Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm ^{- / - E - / - Ratos}

Neste vídeo mostramos um protocolo para estabelecer linhagens de células do timo de rato linfoma. Ao seguir este protocolo, conseguimos estabelecer várias células T linhas de Atm-/ - e p53-/ - ratos com linfoma tímico.

As linhas celulares são uma ferramenta de pesquisa fundamental que pode reduzir o uso de animais de laboratório em pesquisa. Certas cepas de camundongos geneticamente modificados, tais como ATM ^{- / -} e p53 ^{- / -} consistentemente desenvolver linfoma tímico no início da vida ^1,2, e, portanto, pode servir como uma fonte confiável para a derivação de células T murino linhas. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para o desenvolvimento do timo murino estabelecida linfoma de células T linhas sem a necessidade de adicionar interleucinas, conforme descrito nos protocolos anteriores ^1,3. Tumores foram colhidas de camundongos com idade entre três a seis meses, na primeira indicação de tumores visíveis a partir da observação da postura arqueada, trabalhou preparação respiração, pobres e desperdício em um ^1,4 linhagem suscetível. Nós temos estabelecido com sucesso várias linhas de células T usando este protocolo e de estirpes puras e Atm ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] ² e p53 ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] ⁵ camundongos. Nós ainda demonstram que mais de 90% do estabelecido população de células T CD3 expressa, CD4 e CD8. Consistente com linhas de células de maneira estável estabelecida, as células-T gerados usando o protocolo presentes foram várias passagens por mais de um ano.

1. Dissecação de Tumor

1. Para dissecção do tumor, uma toalha de papel ou panos cirúrgicos descartáveis ​​é colocado na plataforma de dissecção e pulverizadas com etanol 70%.
2. Camundongos para este protocolo são rotineiramente submetidos à eutanásia com CO _2. Posicione o mouse sacrificados no teclado dissecção e spray de ambos os lados do animal com o etanol. O mouse é mantida no lugar sobre o bloco dissecção por meio de quatro ou mais alfinetes inseridos através das pernas e pulverizado completamente com álcool 70%.
3. A pele sobre a linha média é cortado a partir do púbis até a base da cabeça usando uma tesoura esterilizada, evitando-se os músculos subjacentes e penetrando nas cavidades do corpo.
4. Abrir a cavidade abdominal com um novo par de tesouras e pinças esterilizadas, tomando cuidado para não danificar os órgãos internos.
5. Abrir a cavidade torácica dissecando e desviando a caixa torácica para revelar o tumor, sem danificar os vasos sanguíneos.
6. Separar o tumor de outros órgãos, e de transferência de um pedaço de aproximadamente 40-50% do total do tumor (cerca de até 1,5 X 0,8 X 0,8 cm) em PBS frio mantidos em gelo.
7. A parte restante do tumor podem ser guardadas para outros ensaios e uma necropsia completa pode ser realizada neste momento.

2. Linfoma de células de cultura

1. Pulverizar o tubo que contém o tumor dissecados com etanol 70% e transferir para um armário de biossegurança.
2. Adicionar 10 mL de meio de cultura para um 150 milímetros ² placa de Petri estéril.
3. Transferir a peça de tumor na placa de Petri por sucção suave, com uma pipeta.
4. Dobre duas agulha estéril 18 voltada para o lado chanfrado para fora.
5. Dissociar o tumor usando a agulhas tortas.
6. Redemoinho do prato, bata suavemente e coloque em um ângulo para coletar a suspensão de célula para um lado, evitando grandes pedaços de tumor.
7. Aspirar a suspensão celular e transferir para um tubo cônico de 50 mL, evitando grandes pedaços de tumor.
8. Lave a placa com 10 mL de médio e transferência para o mesmo tubo, evitando grandes pedaços de tumor.
9. Misture a suspensão de células composto por linfócitos e células do estroma delicadamente e transferir 5 mL para um balão de cultura de tecidos T-25 e 10 mL em um T-75 frasco de cultura de tecidos. Agite suavemente os frascos.
10. Use a suspensão de células restantes para fazer 2, 4, 10100 e 1000 diluições em 2,5 mL de volume final (a cultura de células em densidades diferentes, utilizando vários tipos de embarcações cultura maximiza a probabilidade de estabelecer uma linha de células T).
11. Placa de 2,0 mL de cada diluição em poços individuais de uma placa de 6 poços. Agite ligeiramente a placa.
12. Incubar as células por 48 h em atmosfera umidificada CO ₂ no ar.

3. Alimentando células de linfoma

1. Após 48 h de incubação, adicionar 5 mL de meio para o balão de T-25 e 10 mL de meio para o balão de T-75 ao longo da parede com o mínimo de perturbação das células.
2. Adicionar 2 ml de meio em cada poço da placa de 6 poços ao longo da parede com o mínimo de perturbação das células.
3. Incubar as células para um adicional de 72 h.

4. Passaging Células Linfoma

1. Passagem inicial
   1. No final do quinto dia de incubação, as células são várias passagens na proporção de 1:1, mantendo os frascos originais e placas (manutenção da densidade das células a uma concentração de cerca de 3x106 mL / durante as passagens de primeira promove a criação bem sucedida de um linhagem celular contínua).
      1. Para o balão T-25, a transferência de 5 mL da suspensão celular para um balão novo contendo 5 mL de meio. Adicionar 5 ml de meio para o balão original.
      2. Para o balão T-75, a transferência de 10 mL de suspensão celular para um balão novo contendo 10 mL de meio. Adicionar 10 mL de meio para o balão original.
      3. Para a placa de 6 poços, a transferência de 2 mL da suspensão de células de cada poço em poços correspondente de um novo prato contendo 2 mL de meio em cada poço. Adicionar 2 ml de meio em cada poço dos poços original.
   2. Incubar todos os frascos e as placas por mais 72 h. Em nossa experiência mais linhas de células são estabelecidos a partir destes uma passagem culturas (a presença de agregados celulares frouxamente aderido a suspensão sobre as células do estroma anexado é uma indicação precoce de uma linhagem celular).
   3. Para as culturas com menos ou nenhuma agregados celulares frouxamente aderente suspensão, alimentar os frascos ou placas com cuidado substituindo cerca de 50% do meio de cada 72 h Para evitar a remoção de células da cultura original, vasos cultura ficam em pé e em repouso por pelo menos 5 min para que o sedimento de células na parte inferior por gravidade, antes de ligeira aspiração do meio sobrenadante.
2. Manutenção de linhas celulares estabelecidas
   1. Linhagens de células estabelecidas são várias passagens em frascos novos e placas. Para T-25 e T-75 frascos, adicionar 5 mL do original oususpensão uma passagem em 5 mL de meio. Para 6-bem pratos, adicionar 3 mL da suspensão de células original ou uma passagem em 7 mL de meio em um frasco T-25. Alimentar e manter o original ou uma passagem de cultura, substituindo o volume removido com meio de cultura fresco.
   2. Passagem linhagens estáveis ​​de células em novos frascos T-25. As linhas de células têm um tempo de duplicação de 18-24 h. As culturas são rotineiramente mantidos a uma densidade de 1-3x106 mL / e várias passagens a cada 3 dias. Adicionar o volume necessário de passagem da cultura anterior para novo meio para fazer até 10 mL. Alimentar e manter a cultura original.
   3. Depois de algumas passagens, as células não aderentes se auto sustentar sem a células aderentes do estroma e um número menor de células aderentes são transportados a cada passagem. Além deste ponto, as culturas podem ser mantidas em cultura de tecidos não-tratados T-25 frascos.

5. Congelamento e Recuperação de linhagens de células linfoma

1. As linhas celulares são congelados em preparados na hora RPMI 1640, contendo 20% FBS e DMSO 10%.
2. Células de uma cultura de idade em 48 h T-25 frasco (cerca de 1.5x10 ⁶ células / mL) são centrifugadas a 1500 rpm por 5 min à temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante, as células são ressuspensas em 2 mL de meio de muito frio. Dois volumes 1,0 mL de suspensão celular de cada frasco são colocados em frascos de congelamento, imediatamente congeladas a -80 ° C, e transferidos para o nitrogênio líquido no dia seguinte.
3. Células são recuperados a partir de armazenamento de nitrogênio líquido por descongelamento rápido e ressuspender o conteúdo em 10 mL de meio de cultura fresco. Alternativamente, as células recém-descongelado são lavadas uma vez em meio de cultura morna para retirar o DMSO antes de ressuspender em 10 mL de meio de cultura fresco. As células são cultivadas por pelo menos 72 h antes da passagem subsequente.

6. Resultados representante

Um Atm ^{- / -} células T-line desenvolvido utilizando este protocolo e designado DWJ-Atm-1 foi caracterizada por coloração com anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC e anti-CD8-PE e análise de citometria de fluxo (Figura 1). Mais de 90% das células T-CD3 foram, CD4 e CD8 triple-positivo.

Figura 1. Caracterização de uma linha de células T desenvolvido utilizando este protocolo.

Os marcadores de superfície celular de um Atm estabelecida ^{- / -} linha de células designadas DWJ-Atm-1 foram caracterizados por coloração com anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE e análise de citometria de fluxo. Resumidamente, 1X10 ⁶ células frescas foram lavadas uma vez em PBS fria (1500 rpm / 5 min), e incubadas a 4 ° C por 10 min com 200 mL de coquetel de anticorpos (cada anticorpo na diluição de 1:200 em PBS com BSA 1%. As células podem ser examinados imediatamente, enquanto fresca ou fixo para análise posterior. células fixas são preparadas pela adição de formalina tamponada neutra a uma concentração de 4% (vol / vol) final e incubadas a 4 ° C por 30 min, colhidas por centrifugação (1500 rpm / 5 min) e ressuspendidas em 200 mL de PBS com BSA 1%. Um total de 1 X 10 ⁴ células foram analisados ​​usando um BD FACS Calibur analisador e CellQuest software (BD Biosciences, San Jose, CA).

Neste protocolo, nós fornecemos os procedimentos detalhados para estabelecer murino de células T linhas de dois genótipos diferentes do mouse; Atm ^{- / -} [FVB/N- Atm ^tm1Led / J] p53 e ^{- / -} [129/S6- Trp53 ^tm1Tyj / J] . Usando esse protocolo, um total de 6 (de 7 tentativas) Atm ^{- / -} e três (de 5 tentativas) p53 ^{- / -} murino de células T linhas foram estabelecidas em nosso laboratório. Dados representativos demonstrando que linhagem de células-DWJ Atm-1, um Atm ^{- / -} linha celular consiste de uma população de células em que mais de 90% das células CD3 expressar, CD4 e CD8 marcadores de superfície confirmar que a linha de células T clonal pode ser estabelecida utilizando nosso protocolo.

Desenvolvimento de murino de células T tem sido relatada linhas ^3,6,7, no entanto, protocolos detalhados para estabelecer estas linhas não têm sido descritos anteriormente. Apesar de apenas dois genótipos de rato foram utilizadas para a derivação de células T murino linhas no nosso laboratório, acreditamos que esses procedimentos são aplicáveis ​​a uma ampla gama de espontânea linfomas de células T encontrada em outras linhagens de camundongos, como Kras com defeito e, potencialmente, outras espécies animais. Murino de células T-lines têm aplicações potenciais em compreender questões básicas em imunologia e oncologia. Atualmente, estamos usando essas linhas celulares em estudos que visam caracterizar Interações Hospedeiro-Patógeno e genotoxin citotoxicidade induzida incluindo mecanismos de parada do ciclo celular e apoptose. Dado que murino de células T-lines partes alterações genômicas, tais como exclusões de PTEN e FBXW7 em comum com aguda de células T humanas leucemias linfoblástica e os linfomas, que são particularmente adequados para a pesquisa em biologia do câncer ^8, e pode ter outras aplicações para a pré rápida -clínica de triagem eficácia imunológica e câncer de agentes quimioterápicos in vitro. Ou não essas linhagens de células podem ser propagadas in vivo em camundongos ou singeneicos ou imunocomprometidos não foi determinada.

Em contraste com protocolos anteriores em que estabelecimento bem sucedido de uma linha de células T levou até três meses, ^{6 de} linhagens de células desenvolvidas utilizando o protocolo atual foram estabelecidas dentro de um mês (entre passagem 2-8). Descobrimos que a presença de agregados celulares frouxamente ligados aderente sobre células do estroma é uma indicação crítica precoce de uma linhagem celular. A fim de permitir murino células T para propagar indefinidamente, também descobrimos que é importante deixar o inicial agregados celulares frouxamente aderente imperturbável durante as mamadas. Além disso, a manutenção da densidade das células a uma concentração de aproximadamente 3x10 ⁶ mL / durante as passagens de primeira também promove a criação bem sucedida de uma linha contínua de células. Em nossa experiência, a cultura de células em densidades diferentes, utilizando vários tipos de embarcações cultura maximiza a probabilidade de estabelecer uma linha de T-cell. A maioria das linhas de células T foram estabelecidas a partir de T-75 ou 6 frascos bem-pratos e 10 ou 100 diluições que correspondem a cerca de ⁷ ou 1x10 1x10 ⁶ células / mL. Um protocolo anterior recomendou a cultura de células de 5 x 10 ^6, 1 x10 ^7, e 2 x 10 ⁷ células por poço em 6 bem-pratos, e alimentação após 7 dias (7). Observou-se que a alimentação culturas iniciais em 48 horas e passagem 72 h depois, no dia 5 é o ideal. Esperar mais tempo antes da primeira alimentação e passagem fará com que as células perdem a sua viabilidade e param de se dividir.

O último parâmetro que encontramos é crucial para a propagação bem sucedida de células-T murino in vitro é a presença de FBS no meio de cultura que pode suportar o crescimento celular rápido. Diferentes lotes e fornecedores de FBS devem ser rastreados antes de iniciar a derivação de linhas de células T para a identificação de um reagente apropriado. Se murino de células T linhas não estão disponíveis para o rastreio, culturas primárias de linfócitos timo colocados em poços de uma placa de 24 poços na concentração de 1x10 ⁶ por ml de meio de teste contendo concanavalina A (1μg / mL) para estimular o crescimento celular rápida é adequada. Na presença de uma fonte ideal de FBS, o número de células deve dobrar a cada 18-24 h.

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Boris Reizis do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade de Columbia para discussões úteis. Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell e Deequa Mahamed do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina Veterinária, da Universidade Cornell de assistência técnica com citometria de fluxo e Lu Huang para obter ajuda com edição de vídeo. Os autores também desejam agradecer aos membros do Duhamel e laboratórios Weiss para a sua revisão crítica do manuscrito e produção de vídeo, e Stephanie Yazinski do laboratório Weiss para reprodução e genotipagem p53 ^{- / -} ratos. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Cornell University Animal Care Institucional e Comitê de uso. Esta pesquisa foi suportada em parte por fundos fornecidos pelo Departamento de Agricultura dos EUA, Pesquisa do Estado de Cooperativa, Educação e Serviço de Extensão da Saúde Animal, e Programa de Pesquisa de Doenças (para GED e RSW) e subvenções NIH R03 HD058220 e R01CA108773 (para RSW). O vídeo foi produzido usando in-house instalações pelo pessoal dos laboratórios Duhamel & Weiss.