قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

تتبع الجسيمات microrheology يمكن استخدامها لقياس غير المدمر والتغيرات في الخريطة مكانيا خارج الخلية مصفوفة الخواص الميكانيكية في نماذج ورم 3D.

وقد تبين المكروية الميكانيكية ليكون بمثابة منظم حاسمة للسلوك نمو الورم والإشارات، التي هي في حد ذاتها تشكيلها وتعديلها كجزء من مجموعة معقدة، والتفاعلات في اتجاهين mechanosensitive. في حين أن تطوير نماذج 3D بيولوجيا الورم ذات الصلة سهلت الدراسات الآلية على أثر مصفوفة الريولوجيا على نمو الورم، والمشكلة معكوس التغييرات رسم الخرائط في البيئة الميكانيكية الناجمة عن الأورام يظل تحديا. هنا، نحن تصف تنفيذ تتبع الجسيمات microrheology (PTM) بالتزامن مع نماذج 3D من سرطان البنكرياس كجزء من نهج قوية وقابلة للحياة لرصد التغيرات الجسدية طوليا في المكروية الورم، في الموقع. المنهجية الموصوفة هنا يدمج نظام إعداد نماذج 3D في المختبر جزءا لا يتجزأ من نموذج مصفوفة خارج الخلية (ECM) السقالة من النوع الأول الكولاجين مع تحقيقات fluorescently المسمى موزعة بشكل متجانس لحماماتsition والقياسات microrheology تعتمد على الوقت في جميع أنحاء العينة. ومطلي الأورام في المختبر وبحث في ظروف موازية باستخدام لوحات التصوير multiwell. بالاعتماد على الأساليب المتبعة، يتم تحويل أشرطة الفيديو من الحركات التحقيق التتبع عبر علاقة المعمم ستوكس اينشتاين (GSER) تقديم تقرير مجمع تعتمد على تردد معامل القص اللزجة، G (ω) *. لأن هذا النهج هو القائم على التصوير، ويتم تعيين توصيف الميكانيكية أيضا على حقول المكانية التي تنتقل عن طريق الضوء كبيرة أن يقدم تقريرا في وقت واحد تغييرات نوعية في 3D حجم الورم والنمط الظاهري. ، يتم عرض نتائج التحقق من صحة البيانات المتناقضة ممثل تظهر استجابة الميكانيكية في المناطق الفرعية المرتبطة المترجمة الناجم عن الغزو تدهور المصفوفة وكذلك نظام المعايرة. وتعرض أيضا نتائج غير مرغوب فيها من أخطاء التجريبية المشتركة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من هذه القضايا. ال 96 جيدا 3D شكل الطلاء ثقافة تنفيذها في هذا البروتوكول هو جonducive لارتباط القياسات microrheology مع المقايسات فحص العلاجية أو التصوير الجزيئي لاكتساب رؤى جديدة في تأثير العلاج أو المنبهات البيوكيميائية على المكروية الميكانيكية.

يبدو واضحا من مجموعة متزايدة من الأدلة في الأدب أن الخلايا السرطانية، كما هو الحال مع الخلايا الظهارية الثديية غير الخبيثة، هي حساسة للغاية إلى الخواص الميكانيكية والفيزيائية الحيوية المحيطة بها المصفوفة خارج الخلية (ECM) ومكونات أخرى المكروية ^1-9. وقد وفرت الدراسات الآلية أنيقة نظرة ثاقبة لدور صلابة خارج الخلية كشريك إشارات mechanosensitive المعقدة التي تنظم السلوك نمو خبيث والتشكل ^{2،3،10،11.} وقد تيسر هذا العمل ولا سيما من خلال تطوير نماذج 3D في المختبر أن الورم استعادة بيولوجيا هندسة الأنسجة ذات الصلة، ويمكن زراعتها في المواد السقالة مع الميكانيكا الانضباطي والتقط بواسطة المجهر الضوئي ^12-19. ومع ذلك، فإن الجانب الآخر من هذا الحوار mechanoregulatory بين الورم والمكروية، وسرطان الخلايا بدوره من خلالها تعديل الريولوجيا من محيطهم، لا يزال إلى حد ماأكثر صعوبة للدراسة. على سبيل المثال، أثناء عمليات الغزو، والخلايا في محيط الورم قد يخضع الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) وزيادة التعبير عن metalloproteases مصفوفة (تقوم ال MMPs) التي تسبب تدهور المحلية من ECM ^20-22، والذي بدوره يؤثر على سلوك نمو mechanosensitive من الخلايا السرطانية القريبة الأخرى. من خلال مجموعة متنوعة من العمليات البيوكيميائية، وسرطان الخلايا الهاتفي باستمرار صلابة بيئتهم المحلية صعودا وهبوطا لتناسب عمليات مختلفة في أوقات مختلفة. والدافع وراء هذه المنهجية الموصوفة هنا بسبب الحاجة إلى الأدوات التحليلية التي تبلغ عن التغيرات المحلية في صلابة والامتثال للECM خلال النمو، والتي يمكن دمجها مع نماذج 3D والورم المترابطة طوليا مع التغيرات البيوكيميائية والمظهرية دون إنهاء ثقافة.

في البحث عن الطريقة الصحيحة لتنفيذ في هذا السياق، microrheology الجسيمات تتبع (PTM) يظهر كمرشح قوي.هذا الأسلوب، رائدة في الأصل من قبل ميسون ويتز ^23،24، يستخدم حركة تحقيقات التتبع جزءا لا يتجزأ من السوائل المعقدة للإبلاغ عن معامل معقدة تعتمد على تردد اللزجة القص، G * (ω) في جداول طول ميكرون. وقد تم تطوير هذا النهج العام مع وجود اختلافات متعددة تناسب تطبيقات مختلفة في لينة مكثف المسألة، الغرويات، الفيزياء الحيوية والفيزياء البوليمر ^25-31. PTM له بعض المزايا النسبية لأساليب أخرى، حيث يتم تقديم قراءات من زوجية المحلية من خلال التصوير الفيديو غير مدمرة تحقيقات التتبع غير نشط كيميائيا التي أدرجت في وقت إعداد الثقافة وتبقى في مكانها على مدى فترات طويلة من النمو. هذا هو على النقيض من القياسات معيار الذهب مع القص متذبذبة مقياس غلفاني بكميات كبيرة، الأمر الذي يتطلب بالضرورة إنهاء ثقافة والتقارير الريولوجيا العيانية الأكبر من عينة بدلا من القياسات نقطة داخل مجمع microenvir الورم 3Donment. في الواقع عددا من الدراسات قد بينت فائدة تفسير قياسات حركات التتبع التحقيق في أو حول الخلايا السرطانية أو غير السرطانية لقياس التشوهات المرتبطة بالهجرة خلية ^32، إجهاد الناجم عن كروي توسيع ^{33، 34،35} الريولوجيا داخل الخلايا، و لرسم خريطة الضغوط الميكانيكية وهندسة الأنسجة سلالات في ^36، والعلاقة بين حجم المسام وسرعة الغزو ^37. تقنيات أخرى مناسبة لmicrorheology، مثل القوة الذرية المجهري (AFM) يمكن تنفيذها، ولكن في المقام الأول لبحث نقاط على سطح العينة وأيضا قد تشكل قضايا العقم الثقافة التي تعقد قياسات الطولية ^38.

هنا، نحن تصف بروتوكول شامل يشمل أساليب لنمو الورم 3D الكروية مناسبة لنقل في ECM مع تحقيقات الفلورسنت المدمجة للفيديو الجسيمات تتبع وتحليل أساليب لرسم خرائط موثوق المكانيةالتغييرات في microrheology على مر الزمن في الثقافة. في تنفيذ الحاضر، تزرع نماذج 3D الورم في شكل multiwell بهدف نحو إدماج قياسات microrheology مع المقايسات التقليدية الأخرى (على سبيل المثال، السمسة) هذا الشكل الذي يفضي إلى. في هذا التوضيح ممثل هذه المنهجية أننا الثقافة في المختبر باستخدام الأجسام الشبه الكروية 3D-1 PANC الخلايا، وهو خط خلية سرطان البنكرياس أنشئت المعروفة لتشكيل الأجسام الشبه الكروية ^39، ولكن جميع القياسات الموصوفة هنا تنطبق على نطاق واسع لدراسة الأورام الصلبة باستخدام مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا مناسبة لثقافة 3D. لأنه يستند أصلا إلى التصوير هذه الطريقة هي مناسبة بشكل مثالي لاشتراكهما تسجيل البيانات microrheology عالية الدقة مع الحقول التي تنتقل عن طريق الضوء كبير من الرأي القائل بأن التبليغ عن أي تغييرات في نمو الخلايا، والهجرة والنمط الظاهري. تنفيذ PTM متكاملة مع المجهر الضوئي المنقولة بهذه الطريقة يفترض تحديد المواقع استنساخه من ذوي الخوذات البيضاء مرحلة المجهرمعنوى يتوفر عادة على المجاهر البيولوجية widefield epifluorescence التجارية الآلية. بروتوكول تطوير أدناه يمكن تنفيذها مع أي المجهر البيولوجية مضان الآلي مجهزة بشكل معقول. هذا هو أسلوب كثيفة البيانات بطبيعتها، الأمر الذي يتطلب اكتساب غيغابايت من البيانات المجهري الفيديو الرقمية لمعالجة حاليا.

في بروتوكول التالية، بروتوكول 1 تنتمي إلى الإعداد الأولي من الأجسام الشبه الكروية الورم الذي يوصف هنا باستخدام تراكب على الاغاروز ولكن يمكن أن تكون بديلا مع مجموعة متنوعة من وسائل أخرى مثل شنقا انخفاض بنسبة ^{40، 41} أو الثقافة الدوارة التقنيات. يصف بروتوكول 2 عملية التضمين الكروية في سقالة الكولاجين على الرغم بدلا من ذلك، يمكن أن تزرع في المختبر الأورام 3D بواسطة التغليف أو تضمين الخلايا معلق في ECM ^12،15، بدلا من الأجسام الشبه الكروية غير ملتصقة واحدة شكلت من قبل. البروتوكولات اللاحقة تصف إجراءات سbtaining القياسات microrheology وقت حل من خلال الحصول على ومعالجة البيانات المجهري الفيديو، على التوالي. يوصف معالجة البيانات باستخدام MATLAB، والاستفادة من إجراءات مفتوحة المصدر لPTM مبنية على خوارزميات صفت في الأصل من قبل كروكر وجرير ^42، والتي قد وضعت أيضا على نطاق واسع لمنصات البرمجيات المختلفة (انظر http://www.physics.emory.edu/ ~ أسابيع / IDL /).

1. الأجسام الشبه الكروية التثقيف ورم

1. خلط 10 مل من الماء خلية ثقافة الصف مع 0.1 غرام من الاغاروز للحصول على حل الاغاروز 1٪.
2. الحرارة الحل الاغاروز إلى فوق 70 درجة مئوية (حوالي 14 ثانية في الميكروويف القياسية أو باستخدام لوحة التسخين) قبل aliquoting 40 ميكرولتر من الحل الاغاروز في بئر في لوحة 96 جيدا.
3. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل في حين حصاد الخلايا باستخدام التقنيات القياسية.
4. استخدام عدادة الكريات لتحديد تركيز الخلايا في التعليق.
5. تمييع تعليق الخلية إلى 1،000 خلية / مل وإضافة 100 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى البئر تحتوي على سرير الشفاء الاغاروز.
6. وضع عينة على شاكر بين عشية وضحاها في حاضنة تعيين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
7. إزالة عينة من شاكر وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
8. احتضان الكروية حتى يتم التوصل إلى القطر المطلوب. على سبيل المثال، وبعد 9 أيام، وهي ليرة سوريةheroid سيكون حوالي 450 ميكرون في القطر. خلال هذا الوقت، وسائط النمو الطازجة يمكن أن تضاف إلى الآبار ولكن ينبغي تجنب التطلع لأن هذا سيؤدي إلى إزالة كروي.

2. إعداد الأجسام الشبه الكروية جزءا لا يتجزأ من ورم 3D في ECM

1. إعداد محطة عمل مع المواد اللازمة داخل غطاء تدفق الصفحي.
2. إعداد خليط مخفف من المعدلة الكربوكسيل 1 ميكرون قطر تحقيقات التتبع الفلورسنت بإضافة تحقيقات الأسهم 2 أجزاء (2٪ مواد صلبة) إلى 25 أجزاء من الماء المعقم.
3. إزالة زجاجة من 3.1 ملغ / مل الكولاجين البقري من الثلاجة ووضعه على الجليد.
4. قسامة 125 ميكرولتر من الكولاجين إلى 2 مل قارورة فارغة.
5. إضافة 50 ميكرولتر من المخفف الحل التتبع التحقيق إلى القارورة التي تحتوي على الكولاجين ودوامة لفترة وجيزة لتوزيع تحقيقات.
6. إضافة 235 ميكرولتر من وسائل الإعلام المناسبة ثقافة الخلية التي تحتوي على الفينول الحمراء (والتي سوف تتحول الصفراء) لمجموع حجم 410 مل ودوامة لفترة وجيزة قبل إزالة 205 مل (نصف مجموع حجم) ووضعه في قارورة جديدة 2 مل. سوف قارورة تحتوي على 1 كروي الورم وسوف فيال 2 أن تكون مزيجا السيطرة.
7. إضافة ~ 2 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم M 1 إلى 1 فيال لتحقيق الحل إلى محايد الرقم الهيدروجيني (يجب سائل الإعلام والثقافة التي تحتوي على الفينول الأحمر العودة إلى اللون الأحمر). لاحظ أن هذا سوف يسبب الخليط لبدء علاج إذا لم يتم الاحتفاظ به على الجليد. دوامة لفترة وجيزة إلى المزيج، ثم العودة إلى رف الجليد على الفور.
   ملاحظة: كروي هو بالكاد مرئية للعين المجردة بعد 9 أيام من الثقافة وزواله من السرير الاغاروز مهمة حساسة. استخدام المجهر تشريح قد يكون من المفيد لبعض المستخدمين. الحفاظ على سلامة كروي أثناء النقل هو الهدف الأسمى.
8. باستخدام ماصة الحافة واسعة الفم، وإزالة بلطف 40 ميكرولتر من وسائل الاعلام من البئر الذي يحتوي على الورم كروي. الإبقاء على هذا 40 ميكرولتر أثناء إجراء الخطوة التالية.
9. تحقق البئر لمعرفة ما إذا كان كرويتمت إزالة في الخطوة السابقة. إذا كان، إضافة 40 ميكرولتر تحتوي كروي لفيال 1، وإذا لم يكن كذلك، ضع 40 ميكرولتر مرة أخرى إلى البئر وكرر الخطوة السابقة.
10. بلطف اثارة فيال 1 (لا خطر vortexing ل، فإنه قد يؤدي إلى تلف كروي) قبل نقل الخليط في 60 ميكرولتر في أجزاء منفصلة من ثلاثة آبار لوحة 96 جيدا. تفقد كل بئر مع المجهر بعد إضافة الخليط إلى تحديد والذي يحتوي أيضا كروي.
11. إضافة ~ 2 ميكرولتر 1 M هيدروكسيد الصوديوم و 40 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى فيال 2 ودوامة قبل aliquotting 60 ميكرولتر من هذا الخليط لبئر فارغة في لوحة 96 جيدا ووضع العلامات كمجموعة تحكم.
12. وضع لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية إلى علاج لمدة 1 ساعة على الأقل.

3. كونستركت شبكة من نقاط عينة وتأخذ شريط فيديو في كل نقطة

1. نقل لوحة عينة من الحاضنة إلى مرحلة المجهر. سماح 10 دقيقة للعينة لequilibrate مع درجة حرارة الغرفة إذا مرحلة ساخنة غير متوفر.
2. مراقبة عينة مع انخفاض العدسات الهدف بالطاقة للتأكد من انها سليمة وجاهزة للتصوير. تحديد موقف الورم داخل البئر.
3. تحديد كيفية العديد من نقاط العينة التي يجب اتخاذها. عادة، سوف 20 نقطة العينة في كل بئر، وزعت في حلقات متحدة المركز حول كروي نتائج مفصلة بشكل كاف.
4. نقل المرحلة إلى كل الموضع المطلوب واستخدام المجهر التواصل البرمجيات لتسجيل x و y الإحداثيات (أو إحداثيات سجل يدويا إذا تفاعل البرمجيات غير متوفرة).
5. التبديل المجهر لعدسة الهدف رفيع المستوى (عادة 100X)، وحدد المكعب مرشح المناسب لطول الموجة من الإثارة تحقيقات التتبع. استخدام قائمة من النقاط التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.4 للانتقال إلى أول نقطة في الشبكة.
6. ضبط التركيز للعثور على قاع البئر، ثم نقل ما يصل الى العثور على مجال الرؤية (فوف) التي تحتوي على العديد من تراك في التركيزإيه تحقيقات.
7. مراقبة الرسم البياني شدة وضبط شدة التعرض والوقت لإعطاء أعظم النطاق الديناميكي ممكن مع ضمان أن الصورة لا تصبح مشبعة.
8. الحصول على تسلسل الفيديو بمعدل الإطار من 20-30 ميللي ثانية لكل إطار (ما يقرب من 800 لقطة في الثانية أو 16-24 في طول ينصح لتوفير إحصاءات كافية عن الحساب MSD قوية متوازنة مع الحاجة إلى تقليل اكتساب الوقت في كل نقطة الشبكة المكاني) وحفظ مع اتفاقية المناسبة. أثناء التسجيل، لا تلمس المجهر أو الجدول.
9. كرر الخطوات من 3،6-3،9 لكل نقطة عينة في الشبكة.
10. كرر الخطوات 3،3-3،10 لكل بئر في التجربة.

4. تحليل البيانات والفيديو لحساب خصائص الريولوجية في كل نقطة عينة

1. نسخ كافة بيانات الفيديو إلى مجلد تحليل (ربما على كمبيوتر آخر).
2. استيراد بيانات الصورة في MATLAB أو برامج التحليل الأخرى.
   NOTE: وثائق واسعة النطاق بشأن مجموعة من الجسيمات MATLAB إجراءات تتبع اعتمدت هنا هو متاح في http://people.umass.edu/kilfoil . فمن المستحسن استخدام وظيفة الدعوة مخصصة لأتمتة معالجة ملفات متعددة في مواقع مختلفة.
3. معايرة البرمجيات من خلال تحليل عدة إطارات من الفيديو لتحديد بشكل مناسب الاختيار والرفض المعلمات (الحجم، ممر الموجة، الخ) لتحديد مواقع مركز التحقيق. يوصف خلفية واسعة لهذه الخطوات الحاسمة التي كتبها كروكر وجرير.
4. استخدام البرنامج لتحديد تلقائيا كل موقف دقق في جميع الأطر الفيديو ومن ثم ربط هذه المواقف في مسارات.
5. استخدام البيانات مسار لحساب متوسط ​​مربع الإزاحة (MSD) بوصفها وظيفة من الوقت الضائع، ويجري التأكد من تطبيق عامل المعايرة المكانية المناسبة (ميكرون لكل بكسل) للعدسة هدف محدد، أي binning بكسل، الخ (نفذت عادةفي البيانات الفوقية).
6. حساب G * (باستخدام المعمم علاقة ستوكس آينشتاين تؤخذ بعين الاعتبار حدود انطباق GSER عن معين عينة ^24،28،43. بدلا من ذلك، قد يرغب المستخدمين لتفسير خصائص ECM مباشرة من MSD ببساطة عن طريق المقارنة بين قانون السلطة التحجيم، الهضبة القيم والأرقام القياسية لعدم التجانس أو غيرها من المعالم.
7. كرر الخطوات من 4.2 خلال 4.6 لكل فوف في التجربة.
8. شارك في تسجيل البيانات الموقف من الخطوة 3.4 مع modulii اللزجة على تردد معين من الفائدة. اعتمادا على الشركة المصنعة للمجهر المستخدمة، وهذه الخطوة يمكن أن تيسره روتين مخصصة التي يقرأ البيانات الوصفية المجهر أو موقف البيانات يمكن جدولتها يدويا.
9. استخدام وظائف 3D الاستيفاء لتوليد خريطة الريولوجيا المكاني للECM.

للتحقق من صحة G * (ω) القياسات على مواقع محلية داخل المجمع المكروية نموذج الورم، أجريت تجربتين التحقق من صحة الأولية. أولا، وسعى للتحقق من صحة القياسات لدينا ضد "المعيار الذهبي" من الجزء الأكبر متذبذبة القص rheometry. نحن على استعداد عينات مماثلة من الكولاجين مصفوفة (بدون الخلايا) بتركيز 1.0 ملغ / مل الكولاجين. كما تم بحث هذه العينات مع مقياس غلفاني الأكبر (TA الأدوات AR-G2، وذلك باستخدام 40 مم موازية الهندسة لوحة) وPTM (باستخدام نفس المعلمات في جميع انحاء هذا البروتوكول) والقياسات الناتجة من G '(ω) وG "(ω وتمت مقارنة) (الشكل 2A). تم التوصل إلى اتفاق ممتازة بين القياسين. وثانيا، لإنشاء قدرة هذا البروتوكول لقياس التغيرات نقطة في ECM الريولوجيا نحن على استعداد ل1.0 ملغ / مل مصفوفة الكولاجين والخرز التتبع المضمنة. وبعد ذلك تعامل مع العينةحقن مركزية من 5 ميكرولتر dispase (الشكل 2B)، والذي يساعد على هضم بسرعة الكولاجين. بعد احتضان لمدة 3 ساعة للسماح المترجمة الكولاجين الهضم أن يحدث، واتخذ بيانات الفيديو على مسافات متفاوتة من موقع الحقن، وقياسات G '(ω) وG "(ω) تم إجراؤها في كل حالة. تم العثور على حجم G "(ω = 1 راد / ثانية) ليكون أكبر من G '(ω = 1 راد / ثانية) في موقع الحقن. تم العثور على القياسات التي اتخذت في زيادة المسافات من موقع الحقن لديك حجم متزايد من G *، فضلا عن نسبة متزايدة من G 'إلى G "(الشكل 2C). حجم المنطقة المتدهورة للغاية من ~ 2 مم يتسق مع مسافة تقدر ب نشرها من البروتين مع دائرة نصف قطرها الهيدروديناميكية R _H = 1 نانومتر (الوزن الجزيئي للdispase هو 32.5 كيلو دالتون) من خلال الكولاجين يتفاعل مع اللزوجة η = 10 ^{- 3} · باسكال ثانية في 37 ° C: ، حيث . وبالتالي فإن النتائج تتفق مع تليين المتوقعة للمصفوفة قرب موقع الحقن، وإثبات قدرتنا على جعل دقيقة، وقياسات المترجمة من مصفوفة الريولوجيا.

وأظهرت بيانات تمثيلية من نموذج الورم 3D أعدت وفقا لهذا البروتوكول في الشكل 3. وقد تم جمع بيانات الفيديو في 19 مواقع ثابتة داخل سقالة الكولاجين، وتشكيل شبكة الخام حول الورم (الشكل 3A). هذا تنسيق البيانات وجنبا إلى جنب مع القيم المحسوبة لG '(ω) لإنشاء الخريطة المكانية من صلابة ECM (الشكل 3B). هذه الخريطة المكانية يكشف بوضوح منطقة صلابة زاد الداني على الفور إلى كروي الورم في يوم 2، والتي يمكن أن تكون مرتبطة مع ترسب الكولاجين IV، V laminin وغيرها من مكونات الغشاء القاعدي د أودعتها كروي نفسها ^{17،18،44،45،} أو ضغط المحلي من ECM التي كتبها كروي في التوسع.

تم رصد نمو الورم ومصفوفة الأحداث الغزو أكثر من 4 أيام. وقد تم تحديد منطقتين بأنها إما لا يوجد دليل على الخلايا الغازية في محيط الورم، أو الأدلة وضوحا من غزو الخلايا (الشكل 3C). وقد أخذت مقاييس PTM في مناطق 1 و 2 على مدى 4 أيام. بعد يوم 4، وكان هناك اختلاف كبير في G '(ذكرت في 1 راد / ثانية) بين المنطقتين (الشكل 3D). القياسات التي تعتمد على تردد G 'وG "لمناطق 1 و 2 في يوم 4 تظهر تليين كبير من ECM في المنطقة 2 والمنطقة الغازية (الشكل 3E). في يوم 4 المنطقة معرضين استجابة اللزجة مثل السائل، واضح من التحجيم لزجة من "مؤامرة G (الشكل 3E).

ممثل دون المستوى الأمثلوتظهر النتائج من الأخطاء التجريبية والتحليل المشترك في الشكل 4. ولعل الأكثر وضوحا من مصدر الخطأ يكمن في استقرار الإعداد التي يتم تنفيذ المجهري الفيديو. إذا النازحين مقاعد البدلاء المختبر أو إذا كان هناك بعض المصادر الخارجية الأخرى من الاهتزاز، ومسارات حبة يمكن أن تتأثر بشكل مصطنع، مما يؤدي الى الانحراف في البيانات. تسبب الانجراف في MSD لزيادة كبيرة في بعض الأحيان تأخر عالية (الشكل 4A) والذي يسبب أيضا G '(ω) وG "(ω) القيم المحسوبة لزيادة حادة في الترددات المنخفضة (الشكل 4B). ويمكن تخفيض الانجراف من خلال استخدام الهوائية، والهواء خففت مختبر مقاعد البدلاء، وببساطة مع الحرص على عدم عثرة الإعداد بينما يتم تسجيل مقاطع الفيديو. بالإضافة إلى ذلك، قد تتم إزالة الانجراف أثناء معالجة آخر باستخدام إجراءات البرنامج. هذه الإجراءات هي مناسبة لإزالة الانجراف وهو ما يقرب موحدة على مدى فترة زمنية معروفة. الانجراف عدم انتظام (ربما تسبببواسطة الاهتزاز أثناء مرحلة الحصول على البيانات) هو أكثر إشكالية. ولذلك فمن المهم للتأكد من أن العينة لا تزال معزولة ميكانيكيا من البيئة أثناء جمع البيانات.

آخر مصدرا محتملا للنتائج غير واضحة يأتي من تفسير غير لائق من العينة عدم التجانس. على الرغم من أن القدرة على مراقبة وقياس التباين المكاني في عينة هو في الواقع واحدة من نقاط القوة لاحظت من PTM ²⁶ (والتي فقدت شيئا في قياسات الريولوجيا السائبة التقليدية)، والتجمع غير لائق من مجموعات من مسارات التحقيق يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات غير صحيحة. بالنظر إلى أن التغيرات في صلابة ECM ذكرت من قبل هذه المنهجية هي بطبيعتها غير متجانسة، كما هو المادة نفسها، في أي مجال معين من الرأي، يمكن أن يكون هناك عدد قليل من تحقيقات التتبع التي لا تقتصر مطاطيا بواسطة ألياف الكولاجين وبالتالي تتردد في استكشاف المياه عشوائيا أكبر المسام (الشكل 4C) مملوءة. هذه التحقيقات "فضفاضة" المعرض مobility يتفق تقريبا مع بيئة لزجة بحتة. منذ وبلغ متوسط ​​البيانات لجميع تحقيقات قبل تحسب معاملات الرجوعية اللزجة، وجود عدد قليل من تحقيقات فضفاضة في المنطقة أخذ العينات معين (مجال الرؤية) يمكن أن تنتج المؤامرات التي تعتمد تردد G (ω) * التي تختلف بصورة عشوائية (الشكل 4D).

غير لائق معايرة البرمجيات يمكن أن يؤدي إلى أخطاء أثناء جمع الفيديو وتحليلها. خلال جمع البيانات والفيديو، فمن المهم أن نلاحظ الرسم البياني شدة وضبط الوقت التعرض لإعطاء أكبر مجموعة ديناميكية ممكن مع ضمان أن الصورة لا تصبح مشبعة. تحليل مواقف يحسب مركز المكرر لكل التحقيق التتبع من خلال دمج قيمة كثافة كل بيكسل. إذا المشبعة الصورة، وهذا التكامل يكون أقل دقة بسبب مقطع 'رأس مسطح "من ملف كثافة. بالإضافة إلى ذلك، معايرة ميزة الاكتشاف هو خطوة حاسمة للغاية في ضمان نتائج دقيقة. اختيار السليم لاختيار المعلمات هو الهدف الأسمى. وقد وصفت هذه العملية على نطاق واسع من قبل كروكر وجرير ^42، المقتصد ودويل ^43، وغيرها.

الشكل 1. تخطيطي الإجراءات التجريبية. (A) تتشكل الأجسام الشبه الكروية ورم على أسرة الاغاروز، ومن ثم نقلها إلى مصفوفة 3D تحتوي على تحقيقات التتبع المضمنة. (ب) يتم أخذ بيانات الفيديو في عدة نقاط داخل العينة جيدا، سواء المجاورة لوبعيدا عن الورم كروي. (C) ويتم تحليل الحركة العشوائية للتحقيقات في كل فيديو من أجل تحديد الخصائص الريولوجية المحلي للمصفوفة في كل نقطة العينة. يتم تصنيف هذه البيانات في رسم الخرائط المساحية من ECM تصلب في جميع أنحاء البئر.ad/51302/51302fig1highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. التحقق من القياسات. (A) وتظهر مكونات G (ω) * هنا. القيم المحسوبة لG '(ω) وG "(ω) باستخدام PTM هي مشابهة جدا لتلك التي تم الحصول عليها عن طريق مقياس غلفاني السائبة. (ب) تم إضافة 5 ميكرولتر من dispase إلى مركز بئر مع دائرة نصف قطرها ص = 8.5 ملم تحتوي على 1.0 ملغ / مل الكولاجين لقياس التغيرات المكانية في G (ω) *. (C) من القيم المحسوبة G '(ω) وG "(ω) في موقع الحقن dispase، 1.5 ملم من موقع، و 3 ملم من الموقع. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء قياس التحكم في بئر تحتوي على نفس هلام الكولاجين بحزب التحرير مع عدم وجود العلاج dispase. بالقرب من موقع العلاج G '(ω) هو (ω) أصغر من G ". كما يتم أخذ عينات من هلام مزيد من موقع العلاج قيم G '(ω) أصبح أكبر من G "(ω)، وحجم G * (ω) يزيد. وقد أخذت مقاييس 2.5 ساعة بعد الحقن dispase. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. تحديد مقدار التغيرات في ECM الريولوجيا يصاحب ذلك مع بداية الغزو مصفوفة المحلية. (A) وكذلك يحتوي على PANC-1 كروي 3D يتم بحثها في مواقع متعددة في جميع أنحاء ECM الكولاجين المحيطة الورم. يتم الجمع بين (B) تنسيق البيانات مع جalculated G '(ω) لكل موقع لإنتاج المكانية خريطة ECM صلابة. تم رصد (C) نمو الورم والسلوك الغزو أكثر من 4 أيام. وقد تم تحديد منطقتين وجود أي إما التفاعل مع الخلايا الغازية (المنطقة 1، النجمة الزرقاء) أو التفاعل مع الثقيلة غزو الخلايا التي تشعبت بشكل عفوي الخروج من كتلة كبيرة متعددة الخلايا الأولية كروي (المنطقة 2، النجمة الحمراء). وقد أخذت مقاييس (D) الريولوجية في مناطق 1 و 2 على مدى 4 أيام. قبل اليوم الرابع، كان هناك اختلاف كبير في G '(ذكرت في 1 راد / ثانية) بين المنطقتين. (E) تردد قياسات تعتمد على G '(ω) وG "(ω) للمناطق 1 و 2 في يوم 4 تظهر تليين كبير من ECM في المنطقة 2، ترتبط على وجه التحديد مع وجود السكان الغازية. G '(ω) وG "وتظهر (ω) القيم المحسوبة باستخدام القوة لصالح القانون البيانات MSD كما شغل والدقة شاغرة نقطةpectively. في يوم 4، المنطقة معرضين استجابة مثل السائلة اللزجة كما هو واضح من خلال توسيع نطاق لزج من G "(ω) المؤامرة وعدم وجود خط يصلح لG '(ω). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. البيانات من نتائج دون المستوى الأمثل وذلك بسبب الانجراف وتفسير غير صحيح من ECM عدم التجانس. (A) وMSD من تحقيق التتبع محصورة في المواد المعقدة يلي قوة القانون التحجيم <Δr ² (τ)> ~ ^τ α (0 ≤ α ≤ 1). وفقا لذلك، ينبغي القيم MSD الاقتراب من الهضبة في بعض الأحيان تأخر طويلا. الانجراف في العينة يمكن القضاء على هذه المشكلة بشكل مصطنع، لeading إلى تصاعد القيم MSD في بعض الأحيان تأخر طويلا. (ب) فارق زمني طويل الوقت الانجراف في MSD سوف يتسبب في قيم G '(ω) وG "(ω) لتصبح خاطئة بشكل كبير على ترددات قصيرة. يمكن القضاء الانجراف أو تخفيضها إما عن طريق ضمان أن يتم عزل عينة ميكانيكيا خلال جمع البيانات أو باستخدام إجراءات البرنامج لإزالة الانجراف خلال التحليل. (C) وحتى في حقل صغير للعرض، نوعين متميزين من مسارات التحقيق قد تكون موجودة. في هذا المثال، فإن معظم تحقيقات تنحصر في المصفوفة، ولكن قليلة هي "فضفاضة" - مساراتها هي أقل تقييدا ​​من ذلك بكثير. (D) محاولة تفسير البيانات MSD من كلا مقيدة وسوف تحقيقات غير المقيدة في نفس الوقت دون تفسير السليم للعينة التجانس نخلط قياسات معاملات الرجوعية اللزجة. الرجاء المبادرة القطريةCK هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذا البروتوكول نقدم استراتيجية قوية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لتتبع التغيرات المحلية طوليا في ECM صلابة في نماذج ورم 3D. ونحن نتصور أن هذه المنهجية يمكن أن تعتمدها علماء الأحياء السرطان وفيزيولوجيون المهتمين في السلوك mechanosensitive المتورطين في مصفوفة إعادة عرض خلال نمو الورم وعمليات الغزو. الكمي الدقيق للمصفوفة حركية تدهور يمكن أن تكون ذات قيمة خاصة لأولئك الذين يدرسون نشاط metalloproteases المصفوفة، الليزيل أوكسيديز أو الأنواع الكيميائية الحيوية الأخرى ذات الصلة في نماذج ورم 3D التي ترتبط مباشرة إلى مصفوفة إعادة عرض. ما وراء تطبيق لنماذج 3D الورم وصفها هنا، يمكن للمرء أن يتصور مزيد من تنفيذ هذا النهج بالاشتراك مع أنظمة أخرى نموذج المرض الذي تعديل مصفوفة الريولوجيا مع مرور الوقت يلعب دورا هاما ^46،47. تواصل فائدة هذه الطريقة إلى تعزيز من خلال إدخال تحسينات البرمجيات التي مزيد الآليالبريد العملية وتتيح زيادة الإنتاجية الدراسات. وسوف يؤدي هذا في لقطات تفصيلية على نحو متزايد من المناظر الطبيعية المادية للكثير من العينات، في وقت واحد، لاستخدامها في صيغ متعددة جيدا.

نحن هنا تصف على وجه التحديد تنفيذ السلبي microrheology الجسيمات تتبع في نماذج ورم 3D، والتي هي مناسبة تماما لقياس استجابة اللزجة الخطية في مجموعة من ~ عشرات باسكال نموذجية من المنتجات المتاحة تجاريا المصفوفة خارج الخلية (الكولاجين البقري وعصائر الصحة والسلامة للورم أو السقالات nanofiber التجارية). مراقبة مؤشر ستوكاستيك، والحركة مدفوعة حراريا، حتى مع ارتفاع البصريات الفتحة العددية لقياس التشريد مسبار صغير، يقتصر أصلا للنظام الخطي من هذه البيئات ECM لينة نسبيا، ولكن المحققين رغبة منها في تحقيق مزيد من المواد الجامدة قد تكون قادرة على التكيف مع هذا البروتوكول للاستخدام مع معالجات النشطة عبر البصرية ⁴⁸ أو المغناطيسي محاصرة ⁴⁹ من تحقيقات. سينكه ملاقط بصرية أو المغناطيسية تحقيق نقطة واحدة ضمن عينة ولا تؤثر على سلامة العينة، ربما يمكن أن تدمج هذه التقنيات في البروتوكول أعلاه للحصول على قياسات الطولية من عينات أكثر جمودا.

من المهم أن نلاحظ أن القوات خلية أخرى ولدت قد تسهم أيضا في الحركات التحقيق التتبع على نطاقات زمنية مختلفة. على سبيل المثال، أثناء الهجرة الخلية التي تحدث على مدار ساعات وأيام في الثقافة، وسيتم دفع مجموعات من تحقيقات وسحبت بسبب الحركات الخلية وهذا هو في الواقع الحركة التي يتم استخدامها في قوة الجر المجهري ^50،51. الحركات التحقيق مدفوعة حراريا التي يتم تحليلها للحصول على بيانات microrheology تتم بناء على أمر من ثانية، وهو المقياس الزمني للفصل بشكل واضح. في حين أنه من الصحيح أيضا أن ديناميات أبطأ من الضغوط والتوترات المرتبطة مع قوات الجر يمكن أن تساهم في التغيرات المحلية في الريولوجيا ^36، وقوة هذا التصوير بنهج ASED يكمن في القدرة على ربط التغيرات البصرية والانسيابية في العينة. على سبيل المثال في نتائج ممثلة في الشكل 3، ويرتبط هذا الحدث الغزو مصفوفة الخلايا والهجرة واضحة مع تغيير في G 'ما يقرب من أربعة أوامر من حجم خلال فترة هذه الهجرة تأخذ مكان.

بروتوكول الموصوفة هنا يفترض أن يكون لدى المستخدمين الوصول إلى المجهر مع مرحلة الآلية التي توفر المواقع استنساخه من العينة. المختبرات التي لا تملك هذه الأجهزة مازالت قادرة على تحديد قياسات نقطة استخدام علامات أو الإشارات البصرية الأخرى في العينة أو عينة الناقل للسماح القياسات المتكررة في نفس النقطة، على الرغم من أنه من المرجح أن يكون من الصعب تحقيق نفس استنساخ في تحديد المواقع كما هو مبين في قياسات الطولية ممثل هنا. لأبقى أغراض هذه النتائج ممثل أعلاه، وتحديد المواقع على المحور Z ثابتة تقريبا. ومع ذلك، فإن فصول التوجيه الجامعي بروتوكولكما أن يعدل دينار لتشمل قياسات إضافية على طول محور ض من أجل إنشاء خريطة 3D الريولوجية من العينة. ويمكن أيضا أن يتم تعديل طريقة للاستفادة من متحد البؤر المسح بالليزر أو تقنيات multiphoton ل 3D باجتزاء الرغم من سرعات المسح أن فرض قيود على حدود التردد العلوي الوصول إليها قد تكون أو لا تكون إشكالية لتطبيق معين.

في هذه الطريقة، يتم فرض القيود وقتا كبيرا من ضرورة العودة الخلايا الحية إلى الحاضنة. دون الوقت الفاصل بين محطة الطقس الضميمة للسيطرة على درجة الحرارة، والرطوبة، ومستويات ثاني أكسيد الكربون _2، ويجب أن يكون الحد الأدنى الصورة اكتساب الوقت. حتى مع المعدات المناسبة، وجمع البيانات يستغرق فترة تصل كميات كبيرة من الوقت والذاكرة الرقمية، وكلاهما يخضع لقيود العملية. على سبيل المثال، مع المجهر والكاميرا المستخدمة في هذه الدراسة، ان الامر سيستغرق ما يقرب من 35 ساعة لاتخاذ ما يقرب من 4،000 أشرطة الفيديو اللازمة لتعيين بئر واحد على 96جيدا لوحة باستخدام عدسة الهدف 100X مع عدم وجود مسافة بين الحقول للعرض. هذه العوامل تفرض القيود على عدد من نقاط البيانات التي يمكن واقعيا أن يتم جمعها. مستوى التفصيل هو، وبالتالي تخضع لقيود تفرضها العملية الوقت المتاح لجمع البيانات، ومساحة تخزين البيانات وتوافر المساكن البيئية.

القدرة على قياس التغيرات في ECM الريولوجيا يمكن أن تكون متكاملة إلى جانب مزيد من الأساليب القائمة على التصوير لتقدير الاستجابة العلاجية في نماذج ورم 3D ^{17،18،52،53.} نموذج متعدد جيدا نظام 3D الثقافة اعتمدت في كل من يشير إلى وجود أساليب التنفيذ المتوازي توفير الارتباط بين استجابة السامة للخلايا وتعديل البيئة الميكانيكية. هذا يمكن أن يسهل وضع استراتيجيات كذلك أن تستهدف صراحة النمط الظاهري الميكانيكية أو توضيح تأثير العلاجات الموجودة في هذه القدرة. مثل هذه البصيرة يمكن أن تكون ذات صلة مباشرة لpproaches لتعزيز تسليم المخدرات من خلال كثافة الكولاجين الغنية الورم سدى. على سبيل المثال، في سياق التوضيح ممثل هذا البروتوكول المقدمة هنا في المختبر مع نماذج ورم البنكرياس، وتقييم تدهور المصفوفة يمكن استخدامها في فحص نظم التدخلات استنزاف اللحمية، وهو نموذج متزايد الأهمية العلاجية لسرطان البنكرياس ⁵⁴ التالية.

The authors declare that they have no competing financial interests.

نحن نعترف بامتنان تقاسم المصادر المفتوحة من MATLAB تتبع الجسيمات رمز تقدمها ماريا Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ )، جنبا إلى جنب مع رمز IDL في وقت سابق وثائق واسعة النطاق التي تقدمها جون كروكر واريك أسابيع R.. وقدم هذا العمل ممكن بتمويل من المعهد الوطني للسرطان (لجنة التحقيق الوطنية / NIH)، وK99CA155045 R00CA155045 (PI: JPC).