يقيس هذا البروتوكول القدرة التنافسية لتزاوج البعوض الذكوري، وهو شرط أساسي لبرامج قمع البعوض القائمة على إطلاق البعوض. يتم تقييم معيار اللياقة البدنية هذا كجزء من مراقبة الجودة وتقييم الإجهاد. تقلل هذه الطريقة من الوقت التجريبي بنسبة 90٪ وتسمح بالمقارنة المباشرة بين القدرة التنافسية للتزاوج بين خطين عقيمين أو مصابين ب Wolbachia.
تنفيذ هذا الإجراء سيكون ايرين لي وكينغ واي ماك. للبدء ، مارس الجنس مع البعوض الذكور والإناث في مرحلة الجرو ، وفقا لاختلافات حجمها. لكل مجموعة من البعوض، نقل 100 من الخوادر الذكور إلى قفص المسمى مسبقا لتغذية السكروز أو رودامين B السكروز التغذية.
ضع الخوادر الأنثوية في دفعات صغيرة من 40 إلى 50 لكل قفص. عند ظهور imagos ، تحقق من الأقفاص بحثا عن وجود البعوض الذكور. لإعداد محلول السكروز 0.2٪ رودامين B، حل 200 ملليغرام من مسحوق رودامين B لكل 100 ملليلتر من محلول السكروز 10٪.
تخلط جيدا لضمان أن يتم حل جميع مسحوق. إعداد 20 زجاجة تغذية السكر مع الفتيل. إضافة 10 ملليلتر من السكروز 10٪ إلى 10 زجاجات التغذية و 10 ملليلتر من محلول السكروز 0.2٪ رودامين B للزجاجات المغذية الأخرى 10.
ضع خمس زجاجات مغذية في كل قفص ذكر معد والسماح للبعوض الذكر بالتغذية لمدة ثلاثة أيام قبل تجربة التزاوج. قم بتشغيل مصباح موقد الزئبق والمجهر الاستريو. السماح لمصدر الضوء إلى مصباح الزئبق الموقد لتحقيق الاستقرار لمدة 10 دقائق.
ثم تعيين مرشحات الفلورية للبروتين الفلوري الأحمر واحد. يستنشق عددا صغيرا من البعوض في وقت واحد في الأنبوب الزجاجي للطامحين الفمويين. من خلال الأنبوب الزجاجي ، لاحظ جسم البعوض الذكر تحت المجهر الاستريو الفلوري.
استخدم البعوض الذكور فقط مع رودامين B للتجربة. نقل تعيين البعوض الذكور في 12 أكواب ورقية المضمون مع المعاوضة. وضع 10 السكروز تغذية البعوض الذكور لكل كوب في ستة أكواب، و 10 رودامين B السكروز تغذية البعوض الذكور لكل كوب في الكؤوس الستة الأخرى.
كرر هذه الخطوة لتعيين البعوض الذكور B. إعداد 12 أقفاص للتزاوج. في كل من الأقفاص الستة ، وتشمل 10 مجموعة البعوض الذكور التي هي رودامين باء ملحوظ ، 10 غير ملحوظ مجموعة بعوض الذكور باء ، و 10 البعوض الإناث البرية البكر من نوع.
في الأقفاص الستة الأخرى ، تشمل 10 مجموعة غير معلمة بعوض ذكر ، و 10 رودامين B علامة على مجموعة بعوض ذكر B ، و 10 بعوضة أنثى برية عذراء. تسمية هذه الأقفاص للتمييز بوضوح بين الجمع بين اثنين من التزاوج. ضع أكواب الذكور في أقفاص التزاوج وفقا للتسميات.
إزالة المعاوضة والاستفادة بلطف من الكأس لتزاحم الذكور للخروج من الكأس. قم بإزالة الكوب الورقي والمعاوضة بعناية من القفص لضمان عدم هروب البعوض من القفص. السماح للبعوض الذكور بالتأقلم في قفص التزاوج لمدة ساعة على الأقل.
باستخدام جهاز التنفس الفموي ، قم بنقل البعوض الأنثوي البري البكر إلى 12 كوبا ورقيا ، يحتوي كل كوب على 10 بعوضة. بعد فترة التأقلم للبعوض الذكور ، نقل كوب واحد من الإناث في كل قفص التزاوج وإزالة المعاوضة. تزاحم بلطف الكأس لتشجيع أي البعوض الإناث المتبقية للخروج من الكأس، ثم إزالة بعناية الكأس الورقية والمعاوضة من القفص لضمان عدم هروب البعوض من القفص.
السماح للتزاوج أن يحدث لمدة ثلاث ساعات، ومن ثم إنهاء تجربة التزاوج عن طريق إزالة جميع البعوض من كل قفص مع الطامح الميكانيكية. تخدير البعوض البارد على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل. عندما يتم تخدير البعوض بالكامل ، التقط البعوض الأنثوي برفق واؤوه في كوب ورقي منفصل مؤمن بالمعاوضة.
تسمية كوب ورقة عن طريق نقل التسمية المعنية من قفص التزاوج على الكأس. لتسجيل الحيوانات المنوية الأنثوية ، تخدير البعوض الأنثوي على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل قبل تشريحه تحت مجهر ستيريو. تشريح البعوض الإناث تحت المجهر ستيريو.
فحص الحيوانات المنوية تحت المجهر. إذا لم يتم تلقيح الأنثى ، فإن جميع الحيوانات المنوية الثلاثة ستكون فارغة ، وإذا تم تلقيحها ، سيتم ملء اثنين أو ثلاثة من الحيوانات المنوية بالحيوانات المنوية المتحركة. بالنسبة للأفراد الذين تم تلقيحهم، حدد ما إذا كانت الحيوانات المنوية تحتوي على رودامين B تميز السائل المنوي من خلال فحصها تحت المجهر ستيريو الفلورسنت مجهزة مرشح RFP1.
إذا تم تعبئة الحيوانات المنوية مع السائل المنوي الذي لم يتم وضع علامة مع رودامين B، لا يلاحظ مضان. من ناحية أخرى، إذا كان spermatheca يحتوي على رودامين B ملحوظ السائل المنوي، فإنه فلورسي البرتقال. وكان الهدف من هذا الفحص القدرة التنافسية التزاوج لتحديد ما إذا كان يمكن أن يكون هناك خسارة في اللياقة البدنية التزاوج الذكور بعد عدة أجيال من التزاوج.
وأجريت ثلاث نسخ تجريبية من اختبار القدرة التنافسية للتزاوج، وتظهر بيانات التلقيح هنا. تم تلقيح الإناث البرية من قبل الذكور الأصيلين أو المتقاطعين ، مع وضع علامات متبادلة. وتبين النتائج أن نسبة الإناث اللاتي تلقيحهن الذكور الأصيلات أو اللائي تجاوزنها لم تتأثر بوسم رودامين باء.
وتزاوجت نسبة أعلى بكثير من الإناث مع الذكور المتقاطعة مقارنة بالذكور الأصيلين في جميع النسخ المتماثلة الثلاثة، مما يشير إلى أن التزاوج الداخلي يمكن أن يؤدي إلى فقدان اللياقة البدنية للتزاوج. من المهم إعداد أقفاص إضافية من البعوض الأنثوي. لا تستخدم البعوض الأنثوي من قفص ملوث بالبعوض الذكور ، لأن الإناث قبل تلقيحه سيجعل جميع البيانات غير صالحة.
بخلاف اختبار القدرة التنافسية للتزاوج القائم على المختبرات ، يمكن استخدام هذا الإجراء في تجارب استعادة العلامات لدراسة بيولوجيا تزاوج الحشرات ، وديناميات السكان ، وتشتتها.
