Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Partikel-Tracking Mikrorheologie können zerstörungs quantifizieren und räumlich zuordnen Veränderungen in der extrazellulären Matrix mechanische Eigenschaften im 3D-Tumormodelle verwendet werden.
Die mechanische Mikro wurde gezeigt, als entscheidender Regulator der Tumorwachstumsverhalten und die Signalisierung, die selbst umgebaut wird und als Teil eines Satzes von komplexen, zwei-Wege mechanosensitive Wechselwirkungen modifiziert handeln. Während die Entwicklung von biologisch relevanten 3D-Tumormodellen haben mechanistische Studien über die Auswirkungen der Matrix Rheologie auf das Tumorwachstum erleichtert die inverse Problem der Zuordnung Veränderungen in der mechanischen Umgebung von Tumoren induziert bleibt eine Herausforderung. Hier beschreiben wir die Umsetzung der Partikel-Tracking Mikrorheologie (PTM) in Verbindung mit 3D-Modellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs als Teil eines robusten und brauchbarer Ansatz zur Längs Überwachung physikalischer Veränderungen in der Tumor-Mikroumgebung, in situ. Die hier beschriebene Methodik integriert ein System zur Herstellung von 3D-Modellen in vitro in einem Modell der extrazellulären Matrix (ECM) Gerüst aus Typ I-Kollagen eingebettet mit fluoreszenzmarkierten Sonden für gleichmäßig verteilte position-und zeitabhängigen Messungen Mikrorheologie gesamten Probe. In vitro Tumoren werden plattiert und parallel Bedingungen mit Multiwellfolien untersucht. Gestützt auf etablierte Verfahren, sind Videos von Tracer-Sonde Bewegungen über das Generalized Stokes Einstein Beziehung (GSER), um die komplexen frequenzabhängigen viskoelastischen Schermodul G * (ω) berichten umgewandelt. Da dieser Ansatz Imaging-basierte, wird die mechanische Charakterisierung auch auf große Durchlichtraum Feldern zugeordnet, gleichzeitig berichten qualitative Veränderungen in 3D Tumorgröße und Phänotyp. Repräsentative Ergebnisse zeigen, kontras mechanische Reaktion in Teilbereichen mit lokalisierten Invasion-induzierte Matrixabbau sowie System-Kalibrierung, Validierung werden Daten vorgestellt. Unerwünschte Ergebnisse aus gemeinsamen experimentelle Fehler und Problemlösungen dieser Fragen werden ebenfalls vorgestellt. Die 96-Well-Format 3D-Beschichtung Kultur in diesem Protokoll implementiert ist, ist conducive zu Korrelation von Mikrorheologie Messungen mit therapeutischen Screening-Tests oder der molekularen Bildgebung, neue Einblicke in die Auswirkungen der Behandlungen oder biochemische Reize auf die mechanische Mikroumgebung zu gewinnen.
Es ist klar, von einer wachsenden Zahl von Hinweisen in der Literatur, dass Krebszellen, wie bei nicht-malignen Säuger Epithelzellen, reagieren sehr sensibel auf die mechanischen und biophysikalischen Eigenschaften der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) und andere Mikrokomponenten 9.1. Elegante mechanistische Studien Einblicke in die Rolle der extrazellulären Steifigkeit als eine komplexe Signal mechanosensitive Partner, der malignen Wachstumsverhalten und Morphogenese 2,3,10,11 reguliert ist. Diese Arbeit wurde insbesondere durch die Entwicklung von 3D in vitro-Tumormodellen, die biologisch relevante wiederherzustellen Gewebearchitektur und können in Trägermaterialien mit maßgeschneiderten Mechanik angebaut und durch optische Mikroskopie 12-19 abgebildet werden erleichtert. Jedoch ist die andere Seite dieser mechanoregulatory Dialog zwischen Tumor und Mikroumgebung, durch die Krebszellen wiederum Veränderung der Fließeigenschaften ihrer Umgebung bleibt etwasschwieriger zu studieren. Zum Beispiel während der Invasion Prozesse, die Zellen am Rande eines Tumors kann epitheliale mesenchymale Transition (EMT) zu unterziehen und erhöhen die Expression von Matrix-Metalloproteasen (MMPs), die lokalen Abbau von ECM 20-22, die wiederum Einfluss auf mechanosensitive Wachstumsverhalten führen andere proximalen Tumorzellen. Durch eine Vielzahl von biochemischen Prozessen, die Krebszellen die lokale Steifigkeit ihrer Umgebung wählen ständig auf und ab, um verschiedene Prozesse zu unterschiedlichen Zeiten anpassen. Die hier beschriebene Methode ist durch die Notwendigkeit für analytische Werkzeuge, die lokale Veränderungen in der Steifigkeit und Nachgiebigkeit der ECM während des Wachstums, die mit 3D-Tumormodellen integriert ist und in Längsrichtung mit biochemischen und phänotypische Veränderungen korreliert ohne Beendigung der Kultur werden kann berichten motiviert.
Auf der Suche nach einem geeigneten Verfahren in diesem Kontext zu implementieren, tritt Partikelverfolgungs Mikrorheologie (PTM) als starke Kandidaten.Diese Methode, die ursprünglich von Pionier Mason und Weitz 23,24 nutzt die Bewegung der Tracer-Sonden in einem komplexen Fluid eingebettet sind, um die frequenzabhängige komplexe viskoelastische Schermodul G * (ω) in Mikron Längenskalen zu melden. Dieser allgemeine Ansatz wurde mit mehreren Varianten für unterschiedliche Anwendungen in weichen kondensierten Materie, Kolloide, Biophysik und Polymerphysik 25-31 geeignet entwickelt. PTM hat gewisse Vorteile gegenüber anderen Methoden, da die Messwerte von lokalen Viskoelastizität durch zerstörungsfreie Videoabbildungs biochemisch inaktive Tracer-Sonden, die zum Zeitpunkt der Kulturansatz aufgenommen werden und bleiben an Ort und Stelle über einen längeren Zeitraum des Wachstums bereitgestellt. Dies steht im Gegensatz zu Gold Standardmessungen mit einer oszillierenden Schergroß Rheometer, was notwendigerweise erfordert Beendigung der Kultur und meldet den Groß makroskopischen Rheologie der Probe statt Punktmessungen innerhalb der komplexen 3D Tumor microenvironment. In der Tat eine Reihe von Studien haben den Nutzen der Interpretation von Messungen der Sonde Tracer Bewegungen in oder rund um Krebs oder Nicht-Krebs-Zellen, um Verformungen der Zellmigration 32, mechanische Beanspruchung von einem expandierenden Sphäroid 33, intrazelluläre Rheologie 34,35 induziert zu bemessen dargestellt und mechanische Spannungen und Dehnungen in Geweben entwickelt 36, und die Beziehung zwischen Porengröße und Invasion Geschwindigkeit 37 zuzuordnen. Andere Techniken für Mikrorheologie wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) implementiert werden kann, sondern in erster Linie zur Untersuchung von Punkten auf der Oberfläche der Probe und kann auch Kultur Sterilität, die Längs Messungen erschweren 38 darstellen.
Hier ein umfassendes Protokoll umfasst Methoden für das Wachstum der 3D Tumorsphäroide geeignet für den Transfer in ECM mit eingebetteten Fluoreszenzsonden für Video-Partikel-Tracking-und Analyse-Methoden für die zuverlässige Abbildung räumlicher beschreiben wirVeränderungen im Laufe der Zeit Mikrorheologie in der Kultur. In der vorliegenden Implementierung werden 3D-Tumormodellen in Multiwell-Format mit Blick auf Einbau von Mikrorheologie Messungen mit anderen traditionellen Tests (zB Zytotoxizität), die dieses Format ist förderlich für gewachsen. In dieser repräsentativen Darstellung dieser Methodik wir Kultur in vitro 3D-Sphäroiden mit PANC-1-Zellen, eine etablierte Pankreaskrebszelllinie bekannt, Sphäroiden 39, sondern alle hier beschriebenen Messungen bilden, sind breit anwendbar zu studieren, von soliden Tumoren mit einer Vielzahl von Zelllinien geeignet für 3D-Kultur. Da diese Methode von Natur-basierte Bildgebung ist es ideal für Co-Registrierung von hochauflösenden Mikrorheologie Daten mit großen Durchlicht-Sichtfelder, die Veränderungen in der Zellwachstum, Migration und Phänotyp berichten geeignet. Die Umsetzung der PTM integrierten Durchlichtmikroskopie auf diese Weise davon ausgegangen, reproduzierbare Positionierung der Mikroskoptisch whICH ist auf motorisierte kommerzielle Weitfeld-Epifluoreszenz biologische Mikroskope der Regel zur Verfügung. Die folgende entwickeltes Protokoll kann mit jedem vernünftig ausgestattet automatisierten Fluoreszenzmikroskop biologischen umgesetzt werden. Dies ist ein von Natur aus datenintensive Methode, die Übernahme von Gigabyte an digitalen Videomikroskopie für die Offline-Verarbeitung erfordert.
In dem folgenden Protokoll, Protokoll 1 bezieht sich auf die anfängliche Herstellung von Tumor-Spheroide, die hier mit Überlagerung auf Agarose beschrieben, konnte aber mit einer Vielzahl von anderen Methoden, wie hängenden Tropfen 40 oder Rotationskultur 41 Techniken ersetzt werden. Protokoll 2 beschreibt den Prozess der Einbettung Sphäroiden in einer Kollagengerüst, obwohl alternativ könnte in vitro 3D Tumoren durch Einkapselung oder Einbettung von resuspendierten Zellen in ECM 12,15, anstatt einzelne vorgeformte nichthaft Sphäroide gezüchtet werden. Nachfolgende Protokolle beschreiben Verfahren zur obtaining zeitaufgelöste Messungen Mikrorheologie durch Erfassen und Verarbeiten von Videomikroskopiedaten. Die Datenverarbeitung wird mit MATLAB, die Nutzung von Open-Source-Routinen für PTM auf Algorithmen ursprünglich von Crocker und Grier 42, die auch ausgiebig für verschiedene Software-Plattformen entwickelt, gebaut beschrieben (siehe http://www.physics.emory.edu/ beschrieben ~ Wochen / IDL /).
1. Kultivierung Tumorsphäroide
2. Vorbereitung 3D Tumorsphäroide Eingebettet in ECM
3. Construct Grid von Probe-Punkte und Nehmen Sie ein Video an jedem Punkt
4. Analysieren Video Data zu rheologischen Eigenschaften bei jedem Abtastpunkt Berechnen
Um die Gültigkeit von G * (ω)-Messungen an lokalisierten Positionen in einem komplexen Modell Tumor-Mikroumgebung zu verifizieren, wurden zwei erste Validierungsexperimente durchgeführt. Zuerst haben wir versucht, unsere Messungen gegen den "Goldstandard" der Groß oszillierende Scher rheometry validieren. Wir stellten identische Proben von Kollagenmatrix (ohne Zellen) in einer Konzentration von 1,0 mg / ml Kollagen. Diese Proben wurden mit einer Schütt Rheometers (TA Instruments AR-G2, unter Verwendung von 40 mm-Parallelplattengeometrie) und PTM (unter Verwendung der gleichen Parameter wie in diesem Protokoll), und die resultierenden Messungen von G '(ω) und G "(ω sondiert ) wurden (2A) verglichen. Ausgezeichnet Vereinbarung wurde zwischen den beiden Messungen gefunden. Zweitens, um die Fähigkeit dieses Protokoll, um Wertänderungen in ECM Rheologie wir eine 1,0 mg / ml Kollagen-Matrix eingebettet und Tracer-Kügelchen hergestellt messen zu etablieren. Die Probe wurde dann mit einer behandeltenzentrale Injektion von 5 ul Dispase (2B), die schnell verdaut Kollagen. Nach Inkubation für 3 Stunden, damit lokalisierte Kollagen Verdauung stattfindet, wurde Videodaten in unterschiedlichen Entfernungen von der Injektionsstelle entnommen, und Messungen von G '(ω) und G "(ω) wurden jeweils hergestellt. Die Grße G "(ω = 1 rad / s) wurde festgestellt, größer als der G 'an der Injektionsstelle (ω = 1 rad / Sek.) Messungen mit zunehmender Entfernung von der Injektionsstelle aufgenommen wurden gefunden, um eine Erhöhung der Grße von G *, sowie einen zunehmenden Verhältnis von G "zu G" (Fig. 2C) haben. Die Größe des hoch abgebaute Region von ~ 2 mm ist, die mit einer geschätzten Entfernung der Diffusion eines Proteins mit hydrodynamische Radius R H = 1 nm (das Molekulargewicht von 32,5 kDa Dispase) durch verdaut Kollagen mit einer Viskosität von η = 10 - 3 Pa · s bei 37 ° C: , wobei
. Daher sind die Ergebnisse stimmen mit der erwarteten Erweichung der Matrix in der Nähe der Injektionsstelle, und zeigen unsere Fähigkeit, präzise, lokalisierte Messungen der Matrix Rheologie zu machen.
Repräsentative Daten aus einem 3D-Tumormodell nach diesem Protokoll hergestellt, ist in Fig. 3 gezeigt. Video-Daten wurden bei 19 festen Stellen innerhalb des Kollagengerüst gesammelt, wodurch ein grobes Raster der Umgebung des Tumors (Abbildung 3A). Diese Koordinaten-Daten mit berechneten Werten von G '(ω) kombiniert werden, um eine räumliche Karte der ECM Steifigkeit (3B) zu erzeugen. Diese räumliche Karte zeigt deutlich eine Zone erhöhter Steifigkeit unmittelbar proximal zum Tumor Sphäroids am Tag 2, die mit der Ablagerung von Kollagen IV, Laminin V ein korreliert werden konnted anderen Basalmembrankomponenten von der Sphäroid selbst 17,18,44,45 oder lokale Kompression der ECM durch die expandierende Sphäroid hinterlegt.
Tumorwachstum und die Matrix-Invasion Ereignisse wurden über 4 Tage überwacht. Zwei Bereiche wurden mit entweder keinen Nachweis invasiver Zellen in der Tumorperipherie oder ausgeprägte Nachweis der eindringenden Zellen (Figur 3C) gekennzeichnet. PTM Messungen wurden bei den Regionen 1 und 2 in 4 Tagen. Am Tag 4, gab es einen signifikanten Unterschied in der G '(bei 1 rad / s angegeben) zwischen den beiden Bereichen (Fig. 3D). Frequenzabhängige Messungen von G 'und G "für die Regionen 1 und 2 an Tag 4 zeigen deutliche Erweichung des ECM in Region 2, der invasiven Bereich (3E). Am Tag 4 Region zwei Exponaten einen flüssigkeitsähnlichen viskoelastischen Reaktion, offensichtlich durch viskose Skalierung des G "Grundstück (3E).
Repräsentative suboptimalenErgebnisse von experimentellen und gemeinsamen Analysefehler sind in Abb. 4 gezeigt. vielleicht offensichtlichste Fehlerquelle liegt in der Stabilität der Einrichtung, auf dem Video-Mikroskopie durchgeführt. Wenn der Laborbank verschoben wird, oder wenn es eine andere externe Quelle von Vibrationen, können Wulst Trajektorien künstlich beeinflußt werden, was zu einer Drift in den Daten resultiert. Drift bewirkt, dass der MSD drastisch bei hohen Latenzzeiten zu erhöhen (4A), die auch bewirkt, dass die G '(ω) und G "(ω) berechneten Werte stark bei niedrigen Frequenzen (4B) zu erhöhen. Drift kann durch die Verwendung eines Druckluftpolsterlaborbank reduziert werden und einfach durch die Betreuung, um das Setup nicht stoßen, während Videos aufgezeichnet werden. Zusätzlich kann Drift bei der Nachbearbeitung mit Software-Routinen entfernt werden. Diese Routinen werden zur Entfernung von Drift, die annähernd gleichmäßig über ein bekanntes Zeitintervall. Unregelmäßige Drift (vielleicht verursachtdurch Anstoßen der Bühne während der Datenerfassung) ist problematischer. Deshalb ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Probe mechanisch isoliert von der Umwelt während der Datenerfassung bleibt.
Eine weitere mögliche Quelle der unklaren Ergebnisse geht, die durch unsachgemäße Auslegung der Probe Heterogenität. Obwohl die Fähigkeit, in einer Probe zu beobachten und zu quantifizieren, räumliche Heterogenität ist in der Tat eine der Stärken hingewiesen PTM 26 (und etwas, das in der traditionellen Groß Rheologiemessungen verloren geht), kann eine unsachgemäße Gruppierung von Clustern von Sonde Trajektorien zu falschen Schlussfolgerungen führen. Da die Änderungen im ECM Steifigkeit mit dieser Methode berichtet inhärent heterogen, da das Material selbst, in einem bestimmten Sichtfeld, könnte es einige Tracer-Sonden, die nicht elastisch von Kollagenfasern beschränkt sind und somit frei erkunden stochastisch größer Wasser gefüllten Poren (Fig. 4C). Diese "lose"-Sonden zeigen mobility etwa im Einklang mit einer rein viskosen Umgebung. Da die Daten für alle Sonden gemittelt vor viskoelastischen Module berechnet werden, kann mit ein paar lose Sonden in einem bestimmten Stichprobenregion (field of view) frequenzabhängige Grund G * (ω), die stark variieren (4D) zu produzieren.
Unsachgemäße Softwarekalibrierung kann während der Videosammlung und-analyse zu Fehlern führen. Während der Videodatensammlung, ist es wichtig, die Intensität Histogramm beobachten, und stellen Sie die Belichtungszeit, um den größten Dynamikbereich möglich zu geben, während sichergestellt wird, dass das Bild nicht gesättigt zu werden. Die Analyse berechnet raffinierte Mittelpositionen für jeden Tracer-Sonde durch die Integration der Intensitätswert eines jeden Pixels. Wenn das Bild gesättigt ist, wird diese Integration weniger genau aufgrund einer Rubrik "Flat-Top" des Intensitätsprofils sein. Darüber hinaus ist die Funktion Befund Kalibrierung ein äußerst wichtiger Schritt bei der Sicherstellung genaue Ergebnisse. Die richtige Wahl der Auswahlparameter im Vordergrund steht. Dieser Prozess ist weitgehend von Crocker und Grier 42, Savin und Doyle 43, und andere beschrieben.
Fig. 1 ist. Schema Experimentelles. (A) Tumorsphäroide auf Agarose Betten gebildet, und dann in eine 3D-Matrix mit eingebetteten Tracer Sonden übertragen. (B) Videodaten werden an mehreren Punkten innerhalb der Probe entnommen und sowohl benachbart zu und entfernt von dem Tumor Sphäroid. (C) Der stochastische Bewegung der Sonden in jedem Video wird, um die lokalen rheologischen Eigenschaften der Matrix bei jedem Abtastpunkt zu bestimmen. Diese Daten werden in einer räumlichen Zuordnung von ECM-Steifigkeit der gesamten gut zusammengestellt.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Überprüfung der Messungen. (A) Die Komponenten von G * (ω) werden hier gezeigt. Die berechneten Werte von G '(ω) und G "(ω) unter Verwendung PTM sind sehr ähnlich zu denen über einen Groß Rheometer erhalten. (B) 5 ul Dispase wurde in die Mitte eines gut mit dem Radius r = 8,5 mm, das 1,0 mg / ml Kollagen, um räumliche Änderungen in G * (ω) zu messen aufgenommen. (C) Die berechneten Werte von G '(ω) und G "(ω) an der Stelle der Injektion Dispase, 1,5 mm von der Stelle, und 3 mm von der Stelle. Zusätzlich wurde eine Kontrollmessung in einer Vertiefung, die die gleiche Kollagengel gemacht but ohne Dispase Behandlung. In der Nähe der Behandlungsstelle G '(ω) kleiner ist als G "(ω). Wie das Gel weiter von der Behandlungsstelle die Werte von G 'abgetastet (ω) größer ist als G "(ω), und der Betrag von G * (ω) zunimmt. Die Messungen wurden 2,5 Stunden nach der Injektion entnommen Dispase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Quantifizierung der Veränderungen in der ECM Rheologie gleichzeitig mit Beginn der lokalen Matrix-Invasion. (A) Die Vertiefung, die eine PANC-1-3D-Sphäroid an mehreren Standorten in der Kollagen-ECM um den Tumor untersucht. (B) Koordinatendaten mit c kombinierterechnet G '(ω) für jeden Standort eine räumliche ECM Steifigkeit Karte herzustellen. (C) Das Tumorwachstum und Invasion Verhalten wurden über 4 Tage überwacht. Zwei Regionen wurden als mit entweder keine Interaktion mit eindringenden Zellen (Bereich 1, blaue Sternchen) oder Schwer Interaktion mit eindringenden Zellen, die spontan aus dem großen Haupt vielzelligen Sphäroid Masse (Region 2, rotes Sternchen) verzweigt identifiziert. (D) Die rheologischen Messungen wurden bei den Regionen 1 und 2 in 4 Tagen. Am vierten Tag gab es einen signifikanten Unterschied in der G '(bei 1 rad / s angegeben) zwischen den beiden Regionen. (E) Frequenzabhängige Messungen von G '(ω) und G "(ω) für die Bereiche 1 und 2 am Tag 4 zeigen signifikante Erweichung des ECM bei Bereich 2 genau mit der Anwesenheit von invasiven Populationen korreliert. G '(ω) und G "(ω)-Werte berechnet mit einem Potenzgesetz fit zu MSD-Daten gezeigt, wie gefüllte und ungefüllte Punkt resziehungs. Am Tag 4 Region zwei Exponaten eine flüssigkeitsähnliche viskoelastischen Reaktion wie sich durch viskose Skalierung des G "(ω) Handlung und der Abwesenheit von der Passlinie für G '(ω). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.
Abbildung 4. Daten aus sub-optimale Ergebnisse durch Drift und falsche Interpretation von ECM Heterogenität. (A) Die MSD eines Tracers Sonde in einem komplexen Material beschränkt Potenzgesetz folgt Skalierung <&Dgr; 2 (τ)> ~ τ α (0 ≤ α ≤ 1). Dementsprechend sollte MSD Werte ein Plateau bei langen Verzögerungszeiten nähern. Drift in der Probe künstlich beseitigen dieses Verhalten, leading eskalierenden MSD-Werte bei langen Verzögerungszeiten. (B) Die lange Zeitverzögerung Drift in der MSD werden die Werte von G führen '(ω) und G "(ω) in kurzen Frequenzen deutlich fehlerhaft geworden. Drift kann entweder durch Sicherstellung, dass die Probe mechanisch während der Datensammlung isoliert oder unter Verwendung von Software-Routinen, um eine Drift während der Analyse zu entfernen beseitigt oder verringert werden. (C) Auch in einem kleinen Sichtfeld können zwei verschiedene Sorten von Sonde Bahnen vorhanden sein. In diesem Beispiel sind die meisten der Sonden in der Matrix eingeschlossen, aber einige sind "lose" - deren Trajektorien sind viel weniger eingeschränkt. (D) Der Versuch, MSD Daten sowohl mit und ohne Neben Sonden in der gleichen Zeit ohne richtige Interpretation der Proben Heterogenität Messungen der viskoelastischen Module verwechseln interpretieren. Bitte click Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
In diesem Protokoll führen wir eine robuste und breit anwendbare Strategie für längs Tracking lokale Änderungen in ECM Steifigkeit in 3D-Tumormodellen. Wir stellen uns vor, dass diese Methodik könnte durch Krebs Biologen und Biophysiker interessiert mechanosensitive Verhalten in Matrixumbau bei Tumorwachstum und Invasion Prozesse verwickelt angenommen werden. Präzise Quantifizierung der Matrix Abbaukinetik kann besonders für diejenigen, die Untersuchung der Aktivität von Matrix-Metalloproteasen, Lysyloxidase oder andere relevante biochemische Spezies in 3D-Tumormodellen, die direkt mit den Matrixumbau verknüpft sind. Über die Anwendung von 3D-Tumormodellen hier beschrieben, könnte man sich vorstellen, die weitere Umsetzung dieses Ansatzes in Verbindung mit anderen Krankheitsmodell Systeme, in denen Modifikation der Matrix Rheologie über die Zeit spielt eine wichtige Rolle 46,47. Die Nützlichkeit dieses Verfahrens weiter durch Software-Verbesserungen gesteigert werden, daß weitere Automatene die Verfahren und damit für erhöhten Durchsatz Studien. Dies wird zunehmend detaillierte Momentaufnahmen von der physischen Landschaft der viele Proben gleichzeitig für den Einsatz in Multi-Well-Format führen.
Hier wir speziell auf die Implementierung von passiven Partikelverfolgungs Mikrorheologie 3D-Tumormodelle, die zur Messung der linearen viskoelastischen Reaktion im Bereich von gut geeignet ist ~ Zehn Pascal typisch für im Handel erhältliche Produkte der extrazellulären Matrix (Kollagen, EHS-Tumorextrakten oder kommerzielle Nanofasergerüste). Die Beobachtung von stochastischen, thermisch angetriebene Bewegung, auch mit hoher numerischer Apertur Optik auf kleine Sonde Verschiebungen zu quantifizieren, ist von Natur aus auf den linearen Bereich dieser relativ weichen ECM-Umfeld beschränkt, sondern die Ermittler in dem Wunsch, mehr starren Materialien untersuchen können dieses Protokoll anzupassen für die Verwendung mit aktiven Manipulationen über optische oder magnetische Fang 48 49 von Sonden. Since die optischen oder magnetischen Pinzette Sonde einen einzelnen Punkt in einer Probe und beeinflussen nicht die Integrität der Probe könnten diese Techniken möglicherweise in dem obigen Protokoll integriert werden, um Messungen des Längs steifere Proben zu erhalten.
Es ist wichtig zu beachten, dass andere Zelle erzeugten Kräfte können auch an Tracer Sondenbewegungen zu verschiedenen Zeitskalen beitragen. Beispielsweise bei der Zellmigration im Laufe von Stunden und Tagen in Kultur auftritt, Gruppen von Sonden geschoben und gezogen durch Zellbewegungen und es ist in der Tat, dass diese Bewegung in Traktionskraftmikroskopie 50,51 verwendet wird. Die thermisch angetriebene Sonde Bewegungen, die analysiert werden, um Daten zu erhalten Mikrorheologie statt in der Größenordnung von Sekunden, eine klar trennbare Zeitskala. Zwar ist es auch wahr, dass die langsameren Dynamik der Belastungen mit Traktionskräfte verbunden sind, können lokale Änderungen in der Rheologie 36, einer Stärke von diesem Abbildungs-b beitragenased Ansatzes liegt in der Fähigkeit, visuelle und rheologische Veränderungen in der Probe korreliert. Beispielsweise in den repräsentativen Ergebnissen in Fig. 3 offensichtlich Matrixinvasion und Zellmigration Ereignis mit einer Änderung von G 'fast vier Größenordnungen in der Zeit diese Migration erfolgt korreliert.
Das hier beschriebene Protokoll nimmt an, dass Nutzer Zugang zu einem Mikroskop mit einer motorisierten Stufe, reproduzierbare Positionierung der Probe liefert. Labs, die nicht diese Instrumente haben könnte immer noch Punktmessungen mit Markierungen oder andere visuelle Hinweise in der Probe oder Probenträger auf wiederholte Messungen an der gleichen Stelle zu ermöglichen, obwohl es wahrscheinlich schwierig sein, wie in der Abbildung gezeigt, um die gleiche Reproduzierbarkeit bei der Positionierung zu erreichen repräsentativen Längsschnittmessungen hier. Wurde für die Zwecke dieser repräsentativen obigen Ergebnissen Positionieren auf der z-Achse in etwa konstant gehalten. Doch das Protokoll could geändert werden, um zusätzliche Messungen entlang der z-Achse, um eine 3D-rheologischen Karte von der Probe zu erstellen sind. Das Verfahren könnte auch so modifiziert werden, um ein konfokales Laser-Scanning-oder Multiphotonen-Techniken ein für 3D-Schneiden obwohl Scan-Geschwindigkeiten würde eine Beschränkung auf den oberen Frequenzgrenzen zugänglich, das kann oder nicht problematisch sein kann für eine bestimmte Anwendung zu verhängen zu nutzen.
In diesem Verfahren wird ein erheblicher Zeitbeschränkung durch die Notwendigkeit der Rück lebenden Zellen in den Inkubator eingeführt. Ohne eine Zeitraffer-Wetterstation Gehäuse für Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO 2 Ebenen zu steuern, müssen Bildaufnahmezeit minimiert werden. Auch mit der richtigen Ausrüstung, nimmt der Datenerhebung bis große Mengen an Zeit und digitale Speicher, der sowohl unter praktischen Grenzen sind. Zum Beispiel mit Mikroskop und Kamera in dieser Studie verwendet, würde es rund 35 Stunden dauern, bis die rund 4.000 Videos erforderlichen Maßnahmen, um eine einzige gut auf einer Karte 96-Well-Platte mit einem 100X-Objektiv ohne Leerzeichen zwischen Sichtfelder. Diese Faktoren legen der Anzahl der Datenpunkte, die realistisch gesammelt werden können. Der Detailgrad ist daher unter den Sachzwängen durch die Zeit für die Datenerfassung, Datenspeicherplatz und die Verfügbarkeit eines Umwelt Gehäuse verfügbar auferlegt.
Die Fähigkeit, Änderungen in ECM Rheologie quantifizieren kann ferner neben bildbasierte Verfahren zur Quantifizierung der therapeutischen Antwort in 3D Tumormodellen 17,18,52,53 integriert werden. Die bei beiden Verfahren angenommen Multi-Well-Kultursystem 3D-Modell schlägt vor, eine parallele Implementierung Bereitstellen Korrelation zwischen zytotoxischen Reaktion und Modifikation der mechanischen Umgebung. Dies könnte die Entwicklung weiterer Strategien, die explizit Ziel der mechanischen Phänotyp oder erläutern die Auswirkungen der bestehenden Therapeutika in dieser Eigenschaft zu erleichtern. Solche Erkenntnisse könnten unmittelbar relevant für eine seinpproaches Drug Delivery durch dichten Kollagenreichen Tumor Stroma zu verbessern. Beispielsweise im Rahmen der repräsentativen Darstellung dieses Protokoll vorgestellt hier mit Pankreas in vitro-Tumormodellen, die Auswertung der Matrixabbau folgende Maßnahmen könnte in Screening Stromazellen Verarmungsschemata, eine zunehmend wichtige therapeutische Paradigma für Bauchspeicheldrüsenkrebs 54 verwendet werden.
The authors declare that they have no competing financial interests.
Wir danken für die Open-Source-Nutzung von MATLAB Partikel-Tracking-Code von Maria Kilfoil vorgesehen ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), zusammen mit dem früheren IDL-Code und eine umfangreiche Dokumentation von John C. Crocker und Eric bereitgestellt R. Weeks. Diese Arbeit durch Mittel aus dem National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 und R00CA155045 (: JPC PI) ermöglicht.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Bovine type 1 collagen | BD Biosciences, San Jose, CA | 354231 | |
PANC-1 | American Type Cell Culture, Manassas, VA | CRL1469 | or other appropriate cell type |
Fluorescent Microspheres | Life Technologies, Carlsbad, CA | 906906 | |
Matrigel | BD Biosciences, Bedford, MA | 354230 | |
Agarose | Fisher Bioreagents, Waltham, MA | C12H18O9 | |
NaOH | Fisher Bioreagents, Waltham, MA | NC0480985 | |
96-well Imaging plates | Corning Inc., Corning, NY | 3904 | |
DMEM | Hyclone, Waltham, MA | SH30243.01 | or appropriate cell culture media |
Zeiss AxioObsever Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | includes high-speed camera and imaging software | |
MATLAB software | The Mathworks, Natick, MA |
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