Há não há conflitos de interesse relacionados a este relatório.

Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais seguiram a diretriz do National Institutes of Health e cuidados institucionais do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Michigan. Usar soluções livre de RNase e pipetar dicas em todo o protocolo. Limpe a área de trabalho, pipetas, tubos e centrífuga com solução de RNase descontaminação seguindo as orientações do fabricante (ver Tabela de materiais).
1. sgRNA seleção de alvo
<ol><li>Usando um navegador da web, abra a página da Web: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>~ 60 pares de bases (bp) da sequência flanqueando a edição desejada de interesse de entrada (ou seja, 30 bp 5' e 3' da edição desejada).</li>
		<li>Selecione o genoma elegans de Caenorhabditis no menu pulldown.</li>
		<li>Selecione o motivo de Protospacer adjacentes (HF1-20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) no menu suspenso.</li>
		<li>Clique em enviar. Na página de resultados, escolha a sequência de top ranking destino mais próxima para a edição de interesse. Se não há alvo apropriado sites dentro de flanqueamento 60 bp sequência de entrada, expandir a sequência de consulta até 100 bp (ou seja, 50 bp ambos os lados do desejado editar).</li>
	</ol>
</li>
	<li>De uma fonte disponível, por exemplo, synthego, obter um 20-mer alvo sgRNA com as seguintes especificações: 3 nmol; sem modificações.</li>
	<li>Após a recepção, centrifugue sgRNA liofilizado contendo tubo em > 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Adicionar 60 µ l de TE nuclease-livre para o tubo e ressuspender delicadamente pipetando acima e abaixo de 15 - 20 vezes usando uma pipeta P200. A concentração final é 50 µM.</li>
</ol>2. homologia-dirigido reparação Template Design
<ol><li>Desenha um HDR ssODN modelo que contém: 1) a mutação de interesse, 2) um site exclusivo em-frame endonuclease de restrição, 3) uma mutação silenciosa de um ou ambos os Gs dentro da sequência de NGG PAM e 4) 50 bp 5' e 3' homologia braços flanqueando a primeira e última mutação. (Figura 1) 9 , 10.<ol>
<li>Se a mutação da sequência NGG PAM não é possível, introduza mutações silenciosas de 5-6 dentro da sequência de reconhecimento do alvo de sgRNA para evitar clivagem mediada por sgRNA do ssODN modelo HDR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De uma fonte disponível, por exemplo, idtdna, obter um "do oligonucleotide Ultramer DNA" com os seguintes parâmetros: escala: nmol 4; Formulação: Nenhum; Purificação: Padrão de dessalinização.</li>
	<li>Após a recepção, centrifugue ssODN liofilizado contendo tubo em > 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Re-suavemente suspenda ssODN para uma concentração final de 100 µM em ddH nuclease livre2O pipetando acima e abaixo de 15 - 20 vezes usando uma pipeta P200.</li>
</ol>3. projeto genotipagem Primers
<ol><li>Desenha um primer conjunto flanqueando a modificação do genoma para gerar um ~ 400-700 bp PCR amplicons11.</li>
	<li>Otimize condições de ciclagem do PCR para produzir um único e específico amplicon11.</li>
</ol>4. preparar injeção Mix
<ol><li>Centrifugue a tabela 1 reagentes na velocidade máxima por 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Na ordem listada, adicione tabela 1 reagentes a um tubo PCR nuclease-livre.</li>
	<li>Misture bem, pipetando suavemente 10 vezes acima e para baixo com uma pipeta de P20.</li>
	<li>Incube a mistura de injeção por 10 min à temperatura ambiente.</li>
</ol>5. injeção protocolo
<ol><li>Micropipeta de injeção de carga com aproximadamente metade da injeção mix12. Salve o restante mistura de injeção, no caso a agulha de injeção entope ou quebra.</li>
	<li>Quebre a ponta da micropipeta para que ~ 20-30 psi produz uma gradual corrente solução12. Nota: Dicas de diâmetro maiores negativamente afetam a saúde animal e diminuem o rendimento de progênie F1 .</li>
	<li>Injectar 10-15 jovens adulto vermes em ambos os braços gonadais se possível12. Se não, injeção em um braço gonadal é suficiente.</li>
	<li>São permitidos animais injetados (P0) recuperar para 1-2 h à temperatura ambiente em um prato de mídia (NGM) nematoides crescimento OP50-semeado de 35mm. Subsequentemente, o único injetado P0 os animais às placas NGM individuais OP50-semeado 35mm usando um fio de platina worm pega12.</li>
</ol>6. tela P0 placas e único mCherry(+) F1s
<ol><li>Pós-injeção de dois dias, identificar placas de P0 contendo progênie de1 F expressando mCherry na faringe usando um microscópio fluorescente (Figura 1, dia 2 - 3). Escolha placas de três P0 que contêm a maioria dos animais de1 mCherry(+) F.</li>
	<li>De cada um dos três selecionados pratos P0 , único escolher 8-12 mCherry(+) F1 animais para um total de 24-36 mCherry(+) F1s usando um worm (Figura 1, dia 2 - 3). Nota: mCherry(-) animais também podem ser escolhidos destas placas de0 P, mas a probabilidade de identificar corretamente editado animais é muito baixa (Figura 2A).</li>
	<li>Permita individual F1s a auto-fertilização e põem ovos por 1-2 dias à temperatura ambiente.</li>
</ol>7. único Worm PCR e genotipagem
<ol><li>Após 1-2 dias de postura, transferi o F1s individuais tampões de tubo de tira PCR contendo 7 µ l de tampão de Lise Worm usando uma picareta worm (tabela 2, Figura 1, dia 4-5).</li>
	<li>Tubos de centrífuga de PCR na velocidade máxima por 1 min à temperatura ambiente para trazer os animais até o fundo do tubo e congelar os tubos a-80 ° C durante 1 h. Nota: Worms podem ser armazenadas a-80 ° C indefinidamente.</li>
	<li>Lyse vermes congelados em um thermocycler usando o seguinte programa: 60 ° C por 60 min, 95 ° C por 15 min, segurar de 4 ° C.</li>
	<li>Set-up do PCR mastermix conforme mostrado na tabela 3.</li>
	<li>Adicionar 21 µ l de PCR mastermix limpa tubos de PCR e em seguida, adicione 4 µ l do lysis do verme da etapa 3. Misture bem, usando uma pipeta e executar programa PCR, seguindo as orientações de fabricantes (veja a Tabela de materiais).</li>
	<li>Purificar as reações de PCR usando um kit de DNA limpo e concentre-se, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). Eluir o DNA pela adição de 10 µ l água para a coluna de rotação.</li>
	<li>Set-up mastermix de enzima de restrição conforme mostrado na tabela 4.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de mastermix a enzima de restrição para cada reação de PCR limpa e incubar durante 1-2 h a 37 ° C13.</li>
	<li>Separado digerido produtos do PCR em um gel de agarose 1,5% correr em 120 V usando 1 x reserva de Tris-Acetato-EDTA (TAE)14.</li>
</ol>8. identificação e verificação de sequência dos animais editados
<ol><li>Examine amostras de enzima digerida para a presença de bandas que indicam potencial edição animais14 (Figura 1, dia 4-5). Nota: Carrega um controle de N2 para identificar potenciais mutações indel que podem ser observadas como mudanças no tamanho de banda e/ou digestão enzima de restrição inesperados e complexos padrões de borda.</li>
	<li>Depois de identificar potenciais animais editados, use o restante 3 μL de Lise worm e repetir a reação de PCR. Não limpe ou enzima de restrição digerir a reação de PCR, depois que o programa está completo. Carregar a reação de PCR em um gel de agarose a 1%, separar e extrair a banda usando um gel de extração kit15 (ver Quadro de materiais).</li>
	<li>Gel de16 Sanger sequência extraído DNA usando o primer de F1 para identificar os animais corretamente editados (figura 1A) Nota: Heterozigoto leituras conterá sobrepostos picos devido à presença do tipo selvagem e engenharia alelo.</li>
	<li>Para obter animais homozigotos de animais editados heterozigotos verificados, único 8-122 animais e executar as etapas de 7-8.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms.">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li><li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Guided+Genome+Engineering+in+C.+elegans.">CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).</li><li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+technologies+for+genome+editing.">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148 (2016).</li><li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans.">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li><li>Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient,+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests."> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis+.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Gel+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sanger+sequencing.">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li><li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+(and+Other+&amp;#34;Omics&amp;#34;)+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care.">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &amp;#34;Omics&amp;#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li><li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis?.">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?.</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li><li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse,+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis.">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li></ol>

Agradecemos a membros do laboratório de leitura crítica deste manuscrito Beg. Cepas foram fornecidas pelo centro de genética Caenorhabditis , que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Pesquisa no laboratório Beg é suportada por subvenções do NIH (R01 NS094678) e Associação de Distrofia Muscular (MDA382300) para A.A.B.

O sistema CRISPR-Cas9 é uma ferramenta poderosa e eficaz para precisamente modificar o genoma de organismos modelo. Aqui, demonstramos que sgRNAs quimérico20 juntamente com ssODN HDR modelos habilitar a geração altamente eficiente de genômicas mutações pontuais em c. elegans. Importante, demonstramos que a entrega da RNP produz alta eficiência de edição quando fluorescência é usada como um marcador de seleção co, destacando a facilidade e confiabilidade da técnica.
A maioria dos métodos de CRISPR-Cas9 para engenharia de genoma de c. elegans depende de origens genéticas específicas ou de estratégias de co-CRISPR1. O método de co-CRISPR tem provado para ser uma ferramenta extremamente útil que aumenta a probabilidade de se obter uma edição de sucesso do genoma. No entanto, co-CRISPR métodos requerem introduzindo um selecionável pelo fenótipo editar em um locus de marcador que enriquece para a edição de genoma de interesse. Enquanto poderoso, introduzir selecionáveis fenótipo-rolamento mutações pode ser indesejável, se a tensão para editar ou a mutação de ponto desejada de interesse próprio apresenta fenótipos que podem ser exacerbados ou suprimidos pelo fenótipo marcador. Além disso, estratégias de co-CRISPR necessitam criar um intervalo adicional de fita dupla em um locus de marcador que podem contribuir para efeitos fora do alvo. Aqui, apresentamos um método que usa um marcador fluorescente transitório que não só serve para identificar os animais de0 P injetados com sucesso, mas também enriquece para edições de genoma adequado. Nossos dados demonstram esse método significativamente enriquece para animais com sucesso editados em comparação com animais não-fluorescente e fornece várias vantagens distintas: 1) só um direcionamento específico do site sgRNA é necessário, 2) uma 5-fold diminuição Cas9 e concentração de sgRNA, 3) independência de estirpe e fenótipo-seleção e 4) uma carga de trabalho nominal de triagem (~ 24 F1s). Robusto CRISPR-Cas9 genoma edição na geração1 F observou-se usando esse método. Nomeadamente, a estratégia de detecção baseada em enzima PCR-restrição descrita permite a detecção inequívoca de mono e bi-alélico animais editados na geração1 F. Finalmente, a estratégia de genotipagem facilita a identificação de possíveis mutações indel, que pode ser observado como banda PCR mudanças quando comparados aos controles de N2, que são ou não sensíveis à restrição digest ou rendimento complexo bandas quando digerido.
O advento da próxima geração sequenciamento juntamente com esforços de grande escala genômica acelerou-se a identificação de variantes genômicas que segregar com doença21. No entanto, testes funcionais de patogenicidade não foram demonstrados para a maioria das variantes em sistemas celulares e organismos modelo. Neste estudo, escolhemos o gene de sod-1 em c. elegans , introduzir o amplamente estudados ALS-associado de SOD-1G93A mutação. Até à data, esta mutação foi modelada e estudou em c. elegans e ratos usando principalmente a superexpressão de transgénico. Embora superexpressão de variantes em modelos animais pode recapitular chave celular, moleculares e comportamentais aspectos da doença, é cada vez mais claro que a 'dose' é um fator atenuante na determinação de fenótipos22. Por exemplo, cópia elevado número SOD-1G93A os ratos carregando ~ 24 cópias do gene mutante humano SOD-1 exibem o curso da doença muito acelerado em comparação com ratos SOD-1G93Adl , que carregam apenas ~ 8-10 cópias23,24. Aqui, demonstramos que nosso método CRISPR Cas9 RNP-baseado pode ser utilizado para gerar rapidamente humanas associada a variante mutações no gene ortólogos worm sem exigir a superexpressão de transgênico, em um esforço para replicar mais precisamente a genética contexto da doença. Nosso método fornece uma plataforma viável para produzir e testar variantes genômicas de significado desconhecido no contexto do controlo regulamentar endógeno e expressão, que exclui dos limites da superexpressão. Finalmente, também usamos este método a tag genes endógenos com proteínas fluorescentes (ou seja, as boas práticas agrícolas), que irão fornecer uma ferramenta adicional para visualizar como variantes afetam o volume de negócios, agregação e a localização da proteína.

Recentes avanços tecnológicos têm radicalmente transformada e acelerou a capacidade de genomas de engenheiro precisamente. Em particular, o sistema CRISPR-Cas9, que depende da endonuclease guiada por RNA Cas9 para induzir uma pausa de fita dupla (DSB) perto da sequência alvo do interesse, tem sido extensivamente usado para engenheiro com precisão o genoma da maioria dos organismos modelo usados no investigação biomédica1,2,3,4. Significativamente, o uso de CRISPR-Cas9 destravou genoma edição mesmo em espécies de difícil como c. elegans5. Independentemente da espécie, gerar mutações pontuais com o genoma de CRISPR-Cas9 baseado editando o sistema se baseia em três componentes principais: 1) Cas9 endonuclease, 2) um guia único RNA (sgRNA) que direciona a endonuclease Cas9 para uma sequência do alvo e 3) um usuário projetado modelo de reparação de homologia-dirigido (HDR) contendo o desejado edit(s) de juros2.
Existem vários métodos que podem ser usados para introduzir o direcionamento sgRNA e Cas9 nuclease em células incluindo plasmídeo, RNA e de métodos de entrega baseada em viral6. Recentemente, entrega direta de ribonucleoproteínas sgRNA pre-complexado-Cas9 (RNPs) surgiu como uma ferramenta poderosa e eficiente no genoma baseados em CRISPR-Cas9 edição7. A entrega direta de pre-complexado CRISPR-Cas9 RNPs tem várias vantagens distintas, a saber: 1) RNPs ignorar a necessidade de transcrição celular e tradução, 2) RNPs são limpas rapidamente, que pode aumentar a especificidade, reduzindo o tempo disponível para o alvo clivagem e 3) RNPs contêm elementos de DNA/RNA não estrangeiros que contorna a introdução de sequências não-nativas no genoma hospedeiro através da integração aleatória. Juntos, esses atributos prováveis fornecem uma rajada curta duração de edição de CRISPR no alvo, minimizando os efeitos fora do alvo.
Descreveremos um protocolo simples e eficiente para a introdução de alterações genômicas site-specific em c. elegans. Este protocolo inclui a segmentação sgRNA design de modelo HDR único encalhado do oligonucleotide (ssODN), sgRNA-Cas9 complexantes de RNP e entrega e uma estratégia de genotipagem para a identificação inequívoca dos animais devidamente editados. Usando essa estratégia, não só as alterações desejadas e site-specific podem ser recuperadas, mas outras mutações indel inespecíficos também podem ser recuperadas. Assim, nossa estratégia permite a geração de uma série alélica usando uma estratégia simples, onde ambos mono-alélica, bi-alélica e indel mutantes podem ser gerados na geração1 F.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1144">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">CRISPRevolution sgRNA&#160; EZ Kit</td>
			<td style="width:216px;">Synthego Inc.</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:227px;">chimeric sgRNA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free TE</td>
			<td>Synthego Inc.</td>
			<td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Synthego Inc.</td>
			<td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">4 nmole Ultramer DNA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>ssODN HDR template</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1078728</td>
			<td>Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pCFJ90&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19327</td>
			<td>Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass Borosilicate Glass Micropipettes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td>OD: 1.0mm. ID: 0.78mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNaseZap Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and facile pipeline for generating genomic point mutants in c. elegans using crispr/cas9 ribonucleoproteins

As repetições de palíndromos regularmente intercaladas em cluster (CRISPR) - CRISPR - proteína 9 (Cas9) sistema de defesa imune adaptativo procarióticas foi co-optado como uma poderosa ferramenta para a engenharia de precisão genoma eucariótico associada. Aqui, apresentamos um método rápido e simples, usando a guia único quimérico RNAs (sgRNA) e CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) para a geração eficiente e precisa de genômicas mutações pontuais em c. elegans. Descrevemos um pipeline para seleção de alvo sgRNA, reparação de homologia-dirigido (HDR) modelo de design, complexantes CRISPR-Cas9-RNP e entrega e uma estratégia de genotipagem que permita a identificação robusta e rápida dos animais corretamente editados. Nossa abordagem não só permite a geração fácil e a identificação do ponto desejado genômica animais mutantes, mas também facilita a detecção de outros alelos do complexo indel em aproximadamente 4-5 dias com eficiência elevada e uma carga de trabalho reduzida de triagem.

Mutações no humano superóxido dismutase 1 (SOD1) representam ~ 10-20% do familiar esclerose amiotrófica lateral, uma doença neurodegenerativa devastadora que invariavelmente leva à paralisia e morte17. SOD-1 humana é uma proteína evolutivamente conservada compartilhamento de 55% de identidade e 70% de similaridade com a proteína de SOD-1 de c. elegans (figura 1B). Para demonstrar a simplicidade, viabilidade e eficiência da abordagem baseada em CRISPR-Cas9 RNP, escolhemos o gene c. elegans sod-1 para introduzir a variante de G93A humana associada a doença no genoma worm (figura 1A).
Para o engenheiro a mutação G93A no genoma de c. elegans , um sgRNA foi escolhido cujo local de reconhecimento de PAM fica 3 bp montante do codão G93 (Figura 1). Nós projetamos um ssODN HDR reparação modelo contendo: alterações 1) nucleotídeo para converter o codão G93 A93 (GGA GCA), 2) uma mudança silenciosa para o NGG PAM sequenciar (CGG CAG) para evitar sgRNA Cas9-mediada por clivagem do modelo HDR, 3) uma mutação silenciosa (CT) que apresenta um único site de enzima de restrição HindIII para genotipagem e 4) 50 bp 5' e 3' homologia braços (Figura 1). Um conjunto de primeira demão do PCR (F1-R1) foi projetado para produzir um único produto PCR de bp 592 em controles de N2 (figura 1A). Uma mistura de injeção contendo o sgRNA, Cas9, ssODN e um plasmídeo marcador fluorescente (pCFJ90) foram misturados, incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente e carregados em uma pipeta de microinjeção.
Figura 1 mostra o fluxo de trabalho após a mistura de injeção é carregada em uma micropipeta de injeção. No dia 0, animais de0 P 10-15 foram injetados em um ou ambos os braços de gônada, usando a técnica de microinjeção padrão18,19. Animais injetados recuperaram para 1-2 h e então foram banhados individualmente em placas NGM OP50-semeado. Após 2-3 dias, injecções de0 P sucesso foram identificadas por aqueles que têm mCherry(+) F1 progênie. As placas de0 top três P (ou seja, aqueles que têm o maior número de mCherry(+) F1s) foram escolhidos para análise posterior. De cada uma destas três placas (P0-8, P0-10, P0-12), 8 mCherry(+) F1s foram apontados para placas NGM individuais OP50-semeado 35 milímetros para um total de 24 mCherry(+) F1s. Após 2-3 dias de postura (dia 4 - 5), o indivíduo F1s foram transferidos para tubos de PCR contendo tampão de Lise worm e congelado por 1 h a-80 ° C. Posteriormente, o F1s foram lysed para libertar o DNA genômico e submetido a PCR. Os produtos PCR foram depois purificados e digeridos com HindIII por 1h e em um gel de agarose 1,5% identificar potencial edição animais. Em animais corretamente editados, digestão HindIII corta o produto do PCR completo (592 bp) em duas faixas de 370 bp e 222 bp. Esta estratégia de genotipagem inequivocamente diferencia entre o selvagem-tipo (592 bp), heterozigoto (592, 370, 222 bp) e homozigotia (370, 222 bp) animais. Figura 2A ilustra os resultados de genotipagem para os 24 animais de mCherry(+).
Para demonstrar que o marcador fluorescente mCherry enriquece para modificação do genoma, também escolhemos 8 animais de mCherry(-) de cada uma das placas de0 a 3 P. Dos 24 mCherry(+) F1s selecionados (barra vermelha), 10 contidos alélico-mono ou bi-alélico modificação (42%), 10 foram tipo selvagem (42%), 3 eram potenciais puntuais (13%), e houve 1 falha PCR (Figura 2A). Em contrapartida, do 24 mCherry(-) F1s selecionados, apenas 1 animal foi modificado corretamente (4%); enquanto, 23 eram tipo selvagem (96%) (Figura 2A). Figura 2B mostra o cromatograma do longa-metragem gel produto extraído de PCR (F.1-8-6), demonstrando que as mudanças de nucleotídeos precisos projetado no modelo HDR ssODN fielmente foram incorporados ao genoma deste F homozigoto 1 animal. Notavelmente, animais de1 F 10-7, 10-8 e 12-3 exibiram inesperado os tamanhos do produto do PCR e restrição digerir faixas padrões, sugerindo que estes animais podem ser portadores mutações indel complexo (Figura 2A). Assim, nosso método não só é capaz de gerar modificações operadas tanto por genoma desejado com facilidade, eficiência e fidelidade, mas também permite a identificação e recuperação de alelos indel exclusivo que pode lançar uma visão importante e inesperada em função dos genes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57518/57518fig1.jpg"> Figura 1 . CRISPR-Cas9 engenharia do de c. eleganssod-1 locus. () Ilustração esquemática, retratando a estrutura intron-exon do locus de sod-1 em c. elegans. A barra vermelha indica a localização de G93 no exon 3. O conjunto de par de primer é notável pelas setas vermelhas (F1-R1). (B) sequência de alinhamento dos humanos e proteínas de SOD-1 de c. elegans (worm). O resíduo G93 alvo é destacado em vermelho. (C) Top, uma seção do DNA genômico que cercam o codão G93 é mostrada como uma referência, e o PAM (verde) e sites de destino (azul) sgRNA são destacadas. Inferior, a homologia de único encalhado do oligonucleotide (ssODN) dirigido modelo de reparação (HDR) é mostrado contendo: o codão editar alterar G93 para A93, uma mudança silenciosa para o motivo do PAM para evitar clivagem pelo complexo sgRNA-Cas9, um silencioso mudar para apresentar um site exclusivo para a enzima de restrição HindIII (caixa amarela), e flanquear 5' e 3' 50 homologia de bp de armas (barras pretas). Todas as alterações de nucleotídeo projetadas no ssODN são vermelho realçado. (D) ilustração esquemática do pipeline para gerar e identificando o ponto baseado em CRISPR-Cas9 RNP mutantes. No dia 0, injete animais de 10-15 P0 com mistura de injeção. No dia 2-3, identificar animais de0 P injetados com sucesso por aqueles que contêm fluorescente progênie de1 F e escolher três P0 placas com a descendência mais fluorescente. De cada uma das placas três P0 , único 8 fluorescente F1 a descendência. No dia 4-5, (uma) etapa 1, individual F1s são escolhidos e colocados em tubos de PCR contendo tampão de Lise; (b) etapa 2, após a congelação a-80 ° C, contendo F1 vermes da polimerase lysed para liberar o DNA genômico, que é usado como um modelo PCR. Os produtos PCR são então limpos e digeridos com a enzima de restrição exclusiva; (c) passo 3, enzima digerido produtos são resolvidos em um gel de agarose onde selvagem tipo (+ / +), heterozigotos (m / +), e animais homozigotos (m/m) podem ser identificados pela digest restrição padrões de borda. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57518/57518fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57518/57518fig2.jpg"> Figura 2 . Dados de genotipagem para sod-1 (G93A) mutantes. (A) Imagem de gel de F 1 animais que foram individualmente lysed, PCRed e digerido com HindIII. Para cada placa de0 P (P0-8, P0-10, P0-12), mCherry(+) 8 e 8 mCherry(-) F1 animais foram analisados. Tanto mono-alélica (números azuis) e bi-alélica (números vermelhos) editado animais foram recuperados. Tamanho mudou os produtos de PCR ou imprevisto HindIII digeridas bandas também foram recuperadas que são indicativos da indel mutantes (números em amarelos). Controles de N2 são mostrados como uma referência para a especificidade de dimensionamento e enzima de produto PCR. (B) Top, espaçamento de códon e traduções de aminoácidos são mostradas acima para o tipo selvagem (WT) e abaixo para G93A modificado vertentes. A edição desejada é realçada por uma caixa vermelha, e as mudanças em silêncio que criar um site de restrição HindIII em-frame são realçadas por uma caixa amarela. Todas as alterações de nucleotídeo projetado são mostradas em negrito. Fundo, cromatograma representativo de homozigoto F1 animal 8-6. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57518/57518fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Volume de</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>6.3 ΜL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl (4m)</td>
			<td>0.94 ΜL</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PH HEPES (0.5M) 7.4</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCFJ90 (25 ng/μL)</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
			<td>2,5 ng/μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssODN (500 ng/μL)</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
			<td>50 ng/μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA (50 μM)</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
			<td>5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cas9 (61 μM)</td>
			<td>1.03 ΜL</td>
			<td>5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume final</td>
			<td>12,5 ΜL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. CRISPR-Cas9 RNP injeção Mix. Todos os reagentes devem ser re-suspensos em ddH nuclease livre2O. RNase livre técnicas devem ser usadas ao manusear reagentes e ao fazer a mistura de injeção.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>[Final]</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCl pH 8,3</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>2,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,45%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tween-20</td>
			<td>0,45%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2. Worm do Lysis Buffer receita. Proteinase K deve ser acrescentado fresco antes de cada utilização.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>1 x</td>
			<td>24 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x Mastermix Q5</td>
			<td>12,5 ΜL</td>
			<td>300 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primeira demão F1 (10 μM)</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
			<td>30 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primeira demão R1 (10 μM)</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
			<td>30 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lise de Worm</td>
			<td>4 ΜL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>6 ΜL</td>
			<td>ΜL DE 144</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume final</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>504 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3. PCR Mastermix. O PCR mastermix deve ser misturado bem pipetando até que a solução é homogênea. 21 µ l de mastermix a PCR deve ser adicionado ao limpos tubos PCR, e então 4 µ l de verme lisado deve ser adicionado aos tubos corretamente etiquetados.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>1 x</td>
			<td>24 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Buffer de enzima</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>48 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reação de PCR limpo</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>7 ΜL</td>
			<td>ΜL DE 168</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzima de restrição (10 U/μL)</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>24 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume final</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>240 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4. Enzima de restrição Mastermix. Mastermix a enzima de restrição deve ser misturado bem pipetando até que a solução é homogênea. 10 µ l de mastermix a enzima de restrição deve ser adicionado a 10 µ l de produto PCR limpo

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A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

7.5K visualizações.  University of Michigan. Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genética

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...