Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

Microrheology de partículas de seguimiento se puede utilizar para cuantificar de forma no destructiva y espacialmente mapa cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos de tumores en 3D.

La mecánica microambiente se ha demostrado que actúa como un regulador crucial del comportamiento de crecimiento del tumor y de señalización, que es en sí remodelado y modificadas como parte de un conjunto de, interacciones de dos vías mechanosensitive complejos. Si bien el desarrollo de modelos de tumores en 3D biológicamente relevantes han facilitado estudios mecánicos sobre el impacto de la reología de la matriz en el crecimiento del tumor, el problema inverso de la cartografía de los cambios en el entorno mecánica inducida por tumores sigue siendo un reto. Aquí, se describe la aplicación de partículas de seguimiento de microrheology (PTM) en conjunción con modelos 3D de cáncer de páncreas como parte de un enfoque sólido y viable para el seguimiento longitudinalmente cambios físicos en el microambiente del tumor, in situ. La metodología descrita aquí se integra un sistema de preparación in vitro en modelos 3D incrustados en un modelo de matriz extracelular (ECM) andamio de colágeno de tipo I con sondas marcadas con fluorescencia distribuidos de manera uniforme para POsición y mediciones microrheology dependientes del tiempo a lo largo de la muestra. tumores in vitro están chapados y probaron en condiciones paralelas utilizando placas de imagen de múltiples pocillos. Sobre la base de los métodos establecidos, videos de los movimientos de la sonda de rastreo se transforman a través de la Relación Generalizado Stokes Einstein (GSER) para reportar el módulo de cizallamiento complejo viscoelástico dependiente de la frecuencia, G * (ω). Debido a que este enfoque es a base de formación de imágenes, caracterización mecánica también se proyecta sobre grandes campos espaciales de luz transmitida a reportar simultáneamente cambios cualitativos en el tamaño del tumor 3D y fenotipo. Los resultados representativos que muestran contraste respuesta mecánica en sub-regiones asociadas con degradación de la matriz localizada inducida por invasión-, así como la calibración del sistema, se presentan los datos de validación. También se presentan los resultados no deseados de los errores experimentales comunes y solución de problemas de estos temas. El formato de chapado cultura 3D de 96 bien implementado en este protocolo es conducive a la correlación de las mediciones microrheology con ensayos de cribado terapéuticos o de imagen molecular para obtener nuevos conocimientos sobre el impacto de los tratamientos o estímulos bioquímicos en el microambiente mecánico.

Pues bien, de un creciente cuerpo de evidencia en la literatura que las células cancerosas, al igual que las células epiteliales de mamíferos no malignas, son muy sensibles a las propiedades mecánicas y biofísicas de la matriz extracelular circundante (ECM) y otros componentes del microambiente ^1-9. Estudios mecánicos elegantes han proporcionado ideas sobre el papel de la rigidez extracelular como socio de señalización mechanosensitive complejo que regula el comportamiento maligno de crecimiento y la morfogénesis ^2,3,10,11. Esta labor se ha visto facilitada en particular, por el desarrollo del 3D en modelos tumorales in vitro que restauran la arquitectura del tejido biológicamente relevante y se pueden cultivar en materiales de andamiaje con la mecánica sintonizables y imágenes de microscopía óptica ^12-19. Sin embargo, el otro lado de este cuadro de diálogo mechanoregulatory entre el tumor y el microambiente, a través del cual las células cancerosas, a su vez modificar la reología de su entorno, sigue siendo algomás difíciles de estudiar. Por ejemplo, durante los procesos de invasión, las células en la periferia de un tumor pueden someterse a transición epitelial a mesenquimal (EMT) y aumentar la expresión de metaloproteasas de la matriz (MMPs) que causan la degradación local de la ECM ^20-22, que a su vez influye en el comportamiento de crecimiento de mechanosensitive otras células tumorales proximal. A través de una variedad de procesos bioquímicos, células de cáncer de marcar continuamente la rigidez local de su entorno arriba y hacia abajo para adaptarse a diferentes procesos en diferentes momentos. La metodología descrita aquí está motivada por la necesidad de instrumentos de análisis que reportan los cambios locales en la rigidez y el cumplimiento de la MEC durante el crecimiento, que se pueden integrar con modelos de tumores en 3D y correlacionados longitudinalmente con cambios bioquímicos y fenotípicas sin interrumpir la cultura.

En busca de una técnica apropiada para aplicar en este contexto, microrheology partícula-tracking (PTM) se perfila como un fuerte candidato.Este método, pionero originalmente por Mason y Weitz ^23,24, utiliza el movimiento de las sondas de rastreo incrustados en un fluido complejo reportar el módulo complejo dependiente de la frecuencia de cizalla viscoelástico, G * (ω) a escalas de longitud de micras. Este enfoque general ha sido desarrollado con múltiples variaciones adecuadas para diferentes aplicaciones en-suaves de la Materia Condensada, coloides, la biofísica y la física de polímeros ^25-31. PTM tiene ciertas ventajas con respecto a otros métodos, ya que las lecturas de la viscoelasticidad local son proporcionados por formación de imágenes de vídeo no destructivo de las sondas de trazador bioquímicamente inactivos que se incorporan en el momento de preparación de cultivo y permanecen en su lugar durante largos períodos de crecimiento. Esto está en contraste con las medidas estándar de oro con un reómetro de cizalla oscilatoria a granel, lo que necesariamente requiere la terminación de la cultura y de los informes de la reología macroscópica grueso de la muestra en lugar de mediciones puntuales dentro del complejo microenvir tumor 3DAMBIENTE. De hecho, un número de estudios han demostrado la utilidad de la interpretación de las mediciones de movimientos de la sonda trazador en o alrededor de las células cancerosas o no cancerosas para medir deformaciones asociadas con la migración celular ^32, la tensión mecánica inducida por un esferoide expansión ^33, reología intracelular ^34,35, y para asignar cargas mecánicas en la ingeniería de tejidos ^36, y la relación entre el tamaño de los poros y la velocidad de invasión ^37. Otras técnicas adecuadas para microrheology, tales como la microscopía de fuerza atómica (AFM) se pueden implementar, pero principalmente para sondear los puntos en la superficie de la muestra y también pueden plantear problemas de esterilidad de la cultura que complican las mediciones longitudinales ^38.

Aquí se describe un protocolo integral métodos para el crecimiento de esferoides tumorales 3D adecuados para su transferencia a ECM con sondas fluorescentes incrustados para vídeo partícula de seguimiento y análisis de métodos para mapear fiablemente espacial que abarcacambios en microrheology largo del tiempo en la cultura. En la presente aplicación, modelos de tumores 3D se cultivan en formato de múltiples pocillos con vistas a la incorporación de mediciones microrheology con otros ensayos tradicionales (por ejemplo, citotoxicidad) que este formato es propicio para. En esta ilustración representativa de esta metodología de cultivo in vitro esferoides 3D utilizando células PANC-1, una línea celular de cáncer de páncreas establecidos conocidos para formar esferoides ^39, pero todas las mediciones descritas en este documento son ampliamente aplicables al estudio de tumores sólidos usando una variedad de líneas celulares adecuados para el cultivo en 3D. Debido a que este método se basa formación de imágenes de sí que es ideal para el co-registro de los datos microrheology alta resolución con grandes campos de luz transmitida de vista que informan de cambios en el crecimiento celular, la migración y el fenotipo. La implementación de PTM integrado con microscopía de luz transmitida de esta manera asume el posicionamiento reproducible de los qu platina del microscopioich suele estar disponible en los microscopios biológicos epifluorescencia widefield comercial motorizados. El protocolo desarrollado a continuación se puede implementar con cualquier microscopio biológico de fluorescencia automatizado razonablemente equipadas. Este es un método intensivo de datos inherente, lo que requiere la adquisición de gigabytes de datos de microscopía de vídeo digitales para el procesamiento fuera de línea.

En el siguiente protocolo, Protocolo 1 se refiere a la preparación inicial de esferoides tumorales que se describe aquí el uso de superposición en agarosa, pero podría estar sustituidos con una variedad de otros métodos tales como la gota que cuelga ^40, o cultivo rotatorio ⁴¹ técnicas. Protocolo 2 se describe el proceso de integración de esferoides en una estructura de colágeno, aunque, alternativamente, in vitro tumores en 3D podrían ser cultivadas mediante encapsulación o la incrustación de células resuspendidas en ECM ^12,15, en lugar de esferoides no adherentes individuales pre-formadas. Protocolos posteriores describen procedimientos para obtaining mediciones microrheology tiempo de resolverse mediante la adquisición y procesamiento de datos de microscopía de vídeo, respectivamente. El procesamiento de datos se describe utilizando MATLAB, haciendo uso de las rutinas de código abierto para el PTM construido en algoritmos descritos originalmente por Crocker y Grier ^42, que también se han desarrollado ampliamente para diferentes plataformas de software (ver http://www.physics.emory.edu/ ~ semana / idl /).

1. Esferoides tumorales cultivo

1. Mezclar 10 ml de agua de grado de cultivo de células con 0,1 g de agarosa para obtener una solución de agarosa al 1%.
2. Solución de agarosa de calor por encima de 70 ° C (más o menos 14 segundos en un horno de microondas estándar o mediante el uso de una placa de calentamiento) antes de alícuotas de 40 l de solución de agarosa en un pocillo en una placa de 96 pocillos.
3. Incubar la placa a 37 ° C durante al menos 1 h mientras la cosecha de las células utilizando técnicas estándar.
4. Utilice un hemocitómetro para determinar la concentración de células en la suspensión.
5. Diluir la suspensión de células a 1000 células / ml y añadir 100 l de esta dilución a la bien que contiene el lecho de agarosa curado.
6. Colocar la muestra en un agitador durante la noche en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO _2.
7. Quitar la muestra de coctelera y añadir 100 ml de medio de cultivo celular.
8. Incubar esferoides hasta que se alcanza el diámetro deseado. Por ejemplo, después de 9 días, un spHeroid habrá aproximadamente 450 m de diámetro. Durante este tiempo, el medio de crecimiento fresco puede ser añadido a los pozos de aspiración, pero se debe evitar ya que esto resultará en la eliminación del esferoide.

2. Preparación esferoides tumorales 3D incrustados en ECM

1. Preparar una estación de trabajo con los materiales necesarios dentro de una campana de flujo laminar.
2. Prepare una mezcla diluida de 1 m de diámetro sondas trazadores fluorescentes modificado carboxilato añadiendo sondas 2 piezas de stock (2% de sólidos) a 25 partes de agua estéril.
3. Quitar una botella de 3,1 mg / ml de colágeno bovino de la nevera y colóquelo sobre hielo.
4. Alícuota de 125 l de colágeno en un vacío vial de 2 ml.
5. Añadir 50 l de solución de sonda de trazador diluido al vial que contiene el colágeno y agitar brevemente para distribuir sondas.
6. Añadir 235 l de medio de cultivo celular apropiado que contiene rojo de fenol (que se convertirá amarillo) para un volumen total de 410 ml y agitar brevemente antes de retirar 205 ml (la mitad del volumen total) y colocándolo en un nuevo vial de 2 ml. Vial 1 contendrá el esferoide tumoral y Vial 2 será una mezcla de control.
7. Añadir ~ 2 l de 1 M de NaOH al vial 1 para llevar la solución de nuevo a pH neutro (medios de cultivo que contienen rojo de fenol deben volver a rojo). Tenga en cuenta que esto hará que la mezcla para iniciar el curado si no se mantiene en hielo. Vortex brevemente para mezclar, y luego volver a una rejilla de hielo inmediatamente.
   NOTA: El esferoide es apenas visible a simple vista después de 9 días de cultivo y su retirada de la cama de agarosa es una tarea delicada. El uso de un microscopio de disección puede ser útil para algunos usuarios. El mantenimiento de la integridad del esferoide durante la transferencia es de suma importancia.
8. Con una punta de pipeta de boca ancha, retire suavemente 40 l de los medios de comunicación desde el pozo que contiene el esferoide tumor. Conserve este 40 l, mientras que la realización de la siguiente etapa.
9. Compruebe el pozo para ver si el esferoidefue eliminado en el paso anterior. Si lo fuera, añadir los 40 l que contenía el esferoide al vial 1. Si no, coloque los 40 l atrás en el bien y repita el paso anterior.
10. Revuelva suavemente Vial 1 (no se arriesgue a vórtex, se puede dañar el esferoide) antes de transferir la mezcla en 60 porciones mu l en tres pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Inspeccionar cada pocillo con un microscopio después de la adición de la mezcla para determinar que bien contiene el esferoide.
11. Añadir ~ 2 l 1 M de NaOH y 40 l de medios de cultivo celular a Vial 2 y un vórtex antes de alícuotas 60 l de esta mezcla a un vacío bien en la placa de 96 pocillos y etiquetado como control.
12. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C para curar durante al menos 1 hora.

3. Construir rejilla de puntos muestrales y Tomar un video en cada punto

1. Transfiera la placa de la muestra de la incubadora a la platina del microscopio. Permita 10 minutos para que la muestra equilibrate con la temperatura ambiente si una etapa caliente no está disponible.
2. Observar la muestra con lentes de objetivo de baja potencia para asegurarse de que está intacto y listo para la imagen. Determinar la posición del tumor dentro del pozo.
3. Decida cuántos puntos de muestra a tomar. Por lo general, 20 puntos de muestreo en cada pocillo, distribuidos en anillos concéntricos alrededor del esferoide producirán resultados debidamente detalladas.
4. Mueva el escenario para cada posición deseada y utilice el microscopio interfaz de software para registrar las coordenadas X e Y (o registro de las coordenadas manualmente en caso de interface de software no está disponible).
5. Encienda el microscopio a una lente de objetivo de alta potencia (típicamente 100X), y seleccione el cubo de filtro apropiado para la longitud de onda de excitación de las sondas de rastreo. Use la lista de puntos creados en el paso 3.4 para mover al primer punto de la cuadrícula.
6. Ajuste el enfoque para encontrar el fondo del pozo, y luego moverse hacia arriba para encontrar un campo de visión (FOV) que contiene varios trac de enfoqueer sondas.
7. Observe el histograma de intensidad y ajustar la intensidad y el tiempo de exposición para obtener el mayor rango dinámico posible al tiempo que garantiza que la imagen no se convierte en saturada.
8. Obtener una secuencia de vídeo a una velocidad de 20 a 30 milisegundos por cuadro (aproximadamente 800 marcos o 16-24 segundos de longitud se recomienda para proporcionar estadísticas suficientes para el cálculo MSD robusta equilibrio con la necesidad de reducir al mínimo el tiempo de adquisición en cada punto de la malla espacial) y guardar con una convención apropiada. Durante la grabación, no toque el microscopio o una mesa.
9. Repita los pasos 3.6 hasta 3.9 por cada punto de muestra en la cuadrícula.
10. Repita los pasos 3.3 a 3.10 para cada pozo en el experimento.

4. Análisis de los datos de vídeo para Calcular Propiedades reológicas en cada punto de muestra

1. Copie todos los datos de vídeo a una carpeta de análisis (posiblemente en un equipo diferente).
2. Importar datos de imagen en MATLAB u otro software de análisis.
   NOTE: Amplia documentación relativa al conjunto de MATLAB rutinas de seguimiento de partículas adoptadas aquí está disponible en http://people.umass.edu/kilfoil . Se recomienda el uso de una función de llamada personalizados para automatizar el procesamiento de múltiples archivos en diferentes posiciones.
3. Calibrar el software mediante el análisis de varios fotogramas de vídeo para determinar adecuadamente los parámetros de selección y rechazo (tamaño, de paso de banda, etc) para la identificación de las posiciones del centro de la sonda. Amplia fondo de estos pasos cruciales es descrito por Crocker y Grier.
4. Utilice el software para determinar automáticamente cada posición de la sonda para todos los fotogramas de vídeo y luego vincular estas posiciones en las trayectorias.
5. Utilice los datos de trayectoria para calcular la media al cuadrado de desplazamiento (MSD) como una función del tiempo de retraso, asegurándose de aplicar el factor de calibración espacial apropiada (m por píxel) para la lente de objetivo específico, cualquier pixel binning, etc (típicamente llevadoen los metadatos).
6. Calcular G * (usando la generalizada relación de Stokes-Einstein tienen en cuenta los límites de aplicabilidad de GSER para una determinada muestra de ^24,28,43. Alternativamente, los usuarios pueden querer interpretar propiedades ECM directamente desde MSD simplemente comparando la escala de ley de potencia, meseta valores, índices de heterogeneidad u otros parámetros.
7. Repita los pasos 4.2 a 4.6 por cada fov en el experimento.
8. Co-registro de datos de posición desde el paso 3.4 con modulii viscoelásticas a una frecuencia particular de interés. Dependiendo del fabricante del microscopio utilizado, este paso puede ser facilitada por una rutina personalizada que lee los metadatos microscopio o posición de los datos pueden ser tabulados manualmente.
9. Uso de las funciones de interpolación 3D para generar un mapa de la reología espacial de la ECM.

Para verificar la validez de G * (ω) mediciones en las posiciones localizadas dentro de un complejo microambiente tumoral modelo, se realizaron dos experimentos iniciales de validación. En primer lugar, hemos tratado de validar nuestras medidas contra el "estándar de oro" de reometría cizalla oscilatoria granel. Hemos preparado muestras idénticas de matriz de colágeno (sin células) a una concentración de 1,0 colágeno mg / ml. Estas muestras se probaron con un reómetro mayor (TA Instruments AR-G2, utilizando 40 mm de geometría de placas paralelas) y por PTM (utilizando los mismos parámetros que en todo este protocolo) y las mediciones resultantes de G '(ω) y G "(ω ) se compararon (Figura 2A). Excelente acuerdo fue encontrado entre las dos mediciones. En segundo lugar, para establecer la capacidad de este protocolo para medir los cambios puntuales en ECM reología que preparamos a / matriz de colágeno ml 1.0 mg y perlas incrustadas trazadores. A continuación, la muestra se trató con unainyección centralizada de 5 l dispasa (Figura 2B), que digiere rápidamente colágeno. Después de incubar durante 3 horas para permitir la digestión de colágeno localizada que se produzca, los datos de video fue tomado a diferentes distancias de la zona de inyección, y las mediciones de G '(ω) y G "(ω) se realizaron en cada caso. La magnitud de G "(ω = 1 rad / s) se encontró que era mayor que el de G '(ω = 1 rad / seg) en el sitio de la inyección. Se han encontrado Las mediciones tomadas a distancias crecientes desde el sitio de inyección para tener una magnitud creciente de G *, así como una relación de aumento de G 'a G "(Figura 2C). El tamaño de la región altamente degradada de ~ 2 mm es consistente con una distancia estimada de difusión de una proteína con hidrodinámico radio R _H = 1 nm (el peso molecular de dispasa es 32,5 kDa) a través de colágeno digerido con viscosidad de η = 10 ^{- 3} Pa · seg a 37 ° C: , donde . Por lo tanto los resultados están de acuerdo con el ablandamiento esperado de la matriz cerca de la zona de la inyección, y demuestran nuestra capacidad de hacer mediciones precisas, localizadas de la reología de la matriz.

Los datos representativos de un modelo de tumor 3D preparado de acuerdo con este protocolo se muestra en la Figura 3. Los datos de vídeo se recogió en 19 ubicaciones fijas dentro de la estructura de colágeno, formando una rejilla áspero alrededor del tumor (Figura 3A). Este datos de coordenadas se combinó con los valores calculados de G '(ω) para crear un mapa espacial de ECM rigidez (Figura 3B). Este mapa espacial revela claramente una zona de rigidez aumentada inmediatamente proximal a la esferoide de tumor en el día 2, lo que podría ser correlacionada con la deposición de laminina V colágeno IV, unad otros componentes de la membrana basal depositadas por el esferoide en sí ^17,18,44,45, o compresión local de la ECM por el esferoide en expansión.

El crecimiento del tumor y la invasión de la matriz eventos fueron monitorizados durante 4 días. Dos regiones fueron identificados como no teniendo evidencia de células invasoras en la periferia del tumor, o evidencia pronunciado de la invasión de células (Figura 3C). PTM mediciones fueron tomadas en las regiones 1 y 2 más de 4 días. Por día 4, hubo una diferencia significativa en G '(informado a 1 rad / seg) entre las dos regiones (Figura 3D). Las mediciones dependen de la frecuencia de G 'y G "para las regiones 1 y 2 en el día 4 muestran ablandamiento significativo de la ECM en la región 2, la región invasiva (Figura 3E). El día 4 la región dos exposiciones, una respuesta viscoelástica de tipo líquido, evidente por escalamiento viscosa de la parcela G "(Figura 3E).

Representante subóptimolos resultados de los errores experimentales y análisis comunes se muestran en la Figura 4. Tal vez la fuente más obvia de error está en la estabilidad de la configuración en la que se lleva a cabo la microscopía de vídeo. Si el banco de laboratorio se desplaza o si hay alguna otra fuente externa de vibraciones, trayectorias de talón puede ser influenciada artificialmente, lo que resulta en una deriva en los datos. Drift hace que el MSD aumentar de forma espectacular en los momentos de alta lag (Figura 4), ​​que también hace que el G '(ω) y G "(ω) valores calculados para aumentar drásticamente a bajas frecuencias (Figura 4B). La deriva puede ser reducido mediante el uso de un banco de laboratorio de neumática de aire acolchado, y simplemente teniendo cuidado de no golpear la configuración mientras se graban vídeos. Además, la deriva puede ser removido durante el procesamiento posterior mediante rutinas de software. Estas rutinas son adecuados para la eliminación de la deriva que es aproximadamente uniforme en un intervalo de tiempo conocido. Deriva errática (quizás causadoal golpear la etapa durante la adquisición de datos) es más problemático. Por lo tanto, es importante asegurarse de que la muestra permanece mecánicamente aislado del medio ambiente durante la recopilación de datos.

Otra fuente potencial de resultados poco claros proviene de interpretación incorrecta de heterogeneidad de la muestra. Aunque la capacidad de observar y cuantificar la heterogeneidad espacial en una muestra es de hecho una de las fortalezas notables de PTM ²⁶ (y algo que se pierde en las mediciones de reología granel tradicionales), agrupación indebida de grupos de trayectorias de sondeo puede llevar a conclusiones erróneas. Dado que los cambios en la rigidez de ECM reportados por esta metodología son intrínsecamente heterogénea, como es el propio material, en cualquier campo de visión dado, podría haber un par de sondas de trazador que no se limitan elásticamente por fibras de colágeno y por lo tanto libres para explorar estocásticamente de agua más grande lleno de poros (Figura 4C). Estas sondas "sueltos" exhibición movilidad aproximadamente consistente con un entorno puramente viscoso. Puesto que los datos para todas las sondas se promedian antes se calculan los módulos viscoelásticas, que tiene un par de sondas sueltas en una región de muestreo dada (campo de visión) puede producir de frecuencia parcelas dependientes de G * (ω) que varían ampliamente (Figura 4D).

Calibración del software incorrecto puede dar lugar a errores durante la recolección y análisis de video. Durante la recogida de datos de vídeo, es importante observar el histograma de intensidad y ajustar el tiempo de exposición para dar el mayor rango dinámico posible asegurando al mismo tiempo que la imagen no se convierte en saturada. El análisis calcula posiciones centrales refinado para cada sonda trazador integrando el valor de la intensidad de cada píxel. Si la imagen está saturada, esta integración será menos precisa debido a una sección de "flat top 'del perfil de intensidad. Además, la calibración hallazgo función es un paso muy importante para asegurar resultados precisos. La elección adecuada de los parámetros de selección es de suma importancia. Este proceso ha sido descrito extensamente por Crocker y Grier ^42, Savin y Doyle ^43, y otros.

Figura 1. Esquema de Procedimiento experimental. (A) esferoides tumorales se forman en las camas de agarosa, y luego transferidos a una matriz 3D que contiene sondas de trazadores incrustados. (B) Los datos de vídeo se toma en varios puntos dentro de la muestra, así, tanto adyacente a y lejos de la esferoide tumoral. (C) El movimiento estocástico de las sondas en cada uno de vídeo se analiza con el fin de determinar las propiedades reológicas locales de la matriz en cada punto de muestra. Estos datos se compila en un mapeo espacial de ECM rigidez a lo largo del pozo.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Verificación de las mediciones. (A) Los componentes de G * (ω) se muestran aquí. Los valores calculados de G '(ω) y G "(ω) utilizando PTM son muy similares a los obtenidos a través de un reómetro mayor. (B) 5 l de dispasa esta en el centro de un pozo con radio r = 8,5 mm que contiene 1,0 mg / ml de colágeno para medir los cambios espaciales en G * (ω). (C) Los valores calculados de G '(ω) y G "(ω) en el sitio de la inyección dispasa, 1,5 mm desde el sitio, y 3 mm desde el sitio. Además, una medición de control se hizo en un pozo que contiene el mismo gel de colágeno But con ningún tratamiento dispasa. Cerca del sitio de tratamiento con G '(ω) es menor que G "(ω). Como el gel se muestrea más lejos de la zona de tratamiento los valores de G '(ω) se hacen más grandes que G "(ω), y la magnitud de G * (ω) aumenta. Las medidas se tomaron 2,5 horas después de la inyección dispasa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Cuantificación de los cambios en la reología de ECM concomitante con el inicio de la invasión de la matriz local. (A) El pocillo que contiene un esferoide PANC-1 3D se sondea en múltiples ubicaciones a lo largo de la ECM de colágeno que rodea el tumor. (B) de coordenadas de datos se combina con Calculated G '(ω) para cada ubicación para producir un mapa espacial rigidez ECM. (C) El crecimiento del tumor y el comportamiento invasión fueron monitorizados durante 4 días. Dos regiones fueron identificados como no teniendo interacción con células invasoras (región 1, azul asterisco) o fuerte interacción con la invasión de las células que espontáneamente ramificó hacia fuera de la gran masa primaria multicelular esferoide (región 2, asterisco rojo). Mediciones (D) reológicas fueron tomadas en las regiones 1 y 2 más de 4 días. Por el cuarto día, hubo una diferencia significativa en G '(informado a 1 rad / seg) entre las dos regiones. (E) Frecuencia mediciones dependientes de G '(ω) y G "(ω) para las regiones 1 y 2 en el día 4 muestran ablandamiento significativo de la ECM en la región 2, precisamente, en correlación con la presencia de poblaciones invasoras. G '(ω) y G "valores (ω) calculados utilizando un ajuste de la ley de potencia a los datos MSD se muestran como llena y vacía res puntualesvamente. El día 4, la región dos exposiciones una respuesta viscoelástica de tipo líquido como es evidente por la escala viscosa de la parcela G "(ω) y la ausencia de la línea de ajuste para G '(ω). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 4. Datos de los resultados sub-óptimos debido a la deriva y de interpretación incorrecta de la heterogeneidad de ECM. (A) El MSD de una sonda de trazador confinado en un material complejo sigue la ley de potencia de escala ^<2? R (τ)> ~ ^τ α (0 ≤ α ≤ 1). En consecuencia, los valores de MSD deben acercarse a una meseta en los tiempos de retardo largos. Deriva en la muestra puede eliminar artificialmente este comportamiento, Leading a la escalada de los valores de MSD en los tiempos de retardo largos. (B) El largo tiempo de deriva de retraso en el MSD hará que los valores de G '(ω) y G "(ω) para convertirse significativamente erróneas a frecuencias cortas. La deriva puede ser eliminado o reducido, ya sea por asegurar que la muestra está aislado mecánicamente durante la recogida de datos o mediante el uso de rutinas de software para eliminar la deriva durante el análisis. (C) Incluso en un pequeño campo de vista, dos variedades distintas de las trayectorias de las sondas pueden estar presentes. En este ejemplo, la mayoría de las sondas están confinados en la matriz, pero unos pocos son 'flojos' - sus trayectorias son mucho menos limitado. (D) El intento de interpretar los datos MSD tanto restringidos y no restringidos sondas al mismo tiempo y sin una interpretación adecuada de la muestra de la heterogeneidad confundirán las medidas de los módulos viscoelásticos. Por favor click aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este protocolo se introduce una estrategia sólida y de aplicación general para el seguimiento longitudinal cambios locales en la rigidez ECM en modelos de tumores en 3D. Tenemos la visión de que esta metodología podría ser adoptada por los biólogos del cáncer y biofísicos interesados ​​en el comportamiento mechanosensitive implicados en la remodelación de la matriz durante el crecimiento del tumor y de los procesos de invasión. La cuantificación precisa de la cinética de degradación de la matriz podría ser particularmente valiosa para los estudiosos de la actividad de las metaloproteasas de matriz, lisil oxidasa o de otras especies bioquímicas relevantes en modelos de tumores en 3D que están directamente vinculados a la remodelación de la matriz. Más allá de la aplicación a los modelos tumorales 3D descrito aquí, uno podría imaginar aún más la aplicación de este enfoque en conjunción con otros sistemas de modelos enfermedad en la que la modificación de la reología de la matriz con el tiempo desempeña un papel importante ^46,47. La utilidad de este método sigue perfeccionando a través de mejoras de software que más automate el proceso y permitir el aumento de los estudios de rendimiento. Esto dará lugar a instantáneas cada vez más detalladas de la paisaje físico de muchas muestras, simultáneamente, para el uso en formatos de múltiples pocillos.

Aquí se describe específicamente la aplicación de pasiva microrheology de partícula de seguimiento en modelos de tumores en 3D, que es muy adecuado para la medición de la respuesta viscoelástica lineal en el intervalo de ~ decenas de Pascal típicos de productos de la matriz extracelular disponibles comercialmente (colágeno bovino, extractos de EHS-tumorales o nanofibras andamios comerciales). La observación de estocástico, movimiento accionado térmicamente, incluso con altos óptica de apertura numérica para cuantificar pequeños desplazamientos de la sonda, se limita inherentemente al régimen lineal de estos entornos ECM relativamente suaves, pero los investigadores que desean para sondar materiales más rígidos puede ser capaz de adaptar este protocolo para su uso con manipulaciones activos a través de óptica ⁴⁸ o magnético de captura ⁴⁹ de las sondas. Since las pinzas ópticas o magnéticas sonda A solo punto dentro de una muestra y no afectan a la integridad de la muestra, estas técnicas posiblemente podrían ser incorporados en el protocolo anterior para obtener mediciones longitudinales de muestras más rígidos.

Es importante observar que otras fuerzas celulares generadas también pueden contribuir a los movimientos de la sonda de trazadores en varias escalas de tiempo. Por ejemplo, durante la migración celular que se produce en el transcurso de horas y días en cultivo, los grupos de sondas se empuja y se tira debido a movimientos de la célula y de hecho es este movimiento que se utiliza en la microscopía de fuerza de tracción ^50,51. Los movimientos de la sonda movidos térmicamente que se analizan para obtener datos microrheology tienen lugar en el orden de segundos, una escala de tiempo claramente separables. Aunque también es cierto que la dinámica lenta de los esfuerzos y tensiones asociadas con las fuerzas de tracción pueden contribuir a los cambios locales en la reología ^36, una fuerza de esta formación de imágenes-BASED enfoque reside en la capacidad para correlacionar los cambios visuales y reológicas de la muestra. Por ejemplo, en los resultados representativos en la figura 3, un evento obvia invasión de la matriz celular y la migración se correlaciona con un cambio en G 'de casi cuatro órdenes de magnitud durante el tiempo de esta migración tiene lugar.

El protocolo aquí descrito asume que los usuarios tienen acceso a un microscopio con una etapa motorizada que proporciona un posicionamiento reproducible de la muestra. Laboratorios que no tienen esta instrumentación aún hacer mediciones de punto usando marcas u otras señales visuales en el soporte de la muestra o la muestra para permitir mediciones repetidas en el mismo punto, aunque es probable que sea difícil de lograr la misma reproducibilidad en el posicionamiento como se muestra en la mediciones longitudinales representativos aquí. A los efectos de estos resultados representativos anteriores, posicionándose en el eje z se mantuvo aproximadamente constante. Sin embargo, el protocolo could también se modificará para incluir medidas adicionales a lo largo del eje z con el fin de crear un mapa 3D reológico de la muestra. El método también podría ser modificado para utilizar un láser confocal de barrido o un técnicas multifotónica para 3D de seccionamiento aunque velocidades de exploración supongan una limitación de los límites de frecuencia superior accesibles que pueden o no puede ser problemático para una aplicación dada.

En este método, una restricción de tiempo significativo se impone por la necesidad de volver células vivas a la incubadora. Sin un time-lapse recinto estación meteorológica para el control de la temperatura, la humedad y los niveles _de CO2, la imagen de tiempo de adquisición debe ser minimizado. Incluso con el equipo adecuado, la recopilación de datos ocupa grandes cantidades de tiempo y de memoria digital, que son ambos sujetos a limitaciones prácticas. Por ejemplo, con el microscopio y la cámara utilizada en este estudio, se necesitarían alrededor de 35 horas para tomar las cerca de 4.000 vídeos necesarios para asignar un solo pozo en un 96-Así placa con un lente objetivo 100X sin espacio entre campos de visión. Estos factores imponen restricciones sobre el número de puntos de datos que se pueden recoger de manera realista. El nivel de detalle es, por lo tanto, sujeto a las limitaciones prácticas impuestas por el tiempo disponible para la recogida de datos, el espacio de almacenamiento de datos y la disponibilidad de una vivienda del medio ambiente.

La capacidad de cuantificar los cambios en la ECM reología podría integrarse más al lado de los métodos basados ​​en la imagen para la cuantificación de la respuesta terapéutica en modelos de tumores en 3D ^17,18,52,53. El sistema de cultivo de múltiples pocillos 3D modelo adoptado en ambos métodos sugiere una implementación paralela proporcionar correlación entre la respuesta citotóxica y la modificación del entorno mecánico. Esto podría facilitar el desarrollo de nuevas estrategias que se dirigen explícitamente el fenotipo mecánico o dilucidar el impacto de las terapias existentes en esta capacidad. Tal comprensión podría ser directamente relevantes para unpproaches para mejorar la administración de fármacos a través de denso estroma tumoral rico en colágeno. Por ejemplo, en el contexto de la ilustración representativa de este protocolo presentado aquí con modelos tumorales pancreáticas in vitro, la evaluación de la degradación de la matriz después de las intervenciones se podrían utilizar en el cribado de los regímenes de agotamiento del estroma, un paradigma terapéutico cada vez más importante para el cáncer de páncreas ^54.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Agradecemos la compartición de código abierto de MATLAB código partícula de seguimiento proporcionado por Maria Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), junto con el código IDL antes y una extensa documentación proporcionada por John C. Crocker y Eric R. Weeks. Este trabajo fue posible gracias al financiamiento del Instituto Nacional del Cáncer (NCI / NIH), K99CA155045 y R00CA155045 (PI: JPC).