이 프로토콜은 남성 방출 기반 모기 인구 억제 프로그램의 전제 조건인 남성 모기 짝짓기 경쟁력을 측정합니다. 이 피트 니스 기준 품질 관리 및 변형 평가의 일환으로 평가. 이 방법은 실험 시간을 90% 단축하고 두 개의 멸균 또는 울바키아 감염 라인 사이의 짝짓기 경쟁력을 직접 비교할 수 있게 합니다.
이 절차를 수행하는 것은 아이린 리와 켄 와이 막이 될 것입니다. 시작하려면, 그들의 크기 차이에 따라, pupal 단계에서 남성과 여성 모기를 섹스. 모기의 각 세트에 대 한, 양도 수 당 먹이 또는 로다민 B 자당 먹이에 대 한 미리 표시 된 케이지에 100 수 컷 pupae를 전송.
암컷 새끼를 케이지 당 40~50개의 작은 배치로 배치합니다. 이마고의 출현시, 수컷 모기의 존재를 케이지를 확인하십시오. 0.2% 로다민 B 자당 용액을 준비하려면 10% 자당 용액의 100 밀리리터당 로다민 B 파우더 200밀리그램을 녹입니다.
잘 섞어 모든 파우더가 용해되도록 합니다. 심지와 함께 설탕 피더 병 20병을 준비합니다. 10%의 자당 10밀리리터를 10개의 피더 병에 넣고 다른 10개의 피더 병에 0.2%의 로다민 B 자당 용액을 10밀리리터를 넣습니다.
5개의 피더 병을 준비된 모든 수컷 케이지에 넣고 결합 실험 전에 3일 동안 수컷 모기가 먹이를 줄 수 있도록 합니다. 수은 버너 램프와 스테레오 현미경을 켭니다. 수은 버너 램프에 광원을 허용하여 10분 동안 안정화합니다.
그런 다음 적색 형광 단백질 1을 위한 형광 필터를 설정합니다. 한 번에 소수의 모기를 구강 흡인기의 유리 튜브에 흡입합니다. 유리 튜브를 통해 형광 스테레오 현미경으로 수컷 모기의 신체를 관찰하십시오.
실험을 위해 로다민 B로 표시된 수컷 모기만 사용하십시오. 전송 세트 남성 모기 12 종이 컵 그물확보. 컵당 10개의 자당을 6컵에 넣고, 10개의 로다민 B 자당은 컵당 남성 모기를 다른 6컵에 넣습니다.
세트 B 남성 모기에 대한이 단계를 반복합니다. 짝짓기 분석용 케이지 12개 설정. 6개의 케이지 각각에, 로다민 B 표시되는 10세트 남성 모기, 10개의 표시가 없는 세트 B 수컷 모기 및 10개의 처녀 야생형 암컷 모기를 포함합니다.
다른 여섯 케이지에서, 포함 10 표시되지 않은 세트 남성 모기, 10 로다민 B 표시 세트 B 수컷 모기, 10 처녀 야생 형 여성 모기. 이 케이지에 레이블을 지정하여 두 결합 조합을 명확하게 구분합니다. 라벨에 따라 짝짓기 케이지에 각각의 수컷 컵을 놓습니다.
그물망을 제거하고 컵을 부드럽게 눌러 수컷을 컵에서 내쫓습니다. 조심스럽게 종이 컵과 케이지에서 그물을 제거하여 모기가 케이지에서 탈출하지 않도록합니다. 남성 모기가 짝짓기 케이지에 적어도 한 시간 동안 적응하도록 허용하십시오.
구강 흡구를 사용하여 처녀 야생 형 암컷 모기를 12 개의 종이 컵으로 옮기고 각 컵에는 10 개의 모기가 들어 있습니다. 수컷 모기에 대한 적응 기간 후, 모든 짝짓기 케이지에 여성의 한 컵을 전송하고 그물을 제거합니다. 컵을 잔밖으로 내준 후, 케이지에서 모기가 빠져나오지 않도록 조심스럽게 종이 컵과 그물망을 제거합니다.
결합을 3 시간 동안 수행 한 다음 기계 식 흡인기로 각 케이지에서 모든 모기를 제거하여 짝짓기 실험을 종료합니다. 얼음에 모기를 적어도 5분 동안 마취시합니다. 모기가 완전히 마취되면 암컷 모기를 부드럽게 집어 들고 그물로 고정 된 별도의 종이 컵에 보관하십시오.
매팅 케이지에서 컵에 각 라벨을 전송하여 종이 컵에 레이블을 지정합니다. 여성 정자를 채점하려면 스테레오 현미경으로 해부하기 전에 적어도 5 분 동안 얼음에 여성 모기를 냉하게 마취하십시오. 스테레오 현미경으로 여성 모기를 해부하십시오.
현미경의 밑에 정자를 검사합니다. 여성이 수정되지 않으면 세 정자모두 비어 있을 것이고, 수정되면 정자 의 2~3개가 모틸성 정자로 채워질 것입니다. 수정된 개별을 위해, 정자가 RFP1 필터를 장착한 형광 스테레오 현미경의 밑에 그(것)들을 검토해서 로다민 B 표시 정액액체를 포함하는지 여부를 결정합니다.
정자는 로다민 B로 표시되지 않는 정액으로 채워진 경우에, 어떤 형광도 관찰되지 않습니다. 다른 한편으로는, 정자Atheca로 로다민 B 표시 정액을 포함하는 경우에, 그것은 주황색을 형광할 것입니다. 이 짝짓기 경쟁력 분석의 목적은 근친 교배의 몇 세대 후 남성 짝짓기 체력에 손실이있을 수 있는지 여부를 결정하는 것이었습니다.
짝짓기 경쟁력 분석의 실험적 삼중항이 실시되었고, 여기에 수정 데이터가 나와 있다. 야생 형 암컷은 상호 표시와 함께, 근친 또는 아웃 남성 중 하나에 의해 수정되었다. 결과는 근친 또는 외교 수컷에 의해 수정된 암컷의 비율이 로다민 B 표시에 의해 영향을 받지 않았다는 것을 보여줍니다.
여성의 상당히 높은 비율은 모든 세 복제에 근친 근친 남성보다 아웃 크로스 남성과 짝짓기, 교근이 짝짓기 피트니스에 손실로 이어질 수 있음을 나타내는. 여성 모기의 여분의 케이지를 준비하는 것이 중요합니다. 사전 수정 된 여성이 모든 데이터를 무효화할 수 있기 때문에 수컷 모기에 의해 오염 된 케이지에서 여성 모기를 사용하지 마십시오.
실험실 기반 짝짓기 경쟁력 분석 이외에, 이 절차는 곤충 결합 생물학, 인구 역학 및 분산을 연구하기 위하여 마크 방출 탈환 실험에 이용될 수 있습니다.
