אך יש להימנע משאיפה שכן זה יגרום להסרה של אליפטית.

2. הכנת spheroids גידול 3D המשובץ בECM

1. הכן את תחנת עבודה עם חומרים הדרושים בתוך הזרימה למינרית.
2. הכן תערובת מדוללת של 1 מיקרומטר בדיקות נותב-הותאם carboxylate קוטר ניאון על ידי הוספת בדיקות מניית 2 חלקים (מוצקי 2%) ל25 חלקי מים סטריליים.
3. הסר בקבוק 3.1 מ"ג / מיליליטר קולגן שור מהמקרר ומניח אותו על קרח.
4. Aliquot 125 μl של קולגן לתוך בקבוקון 2 מיליליטר ריק.
5. הוסף 50 μl של דילול פתרון בדיקה נותב לבקבוקון המכיל קולגן ובקצרה מערבולת להפיץ בדיקות.
6. הוספת 235 μl של תקשורת בתרבות התא המתאימה המכילה פנול אדום (שיצהיב) עבור נפח כולל של 410 מ"ל ובקצרה מערבולת לפני הסרת 205 מיליליטר (חצי מהנפח הכולל) ולמקם אותו בבקבוקון מיליליטר 2 חדש. 1 הבקבוקון יכיל אליפטית הגידול והבקבוקון 2 יהיה תערובת שליטה.
7. להוסיף ~ 2 μl של 1 M NaOH לבקבוקון 1 להביא את הפתרון בחזרה לpH הניטרלי (תקשורת ותרבות המכילה פנול אדום צריכה לחזור לאדום). שים לב שזה יגרום לתערובת כדי להתחיל בריפוי אם היא לא שמרה על קרח. בקצרה מערבולת לערבב, ולאחר מכן לחזור למדף קרח באופן מיידי.
   הערה: אליפטית הוא בקושי נראה לעין בלתי מזוינת, לאחר 9 ימים של התרבות והסרתה מהמיטה agarose היא משימה עדינה. שימוש במיקרוסקופ לנתיחה עשוי להיות מועיל עבור חלק מהמשתמשים. השמירה על שלמות אליפטית במהלך ההעברה היא בעל חשיבות עליונה.
8. באמצעות פיפטה קצה רחב פה, בעדינות להסיר 40 μl של מדיה מן הבאר מכילה אליפטית הגידול. לשמור על זה 40 μl בעת ביצוע השלב הבא.
9. בדקו היטב כדי לראות אם אליפטיתהוסר בשלב הקודם. אם זה היה, להוסיף μl 40 מכיל אליפטית לבקבוקון 1. אם לא, מקום 40 μl חזרה אל תוך הבאר וחזור על השלב הקודם.
10. בעדינות מערבב 1 יאל (לא להסתכן vortexing, זה עלול לגרום נזק לאליפטית) לפני העברת התערובת ב60 מנות μl לשלוש בארות נפרדות מצלחת 96 היטב. בדוק היטב כל אחד עם מיקרוסקופ לאחר הוספת תערובת כדי לקבוע שגם מכיל את אליפטית.
11. להוסיף ~ 2 μl 1 M NaOH ו40 μl של תקשורת בתרבות תא לבקבוקון 2 מערבולת לפני aliquotting 60 μl של תערובת זו לריקה גם בצלחת 96 היטב ותיוג כביקורת.
12. מניחים את הצלחת באינקובטור 37 C ° לרפא במשך שעה לפחות 1.

3. לבנות רשת של נקודות לדוגמא וקח את וידאו בכל נקודה

1. העבר את צלחת המדגם מן החממה לבמה מיקרוסקופ. לאפשר 10 דקות למדגם לequilibrate עם טמפרטורת החדר אם במה מחוממת אינה זמינה.
2. שים לב לדוגמא עם עדשות אובייקטיביות המופעלים נמוכות כדי לוודא שהוא שלם ומוכן להדמיה. לקבוע את מיקום הגידול בתוך הבאר.
3. תחליט כמה נקודות מדגם לקחת. בדרך כלל, 20 נקודות דגימה בכל טוב, שהופצו בטבעות קונצנטריות סביב אליפטית תפיק תוצאות מספקת מפורטות.
4. להזיז את הבמה לכל מיקום רצוי ולהשתמש בתוכנת מיקרוסקופ התממשקות כדי להקליט את קואורדינטות x ו-y (או רשומת קואורדינטות באופן ידני אם ממשק תוכנה אינו זמין).
5. לעבור את המיקרוסקופ לעדשה גבוהה מופעל על מטרה (בדרך כלל 100X), ובחר את קוביית המסנן המתאימה לגל העירור של בדיקות המעקב. השתמש ברשימה של נקודות שנוצרו בשלב 3.4 כדי לעבור לנקודה הראשונה ברשת.
6. התאם את המיקוד כדי למצוא את תחתית הבאר, ולאחר מכן להעביר עד למצוא שדה הראייה (FOV) המכיל כמה טראק בפוקוסאה בדיקות.
7. שים לב להיסטוגרמה האינטנסיביות ולהתאים את עוצמת החשיפה וזמן לתת הטווח הדינמי הגדול ביותר אפשרי, תוך הבטחה כי התמונה אינה הופכת להיות רווי.
8. השג רצף וידאו בקצב פריימים של 20-30 אלפיות שני לכל מסגרת (כ 800 מסגרות או 16-24 שניות באורך מומלץ לספק סטטיסטיקות מספיקות לחישוב MSD חזק מאוזנת עם צורך מזעור זמן רכישה בכל נקודת רשת מרחבית) ולשמור עם אמנה מתאימה. במהלך ההקלטה, אל תיגעו מיקרוסקופ או שולחן.
9. חזור על שלבים 3.6-3.9 עבור כל נקודת דגימה ברשת.
10. חזור על שלבים 3.3-3.10 לכל אחד גם בניסוי.

4. לנתח וידאו נתונים כדי לחשב מאפייני Rheological בכל נקודה לדוגמא

1. העתק את כל נתוני וידאו לתיקיית ניתוח (אולי במחשב אחר).
2. נתוני יבוא תמונה לתוך MATLAB או תוכנות ניתוח אחרות.
   איןTE: תיעוד נרחב לגבי הסט של רוטינות מעקב אחר חלקיקי MATLAB אימצו כאן הוא זמין בhttp://people.umass.edu/kilfoil. השימוש בפונקציה קוראת מותאם אישית לאוטומציה עיבוד של מספר קבצים בעמדות שונות מומלצת.
3. לכייל את התוכנה על ידי ניתוח מספר פריימים של וידאו כדי לקבוע כראוי פרמטרים בחירה ודחייה (גודל, bandpass, וכו ') לזיהוי עמדות מרכז בדיקה. רקע נרחב לצעדים חיוניים אלה מתואר על ידי קרוקר וגריר.
4. השתמש בתוכנה כדי לקבוע באופן אוטומטי כל עמדת בדיקה לכל מסגרות הווידאו ולאחר מכן לקשר את העמדות הללו למסלולים.
5. השתמש בנתוני המסלול כדי לחשב את התזוזה הממוצעת בריבוע (MSD) כפונקציה של זמן השהיה, להיות בטוח כדי להחיל את גורם כיול המרחבי המתאים (מיקרומטר לפיקסל) לעדשה הספציפית האובייקטיבית, כל binning פיקסל, וכו '(שבוצע בדרך כללבmeta-data).
6. חישוב * G (באמצעות ביחס סטוקס איינשטיין הכללי לקחו בחשבון את גבולות תחולתה של GSER למדגם מסוים ^24,28,43. לחלופין, משתמשים עשויים לרצות לפרש מאפייני ECM ישירות מMSD פשוט על ידי ההשוואה דרוג חוק החשמל, מישור ערכים, מדדים של הטרוגניות או פרמטרים אחרים.
7. חזור על שלבים 4.2 דרך 4.6 עבור כל שדה ראייה בניסוי.
8. שיתוף לרשום נתוני מיקום מצעד 3.4 עם modulii viscoelastic בתדר מסוים של עניין. בהתאם ליצרן של המיקרוסקופ בשימוש, ניתן להקל שלב זה על ידי שגרה מותאמת אישית אשר קוראת metadata מיקרוסקופ או עמדה ניתן נספרו הנתונים באופן ידני.
9. השתמש בפונקציות אינטרפולציה 3D כדי ליצור מפת rheology המרחבי של ECM.

כדי לוודא את תוקפו של G * מדידות (ω) בעמדות מקומיות בתוך microenvironment גידול מודל מורכב, שני ניסויי אימות ראשוניים בוצעו. ראשית, אנו ביקשנו לאמת את המדידות שלנו נגד "תקן הזהב" של rheometry הגזירה תנודתית בתפזורת. הכנו דגימות זהות של מטריצת הקולגן (ללא תאים) בריכוז של 1.0 קולגן מ"ג / מיליליטר. דגימות אלו נבדקו עם rheometer תפזורת (ת"א מכשירי AR-G2, באמצעות 40 מ"מ גיאומטריה צלחת מקבילה) ועל ידי PTM (באמצעות אותם פרמטרים כמו בכל פרוטוקול זה) והמדידות של G וכתוצאה מכך "(ω) ו-G" (ω ) הושוו (איור 2 א). הסכם מצוין נמצא בין שתי המדידות. שנית, כדי לבסס את היכולת של פרוטוקול זה כדי למדוד שינויי טעם rheology ECM הכנו 1.0 מ"ג / מיליליטר מטריצת קולגן וחרוזים נותב משובצים. המדגם טופל לאחר מכן עםזריקה מרוכזת של 5 dispase μl (איור 2), שמהירות מעכל קולגן. לאחר דוגרים במשך 3 שעות כדי לאפשר עיכול קולגן מקומי להתרחש, נתונים וידאו צולמו במרחקים שונים מאתר ההזרקה, ומדידות של G '(ω) ו-G "נעשה (ω) בכל מקרה ומקרה. בסדר הגודל של ה-G "(ω = rad / sec) 1 נמצא להיות גדול יותר מזה של ה-G '(ω = 1 rad / sec) באזור הזריקה. מדידות שבוצעו במרחקים הולך וגדל מאתר ההזרקה נמצאו יש סדר גודל הולך וגדל של G *, כמו גם יחס הולך וגדל של G "לז" (איור 2 ג). גודלו של האזור המושפל מאוד של ~ 2 מ"מ בקנה אחד עם מרחק משוער של דיפוזיה של חלבון עם _H = 1 ננומטר R רדיוס הידרודינמית (המשקל המולקולרי של dispase הוא 32.5 KDA) באמצעות קולגן מתעכל עם צמיגות של η = 10 ^{- 3} אבא · שניות על 37 מעלות צלזיוס: src "1.5in" = "/ files/ftp_upload/51302/51302eq1.jpg", שבו . לכן התוצאות מסכימים עם הריכוך הצפוי של מטריקס בסמוך לאתר ההזרקה, ולהפגין את היכולת שלנו לבצע מדידות מדויקות, מקומיות של rheology מטריצה.

נציגי נתונים ממודל גידול 3D הוכן על פי פרוטוקול זה מוצג באיור 3. נתוני וידאו נאסף ב19 מקומות קבועים בתוך פיגום קולגן, ויצרו רשת גסה סביב הגידול (איור 3 א). זה לתאם הנתונים בשילוב עם ערכים המחושבים של G '(ω) כדי ליצור מפה המרחבית של נוקשות ECM (איור 3 ב). מפה המרחבית זה מגלה בבירור אזור של קשיחות מוגברת מייד הפרוקסימלי לאליפטית הגידול ביום 2, אשר יכול להיות מתואמת עם התצהיר של קולגן IV, V lamininרכיבי קרום ד אחרים מרתף שהופקדו על ידי אליפטית עצמו ^17,18,44,45, או הדחיסה מקומית של ECM על ידי אליפטית מתרחב.

אירועי פלישת גידול ומטריקס היו במעקב במשך 4 ימים. שני אזורים זוהו כבעלי או אין עדות לתאים פולשניים בפריפריה הגידול, או ראיות בולטים של פלישת תאים (איור 3 ג). מדידות PTM נלקחו באזורי 1 ו -2 על פני 4 ימים. יום 4, לא היה הבדל משמעותי בסול "(דיווח בrad / sec 1) בין שני האזורים (איור 3D). מדידות תדר תלוי של G 'ו-G "לאזורי 1 ו -2 ביום 4 להראות ריכוך משמעותי של ECM באזור 2, האזור פולשנית (איור 3E). ביום 4 באזור שתי תערוכות תגובת נוזל דמוי viscoelastic, ניכרה על ידי שינוי גודל צמיג של עלילת G "(איור 3E).

נציג תת אופטימליתוצאות משגיאות ניסוי וניתוח משותפות מוצגות באיור 4. אולי המקור הברור ביותר של טעות נעוצה ביציבות של ההתקנה שבו מיקרוסקופיה וידאו מתבצעת. אם ספסל המעבדה הוא עקור או אם יש איזה מקור חיצוני אחר של רטט, מסלולי חרוז יכולים להיות מושפעים באופן מלאכותי, שתוצאתה להיסחף בנתונים. הסחף גורם MSD כדי להגדיל באופן דרמטי בזמנים גבוה בפיגור (איור 4 א) אשר גורם גם G '(ω) ו" ערכי G (ω) מחושבים כדי להגדיל באופן חד בתדרים נמוכים (איור 4). הסחף ניתן לצמצם באמצעות השימוש ב, ספסל מעבדה אוויר מרופד פנאומטי, ופשוט על ידי נזהר שלא להקפיץ את ההתקנה תוך קטעי וידאו מוקלטים. בנוסף, סחף עשוי להיות מוסר במהלך עיבוד פוסט באמצעות שגרות תוכנה. גר אלה מתאימים להסרת סחף שהם כ אחידים על פני פרק זמן ידוע. סחף לא יציב (שנגרם אוליעל ידי הקפצת הבמה במהלך רכישת נתונים) הוא בעייתי יותר. לכן, חשוב לוודא כי המדגם נשאר מבודד מכאני מהסביבה במהלך איסוף הנתונים.

מקור פוטנציאלי נוסף של תוצאות לא ברורות מגיע מפרשנות לא נכונה של הטרוגניות מדגם. למרות היכולת להתבונן ולכמת את ההטרוגניות המרחבית במדגם היא אכן אחת מנקודתי החוזק של PTM ציין ²⁶ (ומשהו שהולך לאיבוד במדידות rheology בתפזורת מסורתית), קיבוץ לא תקין של אשכולות של מסלולי בדיקה יכול להוביל למסקנות שגויות. בהתחשב בכך שהשינויים בקשיחות ECM שדווחו על ידי מתודולוגיה זו הם מטבע הטרוגנית, כפי שהוא החומר עצמו, בכל תחום נתון של נוף, יכולה להיות שיש כמה בדיקות מעקב שאינם מוגבלים elastically ידי סיבי הקולגן ובכך חופשי לחקור מים גדולים יותר stochastically מלא נקבוביות (איור 4C). מ 'תערוכת בדיקות "משוחררות" אלהobility כ עולה בקנה אחד עם סביבה טהורה צמיגה. מאז נתונים עבור כל הבדיקות הוא בממוצע לפני moduli viscoelastic מחושב, שיש כמה בדיקות רופפות באזור דגימה נתון (שדה הראייה) יכול לייצר מגרשים תלויים בתדירות של G (ω) * המשתנים בפראות (איור 4D).

כיול תוכנה לא נכון יכול להוביל לטעויות במהלך איסוף וניתוח וידאו. במהלך איסוף נתוני וידאו, חשוב להתבונן בהיסטוגרמה האינטנסיביות ולהתאים את זמן החשיפה כדי לתת הטווח הדינמי הגדול ביותר אפשרי, תוך הבטחה כי התמונה אינה הופכת להיות רווי. הניתוח מחשב את עמדות מרכז מעודן עבור כל בדיקה נותב על ידי שילוב ערך האינטנסיביות של כל פיקסל. אם התמונה רוויה, השילוב הזה יהיה פחות מדויק בשל סעיף "ראש שטוח" של פרופיל העצמה. בנוסף, כיול ממצא התכונה הוא צעד מאוד קריטי בהבטחת תוצאות מדויקות. בחירה נכונה של פרמטרים בחירה היא בעל חשיבות עליונה. תהליך זה תואר בהרחבה על ידי קרוקר וגריר ^42, סאבן ודויל ^43, ואחרים.

איור 1. סכמטי של ניסיוני נוהל. () הספרואידים גידול נוצרים על מיטות agarose, ולאחר מכן הועברו לתוך מטריצת 3D המכילה בדיקות נותב משובצות. (B) נתוני וידאו צולם במספר נקודות בתוך המדגם היטב, שניהם צמודים ולהרחק מאליפטית הגידול. (ג) התנועה האקראית של הבדיקות בכל סרטון הוא ניתח כדי לקבוע את מאפייני rheological המקומיים של מטריקס בכל נקודת מדגם. הנתונים אלה נערך למיפוי מרחבי של ECM נוקשות לאורך הבאר.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. אימות של מדידות. () הרכיבים של G (ω) * מוצגים כאן. הערכים המחושבים של G '(ω) ו-G "(ω) באמצעות PTM דומים מאוד לאלה שהושגו באמצעות rheometer בתפזורת. (ב) 5 μl של dispase התווסף למרכז גם עם r = 8.5 מ"מ רדיוס המכיל 1.0 מ"ג / מיליליטר קולגן כדי למדוד שינויים מרחביים בG (ω) *. (ג) ערכים מחושבים של G '(ω) ו-G "(ω) באתר של הזרקת dispase, 1.5 מ"מ מהאתר, ו3 מ"מ מהאתר. בנוסף, מדידת שליטה נעשתה הבמכילה גם את אותו ב ג'ל קולגןut ללא טיפול dispase. בסמוך לאתר הטיפול G '(ω) הוא קטן יותר מאשר G "(ω). כמו ג'ל ידגם נוסף מאתר טיפול הערכים של G "הפך (ω) גדול יותר מאשר G" (ω), וסדר הגודל של G * (ω) עולה. מדידות נלקחו 2.5 שעות לאחר הזרקת dispase. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. כימות שינויים במקביל rheology ECM עם תחילתה של פלישת מטריקס המקומית. () המכיל גם אליפטית 3D PANC-1 נחקר במקומות רבים ברחבי ECM קולגן המקיף את הגידול. (ב) לתאם הנתונים בשילוב עם גalculated G '(ω) עבור כל מיקום כדי לייצר מפת קשיחות ECM מרחבית. צמיחת גידול (C) ופלישת התנהגות היו במעקב במשך 4 ימים. שני אזורים זוהו כבעלי או ללא אינטראקציה עם תאים פולשים (אזור 1, כוכבית כחולה) או אינטראקציה כבדה עם פולשים לתאים שהסתעפו באופן ספונטני מהמסה הגדולה העיקרית תאית אליפטית (אזור 2, הכוכבית אדומה). מדידות (ד ') Rheological נלקחו באזורי 1 ו -2 על פני 4 ימים. ביום הרביעי, היה הבדל משמעותי בסול "(דיווח בrad / sec 1) בין שני האזורים. (ה) מדידות תדר תלויות של G '(ω) ו-G "(ω) לאזורי 1 ו -2 ביום 4 להראות ריכוך משמעותי של ECM באזור 2, דווקא בקורלציה עם הנוכחות של אוכלוסיות פולשנית. G '(ω) ו-G "ערכים (ω) מחושבים באמצעות חוק כוח לנכון נתונים MSD מוצגים כמלא וללא מילוי מיל נקודהpectively. בשתי תערוכות יום 4, אזור תגובת viscoelastic נוזל דמוי שבאה לידי ביטוי על ידי שינוי גודל צמיג של העלילה G "(ω) והעדרו של הקו המתאים לG '(ω). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4. נתונים מתוצאות תת אופטימליות בשל להיסחף ופרשנות לא נכונה של הטרוגניות ECM. () MSD של חללית נותב כלוא בחומר מורכב כדלקמן קנה מידה כוח החוק <Δr ² (τ)> ~ ^τ α (0 ≤ α ≤ 1). בהתאם לכך, ערכי MSD צריכים להתקרב לרמה בזמנים השהיה ארוכות. הסחף במדגם יכול באופן מלאכותי לחסל התנהגות, אני זהeading להסלמת ערכי MSD בזמנים השהיה ארוכים. (ב) להיסחף זמן השהייה הארוכה בMSD יגרום ערכים של G '(ω) ו-G "(ω) להפוך שגוי באופן משמעותי בתדרים קצרים. הסחף ניתן למנוע או מופחת או על ידי הבטחה כי המדגם מבודד מכאני במהלך איסוף הנתונים או על ידי שימוש בשגרת תוכנה כדי להסיר להיסחף במהלך הניתוח. (ג) אפילו בשדה קטן של נוף, שני סוגים שונים של מסלולי בדיקה עשויים להיות נוכחים. בדוגמא זו, רוב הבדיקות כלואות במטריצה, אבל מעטים הם "חופשיים" - המסלולים שלהם הם הרבה פחות מוגבל. (ד ') בניסיון לפרש את נתוני MSD משני מוגבלים ובדיקות בלתי מוגבלות באותו הזמן ללא פרשנות נכונה של הטרוגניות מדגם לבלבל מדידות של moduli viscoelastic. אנא CLICK כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בפרוטוקול זה אנו מציגים אסטרטגיה חזקה וישימה באופן נרחב לאורכי מעקב אחר שינויים מקומיים בקשיחות ECM במודלי גידול 3D. אנחנו מדמיינים שמתודולוגיה זו יכולה להיות מאומצת על ידי ביולוגים בסרטן וBiophysicists מתעניינים בהתנהגות mechanosensitive מעורבת בשיפוץ מטריקס במהלך גידול ותהליכי פלישה. כימות מדויק של קינטיקה השפלה המטריצה ​​יכול להיות בעל ערך במיוחד לאלה שלומדים את הפעילות של metalloproteases מטריקס, מונואמין lysyl או מיני יוכימיים רלוונטיים אחרים במודלי 3D גידול שקשור ישירות לשיפוץ מטריצה. מעבר ליישום מודלים גידול 3D שתואר כאן, אפשר עוד לדמיין את יישומה של גישה זו בשילוב עם מערכות מודל מחלה אחרות שבו שינוי של rheology מטריצה ​​לאורך זמן משחק תפקידים חשובים ^46,47. התועלת של שיטה זו ממשיכה להיות משופרת באמצעות שיפורי תוכנה שאוטומט נוסףדואר את התהליך ולאפשר למחקרי תפוקה מוגברות. זה יגרום תמונות מפורטות יותר ויותר של הנוף הפיזי של דגימות רבות, בו זמנית, לשימוש בפורמטים רב גם.

כאן אנו במיוחד לתאר את יישום microrheology פסיבי חלקיקי מעקב במודלי גידול 3D, שהוא גם מתאים למדידה של תגובת viscoelastic ליניארי בטווח של ~ עשרות פסקל טיפוסיים של מוצרי מטריצה ​​תאית זמינים מסחרי (קולגן, תמציות EHS גידול או פיגומי nanofiber מסחריים). התצפית של סטוכסטיים, התנועה מונעת על תרמית, אפילו עם עדשת צמצם מספרית גבוהה לכמת התקות בדיקה קטנות, מוגבלת מטבעו למשטר ליניארי של סביבות ECM הרכות יחסית אלה, אך חוקרים שרוצים לחקור חומרים קשיחים יותר עשויים להיות מסוגלים להתאים את הפרוטוקול לשימוש עם מניפולציות פעילים באמצעות השמנה אופטית ⁴⁸ או מגנטית ⁴⁹ של בדיקות. Sincדואר פינצטה האופטית או מגנטית לחקור נקודה בתוך מדגם יחידה ואינו משפיעה על השלמות של המדגם, טכניקות אלו יכולה להיות משולבות בתוך הפרוטוקול לעיל כדי להשיג מדידות אורך של דגימות נוקשה יותר.

חשוב לציין, כי כוחות שנוצרו תא אחרים עשויים גם לתרום לתנועות חללית נותב בסקלות זמן שונות. לדוגמא, במהלך נדידת תאים המתרחשת במהלך שעות וימים בתרבות, אשכולות של בדיקות יהיו דחף ומשכו בשל תנועות תא וזה אכן תנועה זו כי הוא מנוצל בכוח המתיחה מיקרוסקופית ^50,51. תנועות החללית מונעות על תרמית אשר ניתחו לקבל נתונים microrheology יתקיימו בסדר הגודל של שניות, זמן בקנה מידה ברורה להפרדה. למרות שזה גם נכון, כי הדינמיקה איטית יותר של מתחים ולחצים הקשורים בכוחות המתיחה יכולה לתרום לשינויים מקומיים בrheology ^36, כוחו של זה הדמיה-bגישת ased טמונה ביכולת לקשר בין שינויים חזותיים וrheological במדגם. לדוגמא בתוצאות הנציג באיור 3, אירוע הגירת פלישת מטריקס ותא ברור הוא מתואם עם שינוי בG 'של כמעט ארבעה סדרי הגודל בזמן נדידה זו מתרחשת.

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על ההנחה כי למשתמשים יש גישה למיקרוסקופ עם במה ממונעת המספקת מיצוב שחזור של המדגם. מעבדות שאין להם מכשור זה עדיין יכולה לבצע מדידות נקודה באמצעות סימנים או רמזים חזותיים אחרים במדגם או מדגם המנשא כדי לאפשר מדידות חוזרות ונשנות באותה הנקודה, אך יהיה זה סביר להניח שיהיה קשה להשיג את אותו שחזור במיקום כפי שמוצגים ב מדידות אורך נציג כאן. לענין תוצאות נציג אלה לעיל, מיקום בציר ה-z נשמר כ קבוע. עם זאת, הפרוטוקול could גם יתוקן לכלול מדידות נוספות לאורך ציר ה-z כדי ליצור מפת rheological 3D של המדגם. השיטה יכולה גם להיות שונה כדי לנצל לייזר confocal סריקה או טכניקות multiphoton ל3D חתך למרות מהירויות סריקה תטיל מגבלה על מגבלות התדר העליונות נגישות שעשויות או לא עשוי להיות בעייתי עבור יישום נתון.

בשיטה זו, אילוץ זמן משמעותי שהוטל על ידי הצורך בהחזרת תאי חיים לחממה. ללא מתחם תחנת מזג אוויר הזמן לשגות לשלוט על טמפרטורה, לחות, ו _-2 רמות CO, חייב להיות ממוזער זמן רכישת תמונה. אפילו עם הציוד המתאים, איסוף נתונים תופס כמויות גדולות של זמן וזיכרון דיגיטלי, אשר שניהם בכפופים למגבלות מעשיות. למשל, עם המיקרוסקופ ומצלמה ששמשה במחקר זה, שזה ייקח בערך 35 שעה לקחת את קטעי וידאו בערך 4,000 דרוש למפה טובה אחת על 96היטב צלחת באמצעות עדשה אובייקטיבית 100X ללא רווח בין שדות הראייה. גורמים אלה מטילים מגבלות על מספר נקודות הנתונים שיכולים באמת להיות שנאספו. רמת הפירוט היא, ולכן כפופה לאילוצים המעשיים שהוטלו על ידי זמן פנוי לאיסוף נתונים, שטח אחסון נתונים ואת הזמינות של דיור סביבתי.

היכולת לכמת שינויים בECM rheology יכולה להיות משולבת נוספת לצד שיטות המבוססת על הדמיה לכימות של תגובה טיפולית במודלי גידול 3D ^17,18,52,53. מערכת מרובה גם 3D מודל התרבות אימצה בשתי השיטות מציעה יישום מקביל מתן מתאם בין תגובה ציטוטוקסיות ושינוי של הסביבה מכאנית. זה יכול להקל על פיתוח של אסטרטגיות נוספות שבמפורש למקד את הפנוטיפ המכני או לברר את ההשפעה של תרופות קיימות בתפקיד זה. תובנה כזו יכולה להיות רלוונטית ישירות לpproaches כדי לשפר את אספקת סמים דרך stroma גידול קולגן עשיר הצפוף. לדוגמא, בהקשר של המחשת הנציג של פרוטוקול זה מוצג כאן עם במבחנה מודלים גידול בלבלב, ההערכה של הפחתת המטריצה ​​הבאה התערבויות יכולים לשמש בהקרנת משטרי דלדול סטרומה, הפרדיגמה טיפולית חשובה יותר ויותר עבור סרטן לבלב ^54.

The authors declare that they have no competing financial interests.

אנו בתודה להכיר שיתוף הקוד הפתוח של קוד מעקב של חלקיק MATLAB הניתן על ידי מריה Kilfoil (http://people.umass.edu/kilfoil/), יחד עם הקוד קודם לכן IDL ותיעוד מקיף הניתן על ידי ג 'ון ג קרוקר ואריק שבועות ר '. עבודה זו התאפשרה על ידי מימון מהמכון הלאומי לסרטן (NCI / NIH), K99CA155045 וR00CA155045 (PI: JPC).