이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (R21CA182197 J.O.), 랄 프 W.와 그레이스 M. Showalter 연구 신뢰, 그리고 퍼듀 농업 과학 경제 개발 (AgSEED) 프로그램에 대 한 확장에 의해. 생어 시퀀싱 데이터 P30 CA023168에서 지 원하는 퍼듀 유전체학 핵심 시설에 의해 인수 되었다. 메리 Witucki 퍼듀 대학 센터에서 암 연구 여름 학부 연구 프로그램 캐롤 카운티 암 협회 지원 지원 한다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. 우리 감사 벤자민 카터, 런 닝, 그리고 테일러 Sabato 원고에 중요 한 피드백을 제공. 우리는이 작품의 생화학의 부 그리고 Zebrafish 관심과 우리의 zebrafish 식민지의 복지에 그들의 헌신에 대 한 퍼듀 대학에서 연구를 위한 센터 감사합니다. 마지막으로, 우리는 퍼듀 유전체학 핵심 시설, 감사 하 고 필립 산 미 구 엘의 기여에 대해서 NGS 서비스.

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 CRISPR Cas9 기술을 사용 하 여 zebrafish 척추 동물 모델 시스템에서 유전자 녹아웃의 생산을 설명 합니다. 프로토콜의 수는 이전 zebrafish15,25,26,50,,5152CRISPR 중재 게놈 엔지니어링 수행을 설명 되었습니다. HMA와 여러 heterozygous 생선, 만들려고 간단, 경제적, 그리고 실험적으로 강력한 프로토콜의 NGS이이 프로토콜 수 간단 하 고 그러나 reproducibly 일관 된 실험 기법, 특히에서 결합 하 여 노력 이전에 빌드 CRISPR 중재 mutagenesis zebrafish에서 실험실 다양 한 훈련 및 경험, 뿐만 아니라 교육 연구소 직원과 직원에 대 한 적절 한입니다.
RNAs는이 프로토콜에 포함 된 설명서의 설계 및 합성에 대 한 권장 사항. 가이드 RNA 설계에에서 주요 고려 대상에서 효과의 최소화입니다. CRISPR-사용자가 사용자 친화적인 그래픽 인터페이스 모두 대상에 가이드의 활동 및 오프 대상 효과34, 의 기회를 예측 하는 계산 도구를 액세스할 수 있도록 여러 가지 예측 알고리즘 개발 되었습니다 35,36. 특정 zebrafish 시스템의 장점은 오프 대상 효과의 저하 속도 Cas9 배아에 주입 되며 따라서 식 과도, 있는 감소에서 대상 효과53을 마우스에 표시 되었습니다 때문에. 그럼에도 불구 하 고, 오프 대상 효과 zebrafish54에 입증 되었습니다. 한 오프 대상 효과 대 한 제어 방법은이 가이드는 매우 다른 오프 대상 사이트에 영향을 미칠 가능성이 있을 것 이라고 동일한 유전자를 대상으로 하는 두 개의 독립적인 가이드 RNAs에 의해 생성 된 표현 형 설립자 zebrafish에. 이 프로토콜에서 설명 되지 않은 대상 오프 효과 최소화 하기 위해 다른 방법을 높은 효율으로 수리 대상 DNA 단일 가닥 휴식을 생성 하는 돌연변이 Cas9의 사용 이다. 반대로 보완 서로 근접 내의 DNA 닉스 페어링 원하는 장소에서 효과적인 indel 형성에 결과 긴 고 오프 대상 효과55,56를 최소화 합니다.
-대상 효과의 다른 요금 이외, 다른 sgRNAs mutagenesis 원하는 대상57,,5859의 다른 비율을 가질 수 있습니다. 이 프로토콜의 heteroduplex 밴드 형성33,40을 사용 하 여 주어진된 sgRNA mutagenesis의 효율성을 분석 하 HMA를 사용 합니다. Heteroduplex 밴드와 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 쉽게 해결할 수 있습니다 불일치를 포함 하는 PCR에서 생성 된 DNA 가닥의 교 잡에 의해 만들어집니다. 일반적으로 indel 형성을 측정 하는 데 사용 하는 다른 메서드와 달리 T7 endonuclease 등 분석 결과 또는 높은 해상도 분석25,26, HMA 잘라 일치 하지 않는 DNA, 비싼 효소를 필요 하지 않습니다.를 녹여 필요 하지 않습니다. PCR의 복잡 한 분석 곡선 녹아 있습니다. 중요 한 것은, 물고기와 함께 돌연변이 식별 하는 비용을 줄일 수 있는 노크 아웃 라인의 다음 생산에 필요한 수를 최소화 하기 위해 수 사관 수 또한 HMA를 사용 하 여 주입 된 인구에서 indel 형성의 높은 속도 확인 하는 원하는 특성.
CRISPR 기반 indels 생성의 비교적 쉽게 한 번에 여러 여러 유전자의 대립 유전자의 생성을 수 있습니다. 웹 기반 소프트웨어는 생어를 사용 하 여 heterozygous 물고기에서 단일 돌연변이의 분석에 사용할 수 있는 PCR 제품49의 연속. 경우 3 개 이상의 CRISPR 돌연변이 대립 유전자 분석은 NGS는 indel의 자연 하는 가능성이 더 비용 효과적이 접근으로 indel의 자연 하 수 오에 특징을 최대 50 다른 대립 유전자의 풀 후부 터 (참조 테이블의 재료)60,,6162. 이러한 경제 규모의 가능성이 학부 실험실 환경에서 특히 유용 것입니다.
요약 하자면,이 프로토콜 reproducibly 필요가 적은 성인 생선을 만들어 분석 성공적으로 관심의 돌연변이 체 대립 유전자를 식별 하는 (특히, sgRNA)에서 높은 품질 CRISPR 시 약을 생성 하기 위한 단계별 지침을 제공 하 또한 원하는 라인 생성의 비용과 시간을 줄일 수 있습니다. 중요 한 것은,이 프로토콜을 저렴 한 방식으로 돌연변이 제 브라를 생산 하는 한정 된 자원 가진 실험실에 의해 적용할 수 있는 설계 되었습니다. 또한, 우리는이 이렇게 학부생에 적합 하 고 따라서 교육 및 CRISPR 기반 게놈 편집 실습에 관심 있는 학부 학생 들의 교육 기회를 확장 발견 했다.

진핵생물에서 분자 기계의 보전 기초 연구를 위한 모형 유기 체를 사용 하 여 전원. 이러한 모델 시스템의 많은 타겟된 유전자 녹아웃 유전자 제품의 생물 학적 또는 질병 과정에의 기여 하 등 역 유전 접근의 사용을 촉진 한다. 제 브라와 같은 유기 체에서 유전자 중단 기법 역사적 DSBs1,2의 부정확 한 수리 결과 frameshift 돌연변이의 대상된 도입에 의존 했습니다. 보편적으로 거의 모든 세포 유형 및 유기 체에 존재 하는 두 경로 중 하나를 통해 DNA 병 변 복구는 DSB 게놈에 도입 하는 경우: 비 동종 끝 결합 (NHEJ)과 상 동 감독 수리 (HDR)3,4 . NHEJ 기계의 정확 하지 않은 자연 자주 다양 한 길이5,6,7,,89의 indels를 생성합니다. Frameshift 돌연변이 유전자의 코딩 순서에의 소개는 종종 유전자 작동 하지 않는 렌더링 조 숙한 정지 codon를 생성할 수 있습니다.
초기 게놈 엔지니어링 전략 홍보 indels zebrafish 포함 meganucleases, 아연 손가락 nucleases, 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases, nuclease 특정 게놈을 대상으로 DNA 단백질 상호 작용을 활용 하는 모두의 대상 DSB10,11,12,13,,1415를 도입. 그러나, 이러한 기술은 종종 힘들고 복잡 한 엔지니어링 nuclease을 대상으로 관심사의 DNA 순서를 생성 하는 데 필요한 때문에 적용 하기 어려운 있습니다. 이전 전략, 달리 CRISPR 기반 유전자 편집 하지 대상에 대 한 단백질 DNA 상호 작용에 의존지 않습니다. 대신, CRISPR 관련 (Cas) endonuclease 관심16,,1718,19의 게놈 사이트 대상 염기 기본 쌍 상호 작용을 사용 하는 RNA 가이드를 통해 감독 ,,2021. 설계는 RNA의 단순 그것을 대상에 대 한 상호 작용을 페어링 원하는 자료와 가이드는 상대적으로 쉽게 원하는 장소에 Cas endonuclease 대상입니다. 유형 II CRISPR 시스템 특히 널리 개발 되었습니다는 단일 다중 도메인 Ca nuclease (Cas9) endonuclease 활동을 자극 하는 DNA와 상호 작용을 필요로 하는의 사용을 포함 한 여러 유리한 기능 게놈 편집 응용 프로그램에 대 한 사용 하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 동족 DNA 시퀀스18대상. 동족 sgRNA의 대상에 대 한 필요한 순서 요구 사항을 잘 이해19, 고 원하는 sgRNA 쉽게 체 외에 전사에 의해 생성 된. 단순 하 고 CRISPR/Cas9 접근의 견고성 크게 zebrafish 및 다양 한 다른 유기 체에 타겟된 유전자 조작 용이.
크게는 타겟된 게놈 CRISPR 기반 시 약 개발의 결과로 제 브라에서 편집을 수행 하는 향상 된 능력 증가 프로세스 중앙 신경의 개발 같은 척추 생물의 상징을 공부 하는 기회 시스템입니다. Zebrafish 게놈 orthologs를 뿐만 아니라 인간22질병와 관련 된 유전자의 84%는 인간 게놈에서 발견 단백질 코딩 유전자의 70% 포함 되어 있습니다. Zebrafish 개발 전시 역 유전자 연구에 그것의 사용을 강화 하는 몇 가지 주요 자질: 배아 큰 클러치에서 누워 있다, microinjection, 및 성인 zebrafish 의무가 유전자 조작 하는 어머니 로부터 외부 개발 3 개월, 원하는 라인23의 급속 한 전파에 대 한 허용에 의해 성적으로 성숙.
수많은 프로토콜 사용할 수 있는 다양 한 생성 하 고 식별 zebrafish24,25,26,,2728,29 CRISPR 파생 indels 접근법을 설명 하는 ,,3031. 그러나,이 절차의 많은 시간 집중, 고가의 장비에 대 한 액세스를 필요 되며 제한 된 전문 기술 연구소에 대 한 일 수 있다. 여기 설명 하는 단계는 간단 하 고 강력 하 고 경제적인 CRISPR/Cas9-전략 엔지니어 zebrafish 녹아웃 라인을 제공 합니다. SgRNAs DNA oligonucleotides (oligos)를 사용 하 여 합성 하는 매우 효율적인 키트를 사용 하 여가이 프로토콜에 설명 합니다, 그리고 되었습니다 다른 접근 비슷합니다 이전32설명. 설명된 프로토콜 포함 두 단계 특히 크게 라인 CRISPR 돌연변이의 분석을 단순화 하는: 쉽게 결정 게놈 수정의 존재 및 시퀀싱 분석의 PCR 기반 HMA33 의 단계별 사용 heterozygous zebrafish 신속 하 고 쉽게 여러 indels 경제적인 방식으로의 성격을 결정 하. 또한, 단계별 지침은 강력한 선택, 믿을 수 있는 생산 및 가이드 RNAs의 주입에 대 한 포함 되어 있습니다. 여기에 제공 된 단계에는 다양 한 전문 실험실 인원 zebrafish에 유전자 녹아웃의 식별을 가능 하 게 강력 하 고 상대적으로 저렴 한 프로토콜을 예증 하다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CRISPOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breaking-Cas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChopChop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free technique</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free ethanol</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Protein</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Cas9 protein with nuclear localization signal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target specific oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>Synthesize guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers flanking guide RNA cut site</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers flanking guide RNA cut site</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td>Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen sgRNA Synthesis Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E3322</td>
			<td>In vitro transccribe guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B52</td>
			<td>RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Load Dye</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7025S</td>
			<td>Loading DNA for electropheresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Ammonium acetate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>Clean up reagent for purification of guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof, nuclease-free)</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free Water</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For synthesis and purification of guide RNAs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase away</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10328011</td>
			<td>Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder, 100 bp</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0467S</td>
			<td>Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder, 1 kb</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0552S</td>
			<td>Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0364S</td>
			<td>Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17919</td>
			<td>Casting polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td>Casting polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Polyacrylamide (19:1)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0154</td>
			<td>Casting denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-100G</td>
			<td>Casting denaturing polyacrylamide gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Gel Loading Dye (2x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0641</td>
			<td>Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Visualization of nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBER Green</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S7563</td>
			<td>Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>RNA clean up, PCR purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyTaq Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21105</td>
			<td>For amplification of DNA using PCR.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>PCR amplification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 embryo media</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td>Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td>Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB0875711Z</td>
			<td>Store embryos, cast injection plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Denville</td>
			<td>CA3510-8</td>
			<td>Casting injection plate, agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td>To create wells to hold embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290&#160;</td>
			<td>Dye for visualization of injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>To calibrate needle injection volume.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Moving embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Cutting injection needle, tail clipping adult fish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Maintaining embryos at 28.5 oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verticle pipette puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>700C</td>
			<td>Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-58-10</td>
			<td>Geneate needles for injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Load solution into injection needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 820</td>
			<td>Injecting embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Injecting embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Polyacylamide (29:1)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0156</td>
			<td>Heteroduplex gel casting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Casting injection plate, agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>Casting injection plate, agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>To expell liquid from the capillary for embryo injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L tips</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For all aspects of the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS Sequencing platform: Wideseq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sequence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sequence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient production and identification of crispr/cas9-generated gene knockouts in the model system danio rerio

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복의 연쇄 상 구 균 pyogenes (CRISPR) 시스템의 다양 한 유전자 수정을 빠르게 생성 하는 사용자 정의 플랫폼의 개발 활성화 생물, zebrafish를 포함 하 여 CRISPR 기반 게놈 편집 사용 하 여 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 관심, genomic DNA (gDNA) 대상에 CRISPR 관련 (Cas) endonuclease 대상 Cas endonuclease 두 배 물가 틈 (DSB)을 생성. 삽입 또는 삭제 (indels) 오류가 메커니즘 리드에 의해 DSBs의 수리. 이 종종 소개 함으로써 단백질 null 대립 유전자를 만드는 코딩 시퀀스 내에서 조 숙한 정지 codon frameshift 돌연변이 일으킬 수 있습니다. CRISPR 기반 게놈 엔지니어링만 몇 분자 구성 요소를 필요로 하 고 쉽게 microinjection에 의해 zebrafish 태아에 도입. 이 프로토콜 zebrafish microinjection에 대 한 시 약 CRISPR를 생성 하 고 CRISPR 수정 유전자의 생식 전송 전시 물고기를 식별 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 방법은 sgRNAs, microinjection CRISPR 시 약의 indels heteroduplex 이동성 분석 결과 (HMA), 및 특성화는 indels의 PCR 기반 메서드를 사용 하 여 대상 사이트에 유도의 식별에 생체 외 녹음 포함 낮은 처리량 및 강력한 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여-기반 접근 heterozygous 물고기에서 수집 하는 여러 PCR 제품을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필요한 물고기의 수와 종류의 분석을 수행 하는 데 필요한 장비를 최소화 하기 위해 유선형의. 또한,이 프로토콜은 되도록 설계 되었습니다 사용에 대 한 의무가 학부생, CRISPR 기반 수행에 관심이 있는 연구 그룹에 의해 경제적으로 고용 될이 강력한 도구를 사용 하면 포함 하는 경험의 모든 수준의 실험실 개인에 의해 제 브라에 게놈 수정입니다.

이 프로토콜에서 설명 하는 실험 방법의 제 브라 노크 아웃 라인 CRISPR/Cas9 기술을 사용 하 여 효율적이 고 비용 효율적인 생산을 위한 수 있습니다. 다음 수치 해석 및이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과의 문제 해결이 문서에 포함 되었습니다. 다음 성공적인 생산 그리고 CRISPR 시 약의 microinjection, zebrafish 태아 명백한 고기 및 indel 형성 HMA를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. CRISPR 실험의 성공을 시각화 하는 유용한 컨트롤은 안료 생산 유전자를 대상으로 1.5 단계에서 설명 하는 sgRNA 사용 하 여 tyrosinase. Cas9 유도 indel tyrosinase 에서 염색의 손실에 결과 형성과 48에 의해 쉽게 득점 hpf (그림 1). 주입에 성공 했다에 대 한 CRISPR 시 약의 그 준비를 위해 또 다른 유용한 제어는 전체 길이 확인 하는 것입니다 (120 nt) sgRNA 변성 polyacrylamide 젤 (그림 2, 레인 1와 2)를 사용 하 여 합성 되어 있다. RNA를 타락 하는 경우 그것은 나타날 수 있습니다 얼룩, 예를 들어 레인 3 (그림 2)은 저하 RNA 사출에 적합 하지 않습니다.
Tyrosinase, 같은 명백한 고기 초래 하지 않는 CRISPR Cas9 대상 유전자의 indel 형성 주파수 분석을 HMA 분석은 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. sgRNA/Cas9 heteroduplex 밴드의 형성 및 homoduplex 밴드 (그림 4)의 강렬의 감소에서 HMA 결과 사용 하 여 분석 하는 배아를 주입. Heteroduplex 밴드의 존재는 더 잠재적인 설립자 물고기 (그림 4 및 그림 5), 성인 설립자 ( 의 생식 전송 효율을 분석 하 고 microinjected 배아에서 식별 하기 위해이 프로토콜에 활용 그림 6), 그리고는 indel heterozygous F1 물고기 (그림 7)의 존재를 확인 하. Heterozygous 물고기는 indel을 포함 하는 후보로 NGS는 indel의 성격을 파악 하 고 조 숙한 정지 codon 대상 유전자의 코딩 지구에 존재 여부를 확인 하는.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> 그림 1 : Zebrafish 태아 전시 tyrosinase 1 셀 단계에서 대상으로 하는 sgRNA와 함께 주입 했을 때 안료 결함. (A) 야생-타입, uninjected 48에 배아 hpf와 (B) 주입 48에서 배아 hpf. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> 그림 2 : 합성 키트를 사용 하 여 sgRNA의 녹음 방송 생체 외에서 . Oligos는 sgRNA 종합 키트 지침에 따르면 녹음 방송 생체 외에서 를 사용 하 여 합성 했다. 500 ng RNA의 설명 된 대로 요소/페이지 젤에 실행 했다. sgRNA 레인 1과 2에 로드 밴드 전체 길이 그대로 120 nt RNA에 해당 표시 됩니다. 레인 3에 sgRNA 사출에 적합 하지 않습니다 저하 RNA 샘플을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> 그림 3 : 24 hpf 주입 태아의 건강의 비교. 24 생활 배아 (A) 개발 hpf, (B) 개발 중단은 배아에서 쉽게 구별 된다. (B)를 닮은 나 크게 있는 태아 척추 곡률 등 (a) 기능을 변경 또는 머리를 변경 및 눈 개발 접시에서 제거 되어야 합니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> 그림 4 : SgRNA Cas9의 Heteroduplex 이동성 분석 결과 zebrafish 태아 microinjected. 샘플 당 5 배아의 풀 72에서 수집 된 hpf 및 gDNA 추출 되었다. Heteroduplex 분석 수행, 설명 된 대로 샘플 500 동등 하 게 로드 된 DNA의 ng. 레인: M = 100 bp 마커; 1 = uninjected 제어; 2 사출 샘플 1; = 3 = 사출 샘플 2. 예상 밴드 크기 98 = 혈압.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> 그림 5 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 gDNA 성인 CRISPR 주입 zebrafish의 꼬리에서 추출의. 배아는 sgRNA와 Cas9 단백질 주입 했다 성인 (3 개월)로 성장 했다. 물고기 B와 C heteroduplex 악대를 전시 하 고 이후에 생식 전송 indels;을 식별 하기 위해 사육 했다 긍정적인 heteroduplex 밴드를 전시 하지 않습니다 때문에 물고기 A는 이후 분석에 사용 되지 않습니다. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 = 물고기; 3 = 물고기 B; 4 물고기 C. 예상 밴드 크기 = 98 = bp. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> 그림 6 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 단일 배아 전송 생식 indels를 식별 하는 야생-타입 물고기 F0 CRISPR 주입 제 브라를 번 식에 의해 생성 된의. Zebrafish 성관계 했다 F1 배아 72 h. 단일 배아에 대 한 성장 수집 그리고 heteroduplex 분석 수행 설명 된 대로. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2-10 차선 당 하나의 F1 배아를 =. 이 젤 10 중 7 배아는 indel의 70%의 생식 전송 속도 나타내는 긍정적인 heteroduplex 밴드 표시 보여줍니다. 밴드 크기 예상 = 98 bp. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> 그림 7 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 성인 F1 zebrafish 꼬리 클립의. 성인 F1 물고기 HMA indels를 식별 하 여 득점 했다. 긍정적인 heteroduplex 밴드 전시 물고기가 했다 PCR 증폭 및 넓은 시퀀싱 분석에 대 한 돌연변이의 특성을 확인 하. (A) 차선: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 = 물고기 (4 혈압 삭제, 1 bp 불일치). (B)이이 F1 생선과 같은 설립자에서 확인 되었다 아직 다른 heteroduplex 패턴화, 하나의 설립자에서 여러 수정 된 대립 유전자의 생식 전송을 나타내는 표시. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 물고기 (4 bp 삽입, 7 bp 불일치), B = 3 = 물고기 C (4 혈압 삭제, 4 혈압 불일치). 각 이러한 indels NGS 정한 대상 유전자의 코딩 순서에서 조 숙한 정지 codon를 만들었습니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

efficient-production-identification-crisprcas9-generated-gene

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

21.7K 조회수.  Purdue University. 타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

연구

유전학

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells and mediating high levels of gene expression. However, their ability to integrate into the host cell genome enhances the risk of insertional mutagenicity and thus raises safety concerns and limits their usage in clinical settings. Further, the persistent expression of gene-editing components delivered by these integration-competent lentiviral vectors (ICLVs) increases the probability of promiscuous gene targeting. As an alternative, a new generation of integrase-deficient lentiviral vectors (IDLVs) has been developed that addresses many of these concerns. Here the production protocol of a new and improved IDLV platform for CRISPR-mediated gene editing and list the steps involved in the purification and concentration of such vectors is described and their transduction and gene-editing efficiency using HEK-293T cells was demonstrated. This protocol is easily scalable and can be used to generate high titer IDLVs that are capable of transducing cells in vitro and in vivo. Moreover, this protocol can be easily adapted for the production of ICLVs.

We describe the production strategy of integrase-deficient lentiviral vectors (IDLVs) as vehicles for delivering CRISPR/Cas9 to cells. With an ability to mediate quick and robust gene editing in cells, IDLVs present a safer and equally effective vector platform for gene delivery compared to integrase-competent vectors.

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a promising vector for gene therapy application. Here, baculovirus is produced by transient transfection of the baculovirus plasmid DNA (bacmid) in an adherent culture of Sf9 cells. Baculovirus is subsequently expanded in Sf9 cells in a serum-free suspension culture until the desired volume is obtained. It is then purified from the culture supernatant using heparin affinity chromatography. Virus supernatant is loaded onto the heparin column which binds baculovirus particles in the supernatant due to the affinity of heparin for baculovirus envelop glycoprotein. The column is washed with a buffer to remove contaminants and baculovirus is eluted from the column with a high-salt buffer. The eluate is diluted to an isotonic salt concentration and baculovirus particles are further concentrated using ultracentrifugation. Using this method, baculovirus can be concentrated up to 500-fold with a 25% recovery of infectious particles. Although the protocol described here demonstrates the production and purification of the baculovirus from cultures up to 1 L, the method can be scaled-up in a closed-system suspension culture to produce a clinical-grade vector for gene therapy application.

In this protocol, baculovirus is produced by transient transfection of baculovirus plasmid into Sf9 cells and amplified in a serum-free suspension culture. The supernatant is purified by heparin affinity chromatography and further concentrated by ultracentrifugation. This protocol is useful for the production and purification of baculovirus for gene therapy application.

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms to questions surrounding insect's interactions with their host plants. Genomic resources are available for several aphid species, and with advances in the next-generation sequencing, transcriptomic studies are being extended to non-model organisms that lack genomes. Furthermore, aphid cultures can be collected from the field and reared in the laboratory for the use in organismal and molecular experiments to bridge the gap between ecological and genetic studies. Last, many aphids can be maintained in the laboratory on their preferred host plants in perpetual, parthenogenic life cycles allowing for comparisons of asexually reproducing genotypes. Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid, provides one such model to study insect interactions with toxic plants using both organismal and molecular experiments. Methods for the generation and maintenance of the plant and aphid cultures in the greenhouse and laboratory, DNA and RNA extractions, microsatellite analysis, de novo transcriptome assembly and annotation, transcriptome differential expression analysis, and qPCR verification of differentially expressed genes are outlined and discussed here.

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

The aphid Aphis nerii colonizes on highly-defended plants in the dogbane family (Apocyanaceae) and provides numerous opportunities to study plant-insect interactions. Here, we present a series of protocols for the maintenance of plant and aphid cultures, and the generation and analysis of molecular and -omic data for A. nerii.

생물 학적 문화와 진딧물 nerii에 유전자 발현 측정 유지: 식물 곤충 상호 작용에 대 한 비-모델 시스템

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...