פרוטוקול זה מודד את התחרותיות של הזדווגות יתושים זכרים, המהווה תנאי מוקדם לתוכניות לדיכוי אוכלוסיית יתושים המבוססות על שחרור גברים. קריטריון כושר זה מוערך כחלק מהערכת בקרת איכות ומתיחה. שיטה זו מפחיתה את זמן הניסוי ב -90% ומאפשרת השוואה ישירה של תחרותיות ההזדווגות בין שני קווים סטריליים או נגועים בוולבאצ'יה.
ביצוע הליך זה יהיה איירין לי וקנג וואי מק. בתור התחלה, סקס יתושים זכר ונקבה בשלב הגועל, על פי הבדלי הגודל שלהם. עבור כל קבוצה של יתושים, להעביר 100 גלמים זכרים לתוך כלוב מסומן מראש עבור האכלת סוכרוז או רודמין B סוכרוז האכלה.
מניחים את הגולם הנשי בקבוצות קטנות של 40 עד 50 לכלוב. עם הופעתם של האימאגוס, בדוק את הכלובים לנוכחות של יתושים זכרים. כדי להכין את פתרון סוכרוז 0.2%רודמין B, להמיס 200 מיליגרם של אבקת רודמין B עבור כל 100 מיליליטר של 10% תמיסת סוכרוז.
מערבבים היטב כדי להבטיח שכל האבקה מומסת. הכן 20 בקבוקי מאכיל סוכר עם פתיל. הוסף 10 מיליליטר של 10% סוכרוז ל -10 בקבוקי מאכילים ו -10 מיליליטר של 0.2%Rhodamine B סוכרוז פתרון עבור 10 בקבוקי מאכיל האחרים.
הניחו חמישה בקבוקי מאכילים בכל כלוב זכר מוכן ואפשרו ליתושים הזכרים לאכול במשך שלושה ימים לפני ניסוי ההזדווגות. תדליק את מנורת מבער הכספית ואת המיקרוסקופ הסטריאו. אפשר למקור האור למנורת מבער הכספית להתייצב במשך 10 דקות.
ואז להגדיר את מסנני פלואורסצנטיות עבור חלבון פלואורסצנטי אדום אחד. שאפו מספר קטן של יתושים בכל פעם לתוך צינור הזכוכית של השאיפה האוראלית. דרך צינור הזכוכית, התבונן בגופם של היתושים הזכרים מתחת למיקרוסקופ הסטריאו הפלואורסצנטי.
השתמש רק יתושים זכר מסומן עם רודמין B לניסוי. העבר להגדיר יתושים זכרים לתוך 12 כוסות נייר מאובטח עם רשת. מניחים 10 סוכרוז מאכילים יתושים זכרים לכוס לשש כוסות, ו-10 סוכרוז של רודמין B האכיל יתושים זכרים בכוס בשש הכוסות האחרות.
חזור על שלב זה עבור יתושים זכרים להגדיר B. תקימו 12 כלובים לבדיקת ההזדווגות. בכל אחד מששת הכלובים, כלולים 10 סט יתושים זכרים שהם רודמין B מסומן, 10 יתושים זכרים B לא מסומנים, ו -10 יתושים נקבות בתולה מסוג בר.
בששת הכלובים האחרים, כלולים 10 יתושים זכרים לא מסומנים, 10 רודמין B מסומן סט יתושים זכרים B, ו -10 יתושים נקבות בתולה מסוג בר. תייג את הכלובים האלה כדי להבחין בבירור בין שני שילובי ההזדווגות. מניחים את כוסות הזכרים המתאימות בכלובי ההזדווגות בהתאם לתוויות.
מוציאים את הרשת ומקישים בעדינות על הכוס כדי לדחוף את הזכרים מהכוס. הסר בזהירות את הנייר והרשת מהכלוב כדי להבטיח שאף יתוש לא יברח מהכלוב. אפשר ליתושים הזכרים להתאקלם בכלוב ההזדווגות לפחות שעה.
באמצעות שאיפה אוראלית, העבירו יתושים נשיים בתוליים מסוג בר ל-12 כוסות נייר, כל המכילה 10 יתושים. לאחר תקופת ההתאקלמות של היתושים הזכרים, מעבירים אחת של נקבות לכל כלוב הזדווגות ומסירים את הרשת. דוחפים בעדינות את הכוס כדי לעודד את כל היתושות שנותרו מהכוס, ואז מסירים בזהירות את הנייר והרשת מהכלוב כדי להבטיח שאף יתוש לא יברח מהכלוב.
אפשר להזדווגות במשך שלוש שעות, ולאחר מכן לסיים את ניסוי ההזדווגות על ידי הסרת כל היתושים מכל כלוב עם שאיפה מכנית. קר-ירדים את היתושים על קרח לפחות חמש דקות. כאשר היתושים הם מרדים לחלוטין, בעדינות להרים את היתושים הנשי ולשכן אותם בכוס נייר נפרדת מאובטחת עם רשת.
תייג את הנייר על ידי העברת התווית המתאימה מכלוב ההזדווגות על הכוס. כדי להבקיע זרע נשי, קר-יראתי את היתושים הנשיים על הקרח לפחות חמש דקות לפני הניתוח תחת מיקרוסקופ סטריאו. לנתח את היתוש הנשי מתחת למיקרוסקופ הסטריאו.
בדוק את הזרע מתחת למיקרוסקופ. אם הנקבה אינה מופרית, כל שלושת הזרעים יהיו ריקים, ואם מופרות, שניים או שלושה מהזרע יהיו מלאים בזרע רוטילי. עבור אנשים מופרים, לקבוע אם זרע מכילים רודמין B מסומן נוזל הזרע על ידי בדיקת אותם תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי מצויד במסנן RFP1.
אם הזרע מלא בנוזל הזרע שאינו מסומן ברודמין B, לא נצפתה פלואורסצנטיות. מצד שני, אם הזרע מכיל רודמין B מסומן נוזל הזרע, זה יהיה פלואורסצ'ה כתום. מטרת התחרותיות בהזדווגות זו הייתה לקבוע אם יכול להיות אובדן כושר הזדווגות גברי לאחר מספר דורות של הזדווגות.
טריפליקטים ניסיוניים של בדיקות התחרותיות של ההזדווגות נערכו, ונתוני ההפריה מוצגים כאן. נקבות פראיות הופרו על ידי הזכרים ההולכים או החיצוניים, עם סימון הדדי. התוצאות מראות כי שיעור הנקבות המופרות על ידי הזכרים ההולכים או החיצוניים לא הושפעו מסימון רודמין B.
אחוז גבוה משמעותית של נקבות הזדווגו עם הזכרים החיצוניים מאשר עם הזכרים מלידה בכל שלושת המשכפלים, מה שמצביע על כך שהזדווגות עלולה להוביל לאובדן כושר ההזדווגות. חשוב להכין כלובים נוספים של יתושים נקבות. אין להשתמש יתושים נקבות מכלוב כי כבר מזוהם על ידי יתושים זכרים, כמו נקבות הפריה מראש יהפוך את כל הנתונים לא חוקיים.
מלבד מעבדה מבוססי הזדווגות assay, הליך זה יכול לשמש בניסויים שחרור-recapture סימן לחקר ביולוגיה של הזדווגות חרקים, דינמיקה של האוכלוסייה, ופיזור שלה.
