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在这个视频中,我们展示了一个协议来建立小鼠胸腺淋巴瘤细胞株。通过这个协议,我们已经成功地建立了几个从ATM / T细胞线 - 和p53 - / - 小鼠胸腺淋巴瘤。
建立的细胞系是一个重要的的研究工具,它可以减少使用实验动物的研究。某些菌株的转基因小鼠, 如 ATM - / - 和 p53 - / -胸腺淋巴瘤不断发展早在生活中1,2,因此,可以作为一个可靠的来源小鼠T细胞株的推导。在这里,我们建立了小鼠胸腺淋巴瘤的T细胞系的发展,而不需要添加白细胞介素1,3以前的协议来描述一个详细的协议。从年龄在3至6个月的小鼠肿瘤收获,最早表现的基础上,弯腰驼背的姿势观察可见肿瘤,呼吸困难,穷人疏导,并在敏感品系1,4浪费。我们已经成功地建立了几个使用此协议的T细胞系和近交系的自动取款机- / - [FVB/N- 自动柜员机tm1Led / J] 2 和p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5只。我们进一步表明,既定的T细胞的人口超过90%表示CD3,CD4和CD8。与稳定建立的细胞株,使用本议定书所产生的T细胞已传了一年多。
1。肿瘤剖析
2。培养淋巴瘤细胞
3。饲养淋巴瘤细胞
4。传代淋巴瘤细胞
5。冻结和恢复淋巴瘤细胞株
6。代表性的成果
自动取款机- / - T细胞线使用此协议,并指定DWJ - ATM - 1与抗CD3 - FITC,抗CD4 - APC和抗- CD8 - PE和流式细胞仪分析(图1)染色的特点。超过90%的T细胞,CD3,CD4和CD8 +三重阳性。
图1:使用该协议所开发的T -细胞系的表征。
/ - -建立ATM的细胞表面标记的细胞株指定DWJ - ATM - 1的特点是染色与抗CD3 - FITC,抗CD4 - APC,抗- CD8 - PE和流式细胞仪分析。简单地说,1X10 6新鲜细胞清洗一次冷PBS(1500转/ 5分),孵育4 ° C为10分钟与200μL抗体鸡尾酒(每个抗体1:200稀释1%BSA的PBS。细胞可以立即进行检查,而新鲜或固定为以后的分析。固定细胞准备加入缓冲的福尔马林在中立在终浓度为4%(体积/体积),并在4 ° C孵育30分钟,离心收获,(1500转/ 5分钟),重悬于200μL1%BSA的PBS。共1 × 10 4细胞进行了分析使用BD流式细胞仪刀魂分析仪和CellQuest软件(BD公司,加利福尼亚州圣何塞) 。
在这个协议中,我们提供了详细的程序,建立从两个不同的鼠标基因型的小鼠的T 细胞系;自动取款机- / - [FVB/N- ATM tm1Led / A]和p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J]。 。通过使用这个协议中,共有6(满分7次尝试)自动取款机- / -三(5次尝试)P53 - / -小鼠的T细胞系已经建立在我们的实验室。 / - -证明该细胞系DWJ - ATM - 1,ATM细胞株有代表性的数据由一个细胞的人口,其中大于90%的细胞表达CD3 +,CD4和CD8表面标记证实,克隆的T细胞可使用我们的协议成立。
小鼠T细胞系的发展有报道 3,6,7;然而,为建立这些线路的详细协议并没有被描述以前。虽然只有两个鼠标基因型在我们的实验室小鼠的T细胞线的推导,我们相信,这些程序适用于自发T细胞淋巴瘤,其他如KRAS基因缺陷的小鼠品系中的一个广泛,以及其他可能动物物种。小鼠T细胞株有潜在的应用理解在免疫学和肿瘤学的基本问题。目前,我们正在利用这些细胞株在宿主 - 病原体相互作用和genotoxin细胞毒作用,包括细胞周期停滞和细胞凋亡的机制特征的研究。鉴于小鼠T细胞株的份额,如PTEN和FBXW7缺失的基因的改变与人类T细胞急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤共同,它们特别适合于研究在癌症生物学8,并可能有进一步的应用,快速前在体外免疫学和癌症化疗药物的临床疗效筛选。无论这些细胞株,可在同源或免疫功能低下小鼠体内传播尚未确定。
对比以前的协议,其中的T -细胞系成功建立了3个月6个,开发利用当前协议的细胞株,建立在一个月内(通过2-8之间) 。我们发现,存在较松散贴壁细胞附着的基质细胞聚集建立的细胞株是一个重要的的早期迹象。为了让小鼠T细胞能无限期地传播,我们也发现,重要的是,离开最初的松散贴壁细胞聚集在喂食不受干扰。此外,在第一段落的细胞密度维持在约3X10 6 /毫升的浓度,还促进成功地建立了一个连续的细胞株。根据我们的经验,在使用几种类型的文化船只的不同密度的培养细胞,建立一个T -细胞株的可能性最大化。大多数T细胞系建立了从T - 75培养瓶或6孔板和10或100倍稀释,这对应约1 × 10 7或1 × 10 6细胞/ ml 。一个先前的协议,建议在5 × 10 6,7,1 X10和2 × 10 7 6孔板每孔细胞培养细胞,喂养后7天(7)。我们观察,初步培养后48小时,并通过72小时喂5天,是最佳的。不再等待前一次投料和通过,将导致细胞失去其可行性,并停止分裂。
最后一个参数,我们发现,在体外对小鼠T细胞成功繁殖的关键是,可以支持快速的细胞生长在培养基中的FBS。 FB的不同地段和供应商应开始前确定一个合适的试剂T细胞系的推导的筛选。如果小鼠T细胞株筛选,水井24孔板放置在浓度为1 × 10 6每毫升含有刀豆蛋白A(1μg/毫升),以刺激细胞快速增长试验介质的胸腺淋巴细胞的主要文化是足够的。在FB的最佳来源存在,细胞的数量应该增加一倍每隔18至24小时
作者衷心感谢鲍里斯Reizis在哥伦比亚大学的微生物学和免疫学系博士的有益讨论。我们也希望在康奈尔大学兽医学院,感谢冯富珍博士Bynoe,罗德曼Getchell博士和Deequa Mahamed从微生物学和免疫学系与流式细胞仪和视频编辑的协助下,黄路为技术援助。作者还希望感谢魏斯实验室杜哈明和魏斯实验室的成员,他们的手稿和视频制作,严格审查和斯蒂芬妮Yazinski育种和基因分型p53基因- / -小鼠。在康奈尔大学机构动物护理和使用委员会规定的准则和法规的规定进行动物实验。这项研究是由美国农业部部,合作国家研究,教育和推广服务,动物健康和疾病研究计划(GED和RSW)和美国国立卫生研究院拨款R03 HD058220和R01CA108773(RSW)提供的资金支持部分。视频制作杜哈明魏斯实验室的人员使用的内部设施。
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