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모든 동물 보호 및 실험 절차에서 건강의 국가 학회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 미시간 대학에서는 가이드라인에 따 랐 다. RNase 무료 솔루션을 사용 하 고 플라스틱 프로토콜에 걸쳐 팁. RNase 오염 제거 솔루션 ( 자료 표참조) 제조업체 지침에 따라 작업 영역, 펫, 튜브, 그리고 원심 분리기를 청소.
1입니다. sgRNA 대상 선택
<ol><li>웹 페이지를 열고 웹 브라우저를 사용 하 여: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>~ 60의 기본적인 쌍 (bp) 측면에 서는 관심의 원하는 편집 시퀀스의 입력 (즉 30 bp 5'과 3' 원하는 편집의).</li>
		<li>꼬마 선 충 게놈 풀 다운 메뉴에서 선택 합니다.</li>
		<li>Protospacer 인접 한 모티브를 선택 (HF1-20 bp-NGG-SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) 풀 다운 메뉴에서.</li>
		<li>전송을 클릭 합니다. 결과 페이지에서 최고 순위 대상 시퀀스의 편집에 가까운 선택 합니다. 측면에 서 60 bp 입력된 시퀀스 내의 아무 적당 한 대상 사이트 경우 확장 쿼리 시퀀스 100 bp (즉 50 bp는 원하는의 양쪽 편집).</li>
	</ol>
</li>
	<li>예: synthego, 사용 가능한 소스에서 얻을 다음 사양 20-메 르 대상 sgRNA: 3 nmol; 아니 수정입니다.</li>
	<li>접수 한 후, 원심에서 튜브를 포함 하는 동결 건조 된 sgRNA > 실 온에서 1 분 동안 12000 x g. 튜브, nuclease 무료 테의 60 µ L을 추가 하 고 부드럽게 다시 15-20 회 P200 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 일시 중단. 최종 농도 50 μ M 이다입니다.</li>
</ol>2. 상 동 감독 복구 템플릿 디자인
<ol><li>SsODN HDR 템플릿을 포함 하는 디자인: 1)의 돌연변이, 2)는 독특한 프레임에서 금지 endonuclease 사이트, 3) NGG 팸 시퀀스 내의 Gs 중 하나 또는 모두의 침묵 돌연변이 4) 50 bp 5'과 3' homology 팔 성과 돌연변이 측면. (그림 1C) 9 , 10.<ol>
<li>NGG 팸 시퀀스의 돌연변이 가능 하지 않으면 sgRNA이 중재 ssODN HDR 서식 파일의 분열을 방지 하기 위해 sgRNA 대상 인식 시퀀스 내에서 5-6 침묵 돌연변이 소개 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사용 가능한 소스, 예를 들면 idtdna에서에서 다음 매개 변수는 "Ultramer DNA oligonucleotide" 얻을: 규모: 4 nmol; 배합: 없음; 정화: 표준 담입니다.</li>
	<li>접수 한 후, 원심에서 튜브를 포함 하는 동결 건조 된 ssODN > 실 온에서 1 분 동안 12000 x g. 부드럽게 다시 일시 중단 100 µ M의 최종 농도에 ssODN nuclease 무료 ddH2O에서에서 15-20 회 P200 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로.</li>
</ol>3. 디자인 유전형 뇌관
<ol><li>400 ~ 700 bp의 PCR amplicon11생성 하 게놈 수정 측면을 설정 하는 뇌관 디자인.</li>
	<li>단일 및 특정 amplicon11생산 PCR 순환 상태를 최적화 합니다.</li>
</ol>4. 주입 혼합 준비
<ol><li>표 1 시 약 4 ° c.에서 2 분 최대 속도로 원심</li>
	<li>순서 대로, nuclease 무료 PCR 튜브에 표 1 시 약을 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 pipetting 아래로 10 번 P20 피 펫과에 의해 철저 하 게 혼합.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 주입 혼합 품 어.</li>
</ol>5. 주입 프로토콜
<ol><li>사출 micropipette 주입 혼합12의 약 절반으로 로드 합니다. 주사 바늘 나 막 신 또는 나누기 경우 주입 혼합 나머지 저장 합니다.</li>
	<li>있도록 ~ 20-30 p.s.i.는 점진적 흐르는 솔루션12micropipette 팁을 휴식. 참고: 큰 직경 팁 부정적인 동물의 건강에 영향을 미칠 및 F1 자손 수확량 감소.</li>
	<li>10-15 영 주사 성인 gonadal 양팔의 벌레 가능한 경우12. 그렇지 않으면, 주입 한 gonadal 팔으로 충분 하다.</li>
	<li>OP50-시드 35 m m 선 충 성장 미디어 (NGM) 접시에 주입 된 동물 (P0) 실 온에서 1-2 h에 대 한 복구를 허용 합니다. 그 후, 개별 OP50 시드 35 m m NGM 판 백 금 철사 벌레를 사용 하 여 단일 주입된 P0 동물12를 선택 합니다.</li>
</ol>6. 스크린 P0 격판덮개 및 단일 mCherry(+) F1s
<ol><li>2 일 후 주입, P0 판 F1 자손 표현 mCherry 형광 stereomicroscope를 사용 하 여 인 두에 포함 된 식별 (그림 1D, 하루 2-3). 대부분의 mCherry(+) F1 동물을 포함 하는 3 개의 P0 플레이트를 선택 합니다.</li>
	<li>3 선택한 P0 플레이트의 각 단일 24-36 mCherry(+) F1의벌레를 사용 하 여 총 8-12 mCherry(+) F1 동물 선택 (그림 1D, 하루 2-3). 참고: mCherry(-) 동물 또한 이러한 P0 플레이트에서 안타 수 있습니다 하지만 올바르게 식별 확률 편집 동물 훨씬 낮은 (그림 2A).</li>
	<li>개별 F1s self-fertilize 하 여 실 온에서 1-2 일에 대 한 알 수 있습니다.</li>
</ol>7. 단일 벌레 PCR과 유전형
<ol><li>1-2 일 후 계란-누워, 개별 PCR 스트립 튜브 캡 포함 된 웜 선택 (표 2, 그림 1D, 하루 4-5)를 사용 하 여 웜 세포의 용 해 버퍼의 7 µ L로 F1s를 전송 합니다.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 하단에 동물을가지고 1 시간-80 ° C에서 튜브를 고정을 실 온에서 1 분 동안 최대 속도로 PCR 튜브. 참고: 웜 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한.</li>
	<li>Thermocycler 다음과 같은 프로그램을 사용 하 여 냉동된 벌레를 lyse: 60 ° C 60 분, 15 분 동안 95 ° C에 4 ° C를 개최.</li>
	<li>설정 PCR mastermix 표 3에서 같이</li>
	<li>깨끗 한 PCR 튜브에 PCR mastermix의 21 µ L을 추가 하 고 3 단계에서 웜 세포의 4 µ L를 추가 합니다. 피 펫을 사용 하 여 잘 혼합 하 고 PCR 프로그램 제조 업체 지침 ( 자료 표참조)를 실행.</li>
	<li>제조업체 지침에 따라 DNA 깨끗 하 고 집중 키트를 사용 하 여 PCR 반응 정화 ( 자료 표참조). 10 µ L 물 회전 열을 추가 하 여 DNA을 elute.</li>
	<li>설정 제한 효소 mastermix 표 4와 같이</li>
	<li>10 µ L의 제한 효소 mastermix 각 청소 PCR 반응에 추가 하 고 1-2 h 37 ° C13에서 품 어.</li>
	<li>별도 소화 120 V 1 x 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼14를 사용 하 여에서 실행 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품.</li>
</ol>8. 신분증 및 편집 된 동물의 시퀀스 확인
<ol><li>잠재적인 편집 동물14 (그림 1D, 하루 4-5)을 표시 하는 밴드의 존재에 대 한 소화 효소 샘플을 검사 합니다. 참고: 밴드 크기 또는 예기치 않은 하 고 복잡 한 금지 효소 소화 패턴 밴딩 교대로 관찰 될 수 있는 잠재적인 indel 돌연변이 식별 하는 N2 컨트롤을 로드 합니다.</li>
	<li>확인 후 잠재적인 편집된 동물, 웜 세포의 나머지 3 µ L를 사용 하 고 PCR 반응을 반복 합니다. 청소 하지 않는 또는 금지 효소 소화 PCR 반응 완료 되 면 프로그램. 별도 1 %agarose 젤에 PCR 반응을 로드 하 고 젤 추출 키트15 를 사용 하 여 밴드를 추출 ( 자료 표참조).</li>
	<li>생어 시퀀스16 젤 올바르게 편집된 동물 (그림 1A)를 식별 하는 F1 뇌관을 사용 하 여 DNA를 추출 참고: Heterozygote 읽기 포함 됩니다 야생 타입의 존재로 인해 봉우리 중첩 그리고 대립 유전자를 설계.</li>
	<li>Homozygous 동물에서에서 얻이 검증된 heterozygous 편집된 동물, 단일 8-12 F2 동물 7-8 단계를 수행 하려면.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms.">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li><li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. 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K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient,+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. 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DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Gel+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sanger+sequencing.">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li><li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+(and+Other+&amp;#34;Omics&amp;#34;)+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care.">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &amp;#34;Omics&amp;#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li><li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis?.">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?.</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li><li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse,+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis.">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li></ol>

우리는이 논문의 중요 한 독서에 대 한 애 원 실험실의 구성원 감사. 종자는 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 애 원 실험실에 있는 연구는 교부 금에 의해에서 지원 NIH (R01 NS094678)와 근 위축 증 협회 (MDA382300) A.A.B.

CRISPR-Cas9 시스템 모델 생물의 게놈을 정확 하 게 수정에 대 한 강력 하 고 효과적인 도구입니다. 여기, 우리는 그 공상 sgRNAs20 ssODN HDR 템플릿 사용 C. 선 충게놈 점 돌연변이의 고효율 세대 결합 보여 줍니다. 중요 한 것은, 시연 RNP 배달에 편집 고효율 생산 형광 공동 선택 마커로 사용할 때 편리 함과 기술의 안정성을 강조 합니다.
C. 선 충 게놈 엔지니어링에 대 한 CRISPR Cas9 메서드의 대부분 특정 유전 배경 또는 공동-CRISPR 전략1에 의존합니다. Co CRISPR 메서드는 성공적인 게놈 편집의 가능성을 증가 하는 유용한 도구가 될 입증 되었습니다. 그러나, 공동-CRISPR 방법을 소개 하는 관심의 게놈 편집에 대 한 풍요롭게 마커 로커 스에 표현 형을 선택할 수 있는 편집 해야 합니다. 강력 하 고, 하는 동안 선택 가능한 표현 형 베어링 돌연변이 소개 수 있습니다 편집을 변형 또는 자체의 원하는 지점 돌연변이 악화 하거나 마커 형에 의해 억압 수 있는 고기를 전시 하는 경우 바람직한. 또한, 공동 CRISPR 전략에서 대상 효과에 기여할 수 있는 마커 로커 스에 추가 이중 가닥 휴식을 만드는 할 거. 여기, 우리는 적절 한 게놈 편집을 위해 뿐만 아니라 성공적으로 주입된 P0 동물을 식별 하는 역할을 하지만 또한 풍요롭게 과도 형광 마커를 사용 하는 방법 제시. 데이터 설명이 방법은 크게 비 형광 동물에 비해 성공적으로 편집 된 동물에 대 한 풍요롭게 하 고 여러 가지 이점을 제공 합니다: 1)만 사이트 sgRNA을 대상으로 한 필수, 2)는 Cas9에 5 감소 및 sgRNA 농도, 3) 스트레인 및 표현 형 선택 독립, 그리고 4) 공칭 심사 작업 (~ 24 F1s). 강력한 CRISPR Cas9 게놈 편집 F1 세대에는이 메서드를 사용 하 여 하는 것을 관찰 되었다. 특히, PCR 제한 효소 기반 탐지 전략 설명 F1 세대에서 모노 및 bi 유전자 편집된 동물의 명확한 감지 수 있습니다. 마지막으로, 유전형 전략으로 PCR 밴드 교대 때 관찰 될 수 있는 잠재적인 indel 돌연변이의 식별을 용이 하 게 어느 하지 N2 컨트롤에 비해 제한 다이제스트 또는 복잡 한 수확량에 취약 밴드 때 소화.
출현 다음 세대의 연속 대규모 게놈 노력 함께 질병21분리 게놈 변종의 식별을 가속 했다. 그러나, pathogenicity의 기능 테스트는 증명 되지 이체의 대부분에 대 한 세포질 organismal 모델 시스템에. 이 연구에서 우리가 널리 공부 소개 C. 선 충 에 떼-1 유전자를 대상으로 ALS 관련 잔디 1G93A 돌연변이. 날짜 하려면,이 돌연변이 모델링 되었고 C. 선 충 에 유전자 변형 overexpression를 사용 하 여 주로 마우스 공부. 변종 동물 모델에서의 overexpression 키 셀룰러 정리 수 있습니다, 하지만 질병의 분자 및 행동 측면 그것은 점점 분명 '복용' 고기22결정 한 경감 요소 이다. 예를 들어 높은 사본 수 떼-1G93A 쥐 ~ 24 돌연변이 인간 떼-1 유전자의 복사본을 들고 크게 가속된 질병 과정만 8 ~ 10 부23,24운반 떼-1G93Adl 마우스에 비해 전시. 여기, 우리가 우리의 CRISPR Cas9 RNP-기반 방법 급속 하 게 더 정확 하 게 유전자를 복제 하기 위해에서 유전자 변형 overexpression를 필요로 하지 않고 orthologous 웜 유전자에 인간의 변형 관련 된 돌연변이 생성 하 이용 될 수 있다 설명 질병의 컨텍스트입니다. 우리의 방법은 생산 하 고 생 규제 제어 및 overexpression의 경계 하는 걸로 식의 맥락에서 알 수 없는 의미의 게놈 이체를 테스트 가능한 플랫폼을 제공 합니다. 마지막으로, 우리는 또한 사용이 방법을 태그 내 생 유전자 형광 성 단백질 (즉 GFP), 어떻게 변형 단백질 지 방화, 집계 및 매출에 영향을 시각화에 대 한 추가 도구를 제공 합니다.

최근의 기술 진보 근본적으로 변형 하 고 정확 하 게 엔지니어 유전자 수를 가속. 특히, RNA 기반 endonuclease 관심의 대상 시퀀스 근처 두 배 물가 틈 (DSB)를 유도 하는 Cas9에 의존 하는, CRISPR-Cas9 시스템을 광범위 하 게 사용 되었습니다 정확 하 게 대부분에 사용 되는 모델 생물의 게놈 엔지니어링 생물 의학 연구1,2,,34. 크게, CRISPR-Cas9를 사용 하 여 게놈 C. 선 충5같은 어려운 종에도 편집 잠금을 해제 했다. 종에 세 가지 핵심 구성 요소에 의존 편집 시스템 CRISPR-Cas9 기반으로 게놈으로 포인트 돌연변이 생성: 1) Cas9 endonuclease, 대상 시퀀스와 설계 3)는 사용자에 게 Cas9 endonuclease 지휘 2)는 하나의 가이드 RNA (sgRNA) 관심2의 원하는 개의 편집 항목을 포함 하는 homology 감독 수리 (HDR) 템플릿.
대상 sgRNA 및 Cas9를 소개 하는 데 사용할 수 있는 여러 방법이 있다 nuclease 플라스 미드, RNA, 그리고 바이러스 성 기반 배달 방법6을 포함 하 여 셀에. 최근, 사전 complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs)의 직접 배달 CRISPR-Cas9-기반 게놈7편집에 강력 하 고 효율적인 도구로 떠오르고 있다. 사전 complexed CRISPR Cas9 RNPs의 직접 배달 여러 가지 이점이 있다, 즉: RNPs 1) 세포 녹음 방송에 대 한 필요를 무시 하 고 번역, 2) RNPs는 급속 하 게 삭제는 사용할 수 있는 시간을 줄임으로써 특이성을 증가 시킬 수 있습니다 오프-대상 분열, 그리고 3) circumvents 아닌 임의의 통합을 통해 호스트 게놈 시퀀스의 소개는 아무 외국 DNA/RNA 요소를 포함 하는 RNPs. 함께, 이러한 특성 가능성이 대상에 CRISPR에서 대상 효과 최소화 하면서 편집의 짧은 버스트를 제공 합니다.
C. 선 충에서 사이트별 게놈 변화를 도입에 대 한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 sgRNA 및 단일 좌초 oligonucleotide (ssODN) HDR 서식 파일 디자인, sgRNA-Cas9 RNP complexing 및 납품, 및 제대로 편집된 동물의 명확한 식별을 위해 유전형 전략 대상으로 포함 되어 있습니다. 이 전략을 사용 하 여, 원하는 사이트 변경 내용을 복구할 수 있습니다, 뿐만 아니라 다른 일반적인 indel 돌연변이 복구할 수 있습니다. 따라서, 모노-유전자, bi-유전자, 어디 하나의 전략을 사용 하 여 유전자 시리즈의 생성을 허용 하는 우리의 전략 그리고 indel 돌연변이 F1 세대에서 생성 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&amp;nbsp; EZ Kit</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>chimeric sgRNA</td></tr><tr><td>Nuclease-free TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Synthego Inc.</td><td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>ssODN HDR template</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1078728</td><td>Cas9 protein</td></tr><tr><td>pCFJ90&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean &amp;amp; Concentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Glass Borosilicate Glass Micropipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1.0mm. ID: 0.78mm</td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Decontamination Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and facile pipeline for generating genomic point mutants in c. elegans using crispr/cas9 ribonucleoproteins

클러스터 된 정기적으로 산재 된 구조 반복 (CRISPR)-CRISPR-관련 단백질 9 (Cas9) 간결한 적응 면역 방어 시스템을 공동 정확한 진 핵 게놈 엔지니어링에 대 한 강력한 도구로 선택한 되었습니다. 여기, 선물이 C. 선 충의 게놈 포인트 돌연변이 들의 효율적이 고 정확한 세대에 대 한 공상 단일 가이드 RNAs (sgRNA)와 CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs)를 사용 하 여 신속 하 고 간단한 방법. 우리는 sgRNA 대상 선택, 호몰로지 감독 수리 (HDR) 템플릿 디자인, CRISPR-Cas9-RNP complexing 및 배달 및 올바르게 편집된 동물의 강력 하 고 급속 한 식별 수 있도록 유전형 전략 파이프라인을 설명 합니다. 우리의 접근 허용 손쉬운 생성 및 원하는 게놈 포인트의 돌연변이 동물, 뿐만 아니라 또한 높은 효율성 및 감소 된 심사 작업 약 4-5 일에 다른 복잡 한 indel 대립 유전자의 탐지를 용이 하 게 한다.

인간의 superoxide dismutase 1에에서 돌연변이 (SOD1) 가족 루 경화 증, 마비와 죽음17변함없이 이끌어 치명적인 신경 질환의 10 ~ 20% 위한 계정. 인간의 떼-1 (그림 1B) C. 선 충 떼-1 단백질으로 55% 정체성과 70% 유사성을 공유 하는 진화론 보존된 단백질 이다. 단순, 타당성, 및 CRISPR Cas9 RNP-기반 접근의 효율성을 입증, 우리는 질병 관련 인간의 G93A 변종 웜 게놈 (그림 1A)에서 소개 하는 C. 선 충 떼-1 유전자 대상.
C. 선 충 게놈에 G93A 돌연변이를, sgRNA는 그 팸 인식 사이트 앉아 3 선정 되었다 (그림 1C) G93 codon의 상류 혈압. 우리 ssODN HDR 수리 템플릿을 포함 하는 설계: A93 G93 codon를 변환할 1) 뉴클레오티드 변화 (GGA GCA), 2) NGG 팸 자동 변경 순서 (CGG CAG) HDR 서식 파일, 3) 침묵 돌연변이 (CT)의 sgRNA Cas9 중재 하는 분열을 방지 하는 유전형, 및 4에 대 한 독특한 HindIII 제한 효소 사이트 소개) 50 bp 5'과 3' 상 동 팔 (그림 1C). PCR 뇌관 세트 (F1-R1) N2 컨트롤 (그림 1A)에서 단일 592 bp PCR 제품을 생산 하도록 설계 되었습니다. sgRNA를 포함 하는 주입 혼합, Cas9, ssODN 및 형광 성 감 적 플라스 미드 (pCFJ90) 함께 혼합, 상 온에서 10 분 동안 incubated 되었고 microinjection 피 펫에 로드.
그림 1D 주입 혼합 주입 micropipette에 로드 된 후 워크플로 보여 줍니다. 0 하루에 10-15 P0 동물 표준 microinjection 기술18,19를 사용 하 여 하나 또는 둘 모두 생식 팔에 주입 했다. 주입 된 동물 1-2 시간 복구 하 고 개별적으로 OP50 시드 NGM 접시에 도금 후 했다. 2-3 일 후, 성공적인 P0 주사 mCherry(+) F1 자손을 가지는 그들에 의해 확인 되었다. 상위 3 P0 플레이트 (즉, mCherry(+) F1s의 가장 큰 숫자가 그) 후속 분석을 위해 선택 되었다. (P0-8, P0-10, P0-12)이 3 개의 격판덮개의 각각에서 8 mCherry(+) F1s 24 mCherry(+) F1s의 총에 대 한 개별 OP50 시드 35 m m NGM 번호판을 선발 했다. 2-3 일 후 계란-누워 (하루 4-5), 개별 F1의웜 세포의 용 해 버퍼를 포함 하는 PCR 튜브로 전송 되었고-80 ° c.에서 1 h 동안 얼 그 후, F1s 해방 genomic DNA lysed 되었고 PCR을 복종. PCR 제품 했다 정화 그리고 1 h, HindIII와 소화 그리고 1.5 %agarose 젤에 잠재력을 식별 하기 위해 동물을 편집 실행. 올바르게 편집된 동물에 HindIII 소화 인하 전체 길이 PCR 제품 (592 bp) 370의 두 대역으로 혈압 및 222 혈압. 야생-타입이 유전형 전략에 의하여 명확 하 게 구분 (592 bp), heterozygote (592, 370, 222, 혈압) 및 homozygote (370, 222 bp) 동물. 그림 2A 24 mCherry(+) 동물에 대 한 유전형 결과를 보여 줍니다.
MCherry 형광 마커 게놈 수정에 대 한 풍요롭게 보여, 우리는 또한 3 P0 플레이트의 각에서 8 mCherry(-) 동물 고른. 24 mCherry(+) F1s의 상영 (빨간 막대), 10는 야생 타입 (42%), 했다 모노 유전자 또는 양방향 유전자 수정 (42%), 10 포함 3 잠재적인 indels (13%), 그리고 거기 1 PCR 실패 (그림 2A). 반면, 상영 24 mCherry(-) F1s 1 동물 었 올바르게 수정된 (4%); 반면, 23 했다 야생 타입 (96%) (그림 2A)입니다. 그림 2B 젤 추출된 PCR 제품 (F18-6), 충실 하 게이 homozygous F의 게놈으로 통합 했다 정확한 뉴클레오티드 변화 ssODN HDR 서식 파일에서 디자인을 보여주는 전체 길이에서 크로마를 보여 줍니다. 1 동물입니다. 특히, F1 동물 10-7, 10-8, 및 12-3 전시 예기치 않은 PCR 제품의 크기 및 제한 다이제스트 밴딩 패턴을 제안 하는이 동물 복잡 한 indel 돌연변이 (그림 2A)를가지고 있습니다. 따라서, 우리의 방법입니다만 원하는 게놈 수정 용이성, 효율성, 그리고 충실도, 생성할 수 하지만 또한 식별 및 유전자 기능에 중요 한 및 예기치 않은 통찰력을 흘리 다 수 독특한 indel 대립 유전자의 복구를 허용.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57518/57518fig1.jpg"> 그림 1 . CRISPR-Cas9 공학의는 C. 선 충떼-1 소재 시. (A) C. 선 충에 떼-1 로커 스의 exon intron 구조를 묘사 하는 회로도 그림. 빨간색 바 exon 3 G93의 위치를 나타냅니다. 뇌관 쌍 세트 빨간 화살표 (F1-R1)에 의해 기록 됩니다. (B) C. 선 충 (벌레) 떼-1 단백질의 정렬 순서. 타겟된 G93 잔류물은 빨간색으로 강조 표시 됩니다. (C) 가기, G93 codon를 둘러싼 genomic DNA의 섹션 참조로 표시 되 고 PAM (녹색) 및 sgRNA (블루) 대상 사이트에 강조 표시 됩니다. 하단, 단일 좌초 oligonucleotide (ssODN) 상 동 감독 수리 (HDR) 템플릿이 포함 된 표시 됩니다: codon 편집 변경 G93 A93, sgRNA-Cas9 복합물에 의해 분열을 방지 하기 위해 팸 모티브를 자동 변경 하는 자동 변경 고유 HindIII 제한 효소 사이트 (노란색 상자)를 소개 하 고 (검은 막대) 무기 5'과 3' 50 bp homology 측면. 모든 뉴클레오티드 변화는 ssODN에서 설계는 강조 표시 된 빨간색입니다. (D) 생성 하 고 CRISPR Cas9 RNP 기반 지점 돌연변이 식별에 대 한 파이프라인의 개요 그림. 0 일에 주입 믹스와 함께 10-15 P0 동물을 주입. 하루 2-3, 형광 F1 자손을 포함 하 여 성공적으로 주입된 P0 동물을 식별 하 고 형광 자손과 3 개의 P0 플레이트를 선택 합니다. 3 P0 플레이트의 각 단일 8 형광 F1 자손. 하루 4-5, 1, 단계 (a) 개별 F1s 선택 되며 세포의 용 해 버퍼;를 포함 하는 PCR 튜브에 배치 (b) 2 단계-80 ° C에서 F1 벌레를 포함 하는 PCR 튜브 냉동 후 게놈 DNA는 PCR 템플릿으로 사용 되는 공개 lysed는. PCR 제품 다음 청소 하 고 독특한 제한 효소; 소화 (c) 3 단계, 소화 효소 어디 야생 제품 agarose 젤에 확인 유형 (+ +), heterozygous (m / +), homozygous (m/m) 동물 패턴 밴딩 금지 다이제스트에 의해 확인 될 수 있다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57518/57518fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57518/57518fig2.jpg"> 그림 2 . 대 한 유전형 데이터 잔디-1 (G93A) 돌연변이. (A) F의 젤 이미지 1 동물을 개별적으로 했다 lysed, PCRed 및 HindIII와 소화. 각 P0 플레이트 (P0-8, P0P0-12-10), 8 mCherry(+)와 mCherry(-) F1 8 분석 되었다. 모노 유전자 (파란색 숫자)와 bi 유전자 (빨간색 숫자) 편집된 동물 발견 했다. 크기 이동 PCR 제품 또는 indel 돌연변이 (노란색 숫자)의 지표 예상치 HindIII 소화 밴드 또한 재기 했다. N2 컨트롤 PCR 제품 크기 및 효소 특이성에 대 한 참조로 표시 됩니다. (B) 가기, codon 간격 및 아미노산 번역 야생 유형 (WT) 위에 표시 되 고 아래 G93A 가닥 수정. 원하는 편집은 빨간색 상자로 강조 표시 하 고 프레임 HindIII 제한 사이트 만들기 자동 변경 노란색 상자에 의해 강조 표시 됩니다. 모든 설계 된 뉴클레오티드 변화는 굵게 표시 됩니다. 하단, 대표적인 크로마 homozygous F1 동물 8-6에서. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57518/57518fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>볼륨</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>6.3 Μ</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl (4 M)</td>
			<td>0.94 Μ</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (0.5M) pH 7.4</td>
			<td>0.5 Μ</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCFJ90 (25 ng/μ)</td>
			<td>1.25 Μ</td>
			<td>2.5 ng/μ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssODN (500 ng/μ)</td>
			<td>1.25 Μ</td>
			<td>50 ng/μ</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA (50 μ M)</td>
			<td>1.25 Μ</td>
			<td>5 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cas9 (61 μ M)</td>
			<td>1.03 Μ</td>
			<td>5 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>마지막 볼륨</td>
			<td>12.5 Μ</td>
			<td>----</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. CRISPR-Cas9 RNP 주입 혼합입니다. 모든 시 약 nuclease 무료 ddH2O. RNase 무료로 기술을 사용 해야 시 약을 처리 하는 경우 주입 믹스를 만들 때 다시 정지 되어야 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>[최종]</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris HCl pH 8.3</td>
			<td>10 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>2.5 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0.45%</td>
		</tr>
<tr>
<td>트윈-20</td>
			<td>0.45%</td>
		</tr>
<tr>
<td>가수분해 K</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. 웜 세포의 용 해 버퍼 제조 법입니다. 가수분해 K 신선한 각 사용 하기 전에 추가 해야 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>1 x</td>
			<td>24 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Q5 Mastermix X 2</td>
			<td>12.5 Μ</td>
			<td>300 Μ</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 F1 (10 μ M)</td>
			<td>1.25 Μ</td>
			<td>30 Μ</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 R1 (10 μ M)</td>
			<td>1.25 Μ</td>
			<td>30 Μ</td>
		</tr>
<tr>
<td>웜 세포</td>
			<td>4 Μ</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>6 Μ</td>
			<td>144 Μ</td>
		</tr>
<tr>
<td>마지막 볼륨</td>
			<td>25 Μ</td>
			<td>504 Μ</td>
		</tr>
</tbody></table>테이블 3입니다. PCR Mastermix입니다. 는 PCR mastermix pipetting 솔루션은 동 질 때까지 하 여 잘 혼합 한다. 21 µ L PCR mastermix의 깨끗 한 PCR 튜브에 추가 되어야 하 고 개별 웜 lysate의 4 µ L 제대로 분류 관 추가 다음.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
			<td>1 x</td>
			<td>24 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>효소 버퍼 X 10</td>
			<td>2 Μ</td>
			<td>48 Μ</td>
		</tr>
<tr>
<td>청소 PCR 반응</td>
			<td>10 Μ</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>7 Μ</td>
			<td>168 Μ</td>
		</tr>
<tr>
<td>제한 효소 (10 U/μ)</td>
			<td>1 Μ</td>
			<td>24 Μ</td>
		</tr>
<tr>
<td>마지막 볼륨</td>
			<td>20 Μ</td>
			<td>240 Μ</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4입니다. 제한 효소 Mastermix입니다. 제한 효소 mastermix pipetting 솔루션은 동 질 때까지 하 여 잘 혼합 한다. 10 µ L의 제한 효소 mastermix PCR 제품을 청소의 10 µ L에 추가 되어야 한다

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A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

7.5K 조회수.  University of Michigan. 여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

비디오: A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

연구

발생학

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

유전학

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been harnessed by researchers to study important biologically relevant problems. The unparalleled power of the CRISPR/Cas genome editing method allows researchers to precisely edit any locus of their choosing, thereby facilitating an increased understanding of gene function. Several methods for editing the C. elegans genome by CRISPR/Cas9 have been described previously. Here, we discuss and demonstrate a method which utilizes in vitro assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. Specifically, in this article, we go through the step-by-step process of introducing premature stop codons into the C. elegans rbm-3.2 gene by homology-directed repair using this method of CRISPR/Cas9 editing. This relatively simple editing method can be used to study the function of any gene of interest and allows for the generation of homozygous-edited C. elegans by CRISPR/Cas9 editing&#160;in less than two weeks.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The goal of this protocol is to enable seamless CRISPR/Cas9 editing of the C. elegans genome using assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. This protocol can be used to make a variety of genetic modifications in C. elegans including insertions, deletions, gene replacements and codon substitutions.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

CRISPR/Cas9 기술을 이용한 철새 메뚜기의 동형접합 돌연변이 구축

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

생물학

Single Worm PCR: A Method to Extract and Amplify Genomic DNA

Source: Prior, H., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57518/a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c">A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in&#160;C. elegans&#160;Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes a technique to rapidly screen a single nematode for a genetic marker by PCR screening. In the example protocol, we screen for CRISPR-based genome editing.