이 작품은 보조금의 지원으로 수행 되었다 5R21HD080684-02, 아동 건강의 국가 학회 및 인간 발달에서. 저자 켄 조 그의 지속적인 열정과 지원에 대 한 감사를 기원 합니다. 저자 또한 싶습니다 원고, 숀 맥 나 마라와 국가 Xenopus 자원 (RRID:SCR_013731)에 마 Wlizla의 중요 한 독서에 대 한 그의 카메라, 리브가 Charney의 사용에 대 한 브루스 블 룸 베르크를 인정 하는 가치에 대 한 X. tropicalis 수 유 및 동물 관리 식이요법에 관한 대화.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용, Irvine가 주 대학의 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. PGC 식 위한 준비
<ol><li>앞에서 설명한23으로 해 부 도구를 사전에 준비 합니다. 참고: 눈 썹 머리 칼 수술을 수행 하는 동안 태아를 안정 시키기 위해 머리 루프의 도움으로 절 개를 만드는 데 사용 됩니다. 눈 썹 머리와 머리 루프 붕 규 산 유리 펫 파스퇴르는 화 염에 그려 왔다 처음으로 붙어 있으며 남았다 부분에 깨진 (참조 그림 1A, 화살촉) 큰 손 재주에 대 한 짧은, 좁은 팁 (그림 1B)를 만들 때 수술을 수행.</li>
	<li>SgRNAs 절차 이전 기술된24 을 사용 하 여 생성 합니다. 참고: 짧게, 짧은 DNA 서식 파일 sgRNAs에 대 한 코딩 만들어집니다를 오류-무료, thermostable DNA 중 합 효소 겹치는 deoxyoligonucleotides 5' 살 균 소 T7 발기인, 단련 되 고 "입력"를 포함 하 여. SgRNA 합성 반응 생체 외에서 (키트 사용)에 따라 하룻밤 몇 시간 동안 알을 품는. 반응은 DNAse 처리는 서식 파일을 제거 하는. sgRNAs 페 놀/클로 프롬 추출 및 암모늄 아세테이트/소 프로 파 놀 강수량, 키트 제조 업체의 지침24에 따르면의 표준 방법으로 정화 된다.</li>
	<li>Microinjections를 수행 하기 전에 곧 준비 Cas9 sgRNA 단지 첫 번째 변성 ~ 250 여 RNAse 무료 (diethylpyrocarbonate 대우) H2O 60-65 ° C에서 5 분의 3 µ L 전체 볼륨에서 sgRNA의 ng 뒤에 빠른 냉각 5 분 동안 얼음에. 몇 초 동안에 sgRNA 원심 1 µ g / µ L Cas9 단백질의 1 µ L을 추가 하 고 복잡 한 형성을 촉진 하는 37 ° C에서 10 분 동안 품 어. 참고:이 부 화에 따라 튜브 수 보관 얼음에 microinjection에 대 한 배아를 준비 하는 동안.</li>
	<li>X. tropicalis 배아 체 외에서 수정 표준 방법을 사용 하 여 앞에서 설명한25얻을. 01-25,26 젤리 10 분 후 수정에서 태아. 참고: 수정 시간 시간 후 정자 현 탁 액 계란에 추가 되 고 접시 1/9thX와 홍수입니다 간주 됩니다 마크의 Ringers 수정 (MMR)26. 1/9에 드 jellying X. tropicalis25, X. laevis, 달리 수행에 대 한 3% 시스테인 무료 자료 (하지 HCl 소금), 포함 된 x MMR pH 7.8-8.0, 조정 뒤에 1/9에 여러 세척 x MMR. Agarose (1%)에 배아를 전송-1/9를 포함 하는 코팅된 접시 실 온에서 x MMR.</li>
	<li>즉시 1 1 %agarose 코팅 접시에 주입 될 배아 전송 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 x MMR.</li>
	<li>
1 세포 단계에서 주입. Xenopus microinjection 방법에 대 한 자세한 설명에 대 한 참조26,27 를 참조 하십시오.
	<ol>
<li>4 동물 극에서 단일 사이트에 각 배아 주사 Cas9 sgRNA 복잡의 홀란트 (최종 금액 = 1 Cas9 및 sgRNA의 ~ 250 pg의 ng; 보십시오 토론)24. 사출 사이트 치유의 10-20 분 후 1/9를 포함 하는 agarose 코팅 접시 배아 전송 x MMR 및 25 ° c.에 품 어 또한 배아 이식 받는 사람 역할을 하 uninjected 형제의 접시를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
페 트리 접시 (60 m m) ~ 5 m m를 포함 하는 준비-0.3에서 1 %agarose 두꺼운 층 x MMR, X. tropicalis또는 1에서 이식 하 고 X. laevis에 대 한 x MMR.
	<ol>
<li>만들기 우울증 ~ 3-4 m m 3를 삽입 하 여 깊은-4 우물 형 (96-잘 PCR 플레이트 절단 하 여 만든) x 녹은 agarose 접시를 붓는 때에 ( 그림 1C 참조 및 D). 몰드는 agarose는 강화 된 때까지 링 스탠드에 부착 된 클램프를 사용 하 여 페 트리 접시의 바닥 위에 몇 밀리미터를 잡으십시오.</li>
		<li>또한, 우물 1/9에 1 %agarose 얇은 층으로 코팅 하 여 집 개별 배아 24-잘 접시에 게 x MMR. 참고: 이러한 우물에 추가 문화 매체는 MMR 보충 gentamycin 황산/mL의 50 µ g 1/9 x.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. PGCs의 이식
<ol><li>때 배아 그냥 무대에 도달 Nieuwkoop와 페이 버28 blastula 9 (그림 2A), ~4.5 h 후 수정 (hpf) X. tropicalis, 25 ° C 배양 기에서 그들을 제거 하 고 추가 대 한 실내 온도에 equilibrate 수 있도록 0.5 h입니다.</li>
	<li>5 이식 하려면 hpf (그림 2B)를 사용 하 여 파스퇴르 피 펫 (Cas9-sgRNA 주사) 한 PGC 기증자 배아 전송 0.3에서 (단계 1.7에서에서 만든) 불경기를 포함 하는 60 m m agarose 접시 x MMR (1 또는 x MMR X. laevis를 사용 하는 경우). 또한 한 uninjected 형제 태아,이 접시를 이식 받는 전송. 참고: 그것은 중요 이러한 배아의 각각의 정체성 혼동 하지는.</li>
	<li>수동으로 집게를 사용 하 여 각 배아에서 vitelline 봉투를 제거 하 고 그들의 식물성 극 보기에서 및 수술에 대 한 접근은 모두 배아를 회전. 참고: 배아의 수동 드 vitellination의 설명 이전 되었습니다 설명된26.</li>
	<li>눈 썹 머리 칼의 날카로운 팁을 사용 하 여, 4 개의 얕은 절 개는 blastopore를 표시 하는 미래의 병 셀 형성 됩니다 영역 내부 받는 사람 배아의 식물성 극에 사각형의 형태로 확인 합니다. 태아, 표면, 및 위쪽으로 머리 루프와 배아를 안정화 하는 동안 움직임을 슬라이스 하는 게 바로 아래에 눈 썹 머리 칼 끝을 삽입 하 여 절 개를 확인 합니다. 참고: 그림 2 4.5-7.0 hpf 셀 크기를 보여 병 세포 (점선된 흰색 원)을 형성할 것 이다 예측에 대 한 가이드를 제공 하 고에서 뉴캐슬과 간격 배아의 식물 경관을 보여준다. 목표 파선된 블랙 박스 표시 됩니다 incisions를 만드는 것입니다.</li>
	<li>사각형의 네 면 절 개에 의해 delineated는, 일단의 약 1/3 ~ 1/2 blastocoel 바닥에 거리의 깊이 도달 비슷한 절삭 동작을 사용 하 여 눈 썹 머리 칼으로 각 절을 심화.</li>
	<li>받는 사람 배아에서 식물 조직 explant 무료 (그림 3A 및 B) 수평 (식물 표면에 평행) 함으로써 깊은 식물 지역에서 cut(s). 참고: PGC 포함 된 식물성 explant의 크기는 약 0.4-0.45 m m 면 당 및 0.25-0.3 m m 깊이에서. 받는 사람 배아에서이 식물 explant 이상 필요 하 고 따라서 옆으로 폐기를 설정 해야.</li>
	<li>신속 하 게 작업,이 절차 (단계 2.4-2.6) 이식에 대 한 비슷한 크기 식물 조직 파편을 만드는 PGC 기증자 배아에 반복 합니다. 참고: 그것은 그것의 열려있는 상처를 치유 받는 사람 배아에 대 한 시간을 최소화 하기 위해 작은 지연으로이 두 번째 해 부를 실시 하는 것이 중요.</li>
	<li>일단 PGCs를 포함 하는 조직 기증자 태아에서 제거, 눈 썹 머리 나이프와 머리 루프를 사용 하 여이 explant 받는 사람 배아에서 만든 오프닝에 위치로 이동. 참고: 기증자 이식의 내부 표면 내부 받는 사람 배아의 직면 한다. 받는 사람 배아를 이식의 등 쪽 복 부와 왼쪽 오른쪽 축의 방향에 맞게 필요는 없습니다.</li>
	<li>눈 썹 머리 칼, 이식의 표면에 병렬 개최의의 긴 가장자리를 사용 하 여 부드럽게 눌러 받는 사람 배아의 식물 표면에 오프닝으로 이식.</li>
	<li>이식 배치 되었습니다 일단 부드럽게 슬라이드 "시체" 기증자 배아의 agarose 표면에 걸쳐 agarose 우울증으로 하는 hairloop 또는 눈 썹 머리 칼의 샤프트를 사용 합니다. 시체의 오픈 상처 대량 액체를 직면 하 고는 다는 것을 확인 하십시오. 그렇지 않다면, 눈 썹 머리 칼을 사용 하 여이 방향을 달성 하기 위해 배아를 회전.</li>
	<li>받는 사람 배아 이식 장소에는 인접 한 우울증으로 치유와 슬라이드 하 고 마찬가지로 이식할된 식물성 극 조직 대량 액체를 직면 하 고는 다는 것을 확인 한다.</li>
	<li>다른 이식/시체 쌍;을 만듭니다 기증자와 받는 사람 배아의 다른 쌍을 사용 하 여이 절차 (단계 2.1-2.11) 반복 이러한 빈 우울증을 전송 합니다. 참고: 중요 한 시체 및 배아 이식-베어링의 일치 쌍을 추적 하는 표기법은 이다. 기증자 시체 이식 베어링 동물 성적인 성숙을 도달할 때까지 쉽게 분석 될 수 없습니다 이식된 PGCs에 Cas9-sgRNA-유도 된 mutagenesis의 효율성에 대 한 프록시로 사용 됩니다 (아래의 단계 3.3, 참조 및 토론 ).</li>
	<li>계속 이식 배아 약 gastrula 조기에 10, 약 6.5는 도달할 때까지 X. tropicalis 에서 hpf ( 그림 2E참조).</li>
</ol>3. 후 배아 들 치유
참고: 이식 ~ 30 분 이내에 치료 하 고 정상 세포 세포의 용 해 (그림 3C) 배아에서 풍기에서 일부 yolky 파편을 관찰 하는.
<ol><li>
일단 치유, agarose 코팅 24-잘 접시의 개별 웰 스에 우울증에서 매우 부드럽게 전송 배아에 파스퇴르 피 펫을 사용 합니다. exudate 됩니다 (그림 3D) 전송 하는 동안 혼합 유체에 의해 제거.
	<ol>
<li>대량 해결책에 직면을 식물 극 배치 되도록 배아를 회전 합니다. 다시, 기증자 시체를 놓고 태아 쌍;의 유지에 도움을 받는 인접 한 우물에 이식 이 정보를 기록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>숙박 문화에 대 한 25 ° C 배양 기에 태아를 포함 하는 24-잘 접시를 전송 합니다. 참고: 다음 날, 배아는 도달 했다 tailbud 단계.</li>
	<li>Agarose 코팅 6 잘 플레이트 MMR 보충 gentamycin 황산/mL, 잘 당 1 태아의 50 µ g 1/9 x를 포함 시키려면 이식 받는 사람을 이동 합니다. 이러한 일치 하는 기증자 시체의 명확한 기록 유지 이식 받는 사람.</li>
	<li>시퀀싱 PCR amplicons5,,1724 또는 PCR amplicons ( 토론참조)에 의존 하는 다른 방법을 사용 하 여 의해 mutagenesis 효율성 평가, 0.2 mL PCR 스트립 튜브를 개별 시체를 이동 합니다. 매체의 대부분을 제거 하 고 100 µ L 세포의 용 해 버퍼24 K (PK)으로 위아래 pipetting P200 피 펫을 사용 하 여 반복 하는 성분을 포함 하에서 균질.</li>
	<li>배아 세포24 PK 소화를 허용 하도록 하룻밤 6 h 56 ° C에서 수행 합니다. 10 분 뒤에 4 ° c 빠른 냉각 90-95 ° C에가 열 하 여 PK를 비활성화 추가 정리 단계 없이 lysates를 사용 하 여 씨를 직접 생어 DNA 시퀀싱24에 대 한 짧은 amplicons PCR 반응. -20 ° c.에 lysates 저장 참고: 몇 일 이내는 tadpoles 먹이 단계 (약 단계 45-46)에 도달 한다 그리고 planktonic 분말 (세라 미크론)의 정지 먹 일 수 있습니다.</li>
	<li>청결을 유지 하 고 미생물 자라 난 최소화를 문화 매체의 매일 변화 ~ 1 주 후 물방울 흐름 순환 수 중 시스템에 tadpoles 작은 탱크를 이동 합니다. 시퀀싱 데이터를 사용 하 여 낮은 mutagenesis 효율 tadpoles에서 매우 효율적으로 mutagenized PGCs와 tadpoles를 분리. 변 태 완료 되 면 연구실에서 성인 수생 시스템에는 froglets를 이동 합니다. 참고: 국가 Xenopus 자원 (해양 생물학 연구소, 나무 구멍, MA)에 의해 개발 된 식이요법 올챙이 먹이29 그리고 성인 개구리 유지 보수30에 대 한 가이드를 제공 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 상관이 있다.

이 보고서에서는 PGCs. 이식의 PGCs를 포함 하는 식물 조직의 이식에 대 한 상세한 프로토콜을 수정 하는 생식을 게놈 편집 기술 (예: CRISPR/Cas9)와 함께에서 사용 하면서 동물의 거의 모든 그것의 체세포 조직 유전자 야생 유형으로 유지. 성공 하려면 leapfrogging 위해 수행 간이식을 수행 하기 전에 고려해 야 할 중요 한 요인의 수가 있다.
돌연변이 체 대립 유전자와는 생식의 완전 한 교체를 위해 하나 먼저 sgRNAs의 비보에 효율을 결정 한다는 것이 좋습니다. 경험에 따르면 대부분 sgRNAs CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) 또는 CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/)에 의해 설계 된 효율적인 250 pg/배아에서 사용 하는 경우는. 그러나, 어떤 경우 (예를 들어, 의해 기습 외17, gsc sgRNA 필수 ~ 1 ng/태아) 높은 농도 사용 해야 할 수 있습니다. 대상 사이트의 mutagenesis의 효율성을 평가 하는 것은 필수적 이다 고 조 수의 사용 허가는 양적 평가31. 강조 하는 메서드는 직접 생어에 여기 사용 하는 동안 (F0 배아에서 돌연변이 체 대립 유전자의 인구를 나타내는), PCR amplicons의 시퀀싱 수많은 다른 방법 사용 되었습니다 게놈 편집 문학에서이 목적을 위해. 일반적으로 사용 되는 다른 낮은-투-보통 비용 기술이 포함 제한 효소33 또는 Cas9/TALEN 분열 사이트34, T7 endonuclease 135 , 측량 의 손실을 사용 하 여 조각의 길이 다형성 분석 36 분석 실험, heteroduplex 이동성 분석 결과37, 고해상도 용 분석 결과38, 조각 분석 모 세관 전기 이동 법39,40및 정량 기반 방법41, 42.
두 번째 고려 대상 사이트 위치 대상 유전자의 선택 이다. F1 세대에서 돌연변이 고기의 효율적인 복구를 허용 하려면 완전 한 LOF 대립 유전자에 대 한 기회를 극대화 하기 위해 중요 하다. 고아 한 접근을 사용 하 여 돌연변이 라인을 만들 때 5' 끝의 가까이 지역, 지역 코딩 단백질의 시작 부분 근처에서 조 번역 종료를 유도 코딩 Cas9 분열을 대상으로 일반적인 전략 이다. F1 heterozygotes frameshift 돌연변이와 식별 될 것입니다 그리고이 동물 것 선택 추가 작업 때문에 그들은 null 대립을 수행 것으로 예상 된다. 앞서가는 전략 F0 intercrosses를 사용 하기 때문에 코딩 순서의 5' 끝을 대상으로의 접근의 고효율 없을 것 이다. F0 배아 모자이크 germlines, 그리고 주로 F1 돌연변이의 인구에 있는 intercrossing 결과 복합 heterozygotes17. 이후 대규모 분석 여부 확인, 평균, 더블-스트랜드 나누기에 의해 생산 하는 돌연변이의 예상된 ~1/3rd 에서 프레임43, 대부분 F1 배아가이 패션에서 생산 했을 적어도 1 개의 대립 유전자에-프레임 돌연변이 야생 유형 활동을 유지할 수 있습니다. 따라서, 다른 전략 프레임에 돌연변이 대립도 이러한 null 될 가능성이 되도록 필요 합니다. 일반 단백질 기능에 필수적인 단백질 접히는 도메인 내에서 이중 가닥 나누기를 대상으로 완전 한 LOF (null 대립 유전자)17,44의 더 높은 기회가 될 전망 이다. 단백질 도메인의 원자 수준 structure(s)에 주의 깊은 고려 사항 사용 가능한 경우 단일 아미노산에서 프레임 삭제를 포함 하는 경우에 도메인 구조 (방해 하 예상 될 수 있습니다. 있는 이차 구조의 영역을 식별에 지원할 수 있습니다. 예를 들어, gsc 공습 외17에 의해 출판에서 Δ3bp 돌연변이). CRISPR/Cas9 대상 사이트는이 영역에서 확인할 수 있습니다, 만약 하나는 성공적으로 null 대립을 만들기의 더 높은 기회가 있다. 단백질 2 차 구조 구성 요소 간에 솔벤트 노출 루프 내 작은 삭제는 보다 적게 바람직한 더 유연한 지역에서 돌연변이 기능 단백질 여전히 발생할 수 있습니다.
Leapfrogging에 대 한 세 번째 고려 사항은 받는 사람 배아에서 PGC 제거의 효율성입니다. 이 단계는 완전 한 생식 교체를 보장 하기 위해 효율적인 필요 합니다. 여기에 설명 된 방법에 의해 생산 모든 이식 받는 사람 배아 blastula 단계 배아에서 PGC 마커의 지역화에 그들의 PGCs. 전체 마운트 제자리에 내 쇼 다양성의 완전 한 제거를가지고 있는지 현재 명확 하지 않다. 대부분의 경우, 모두 또는 거의 모든 신호 발견 태아의 식물성 대부분 끝 고 따라서 여기에 설명 된 수술에 의해 제거 될 것 (습격 형 외.17 및 인용 거기에). 그러나, 일부 배아 blastocoel 바닥에 가까이 몇 셀에 PGC 마커 식을 표시합니다. 세균 플라스마 먼저 수정 후 식물성 극에서 병합 하 고 초기 분열 시 분열 랑을 따라 스윕된 다음. 일부 세균 플라스마 세포 식물 반구의 중간에 배포 될 수 있습니다 하 고 효과적으로 사용 하는 blastocoel에 확장 하는 이주 하지 않고 제거 되지. 그러나, 그것은 또한 중요 한 것이 깊은 세포 생식 세포 마커를 포함 하는 생식에 기여 하지 수도 microRNAs 체세포45,46에서 PGC mRNAs를 알려져 있습니다. PGC 표식에 대 한 긍정적인 얼룩이 깊은 세포 체세포 등 허가 받고 있을 수도 있습니다. 방법 받는 사람 배아에서 완전 한 PGC 제거 되도록 현재 개발 되고있다.
마지막으로, 그것은 또한 얼마나 많은 F0 동물 leapfrogging 의해 생성을 고려 하는 것이 중요입니다. 동물의 다양 한 수 성적 성숙에 살아날 것으로 20 개 이상의 배아가 식을 포함 하는 창조 하는 것이 좋습니다. 그것은 필요가 남녀의 충분 한 숫자 (1) 그를 위해 충분히 살아남은 동물 것입니다 얻을 수 및 이러한 분석 연구원에 의해 계획에 적합 하도록 충분히 높은 주파수에서 돌연변이 체 대립 유전자를 전송 (2)는 것입니다.
약간 연습으로, 여기서 설명 하는 프로토콜을 사용 하 여 수 륙 양용 embryologists PGC 이식 기법 몇 가지 연습을 마스터 수 있어야 합니다. Leapfrogging 가능, embryogenesis의 초기 단계에서 개인 간의 쉽게 transplantable는 PGCs를 포함 하는 다른 유기 체 뿐만 아니라 다른 양서류에 해야 합니다.

어떻게 유전자 표현 형 인코딩합니다 Mendel의 법률의 재발견 이후 생물학에서 주요 질문 되었습니다. 인코딩된 제품 약속 잠복 새로운 생물학 및 장황 질병 상태에 대 한 도구를 제공 하기의 기능과 유전자, 그들의 규칙 및 유전자 네트워크 내에서 상호 작용의 역할의 이해. 절반 이상이 세기1, 아프리카 발톱된 개구리, Xenopus, 기초 생물학 및 의학, 발달의 유전 통제를 포함 하 여 다양 한 주제에 대 한 연구에 대 한 선도 모델을 하고있다. 역사적으로, Xenopus 에 대부분의 연구는 allotetraploid 개구리, X. laevis, 사용 하지만 더 최근에, 그것의 diploidy 인 X. tropicalis 개발 되었습니다 양서류 유전자 모델. 완전 한 게놈 시퀀스 두 Xenopus 종2,3에서 조립 되어 있다. "개구리 커뮤니티"입니다 지금 전환점에 어디 기본 게놈 수정 기술 허용 유전자 기능 연구 거의 것입니다. 프로그래밍 가능 CRISPR/Cas9 endonucleases 유전자의 mutagenesis를 biallelic 돌연변이 가능한 대부분의 세포에서 동물4,,56,7의 고효율 만들었습니다. 8,9,,1011. Bhattacharya 외 하 여 강조 하는 이러한 연구 12 및 Shigeta 외. 13, 많은 유전자의 기능 mutagenesis F0 모자이크 동물에 의해 공부 될 수 있다 나타났습니다. 이 접근에는 많은 이점이; 그러나, Cas9-sgRNA-microinjected 배아 종종 기능 (LOF)의 불완전 한 손실로 인해 가변 고기를 표시합니다. 더 크게, 돌연변이 라인의 세대는 매우 일부 응용 프로그램에 대 한 유리한-특히 모성 mRNA 기여 있는 유전자를 공부를 할 때. 모성 mRNAs 및 단백질, 그리고 epigenetics에 그들의 영향 embryogenesis14,,1516, 많은 유전자의 초기 발달 기여를 렌더링으로 오랜된 기간 동안 유지 F0 분석에의 내 화 따라서, 다른 LOF 방법이 제시해 주셔야 합니다.
돌연변이 체 라인을 만들 경우, 경로 homozygous LOF 배아를 얻는 몇 가지 장애물 있다. 첫째, 효율적인 mutagenesis biallelic 돌연변이 생산 하는 필수 유전자 기능의 손실이 가능한 라인의 생산을 방해 하는 성적 성숙에 살아남기 위해 실패에서 하기 때문에 불리 한 될 수 있습니다. 일반적인 솔루션은 Cas9-sgRNA 전달 금액의 주의 적정. 여기, 목표는 또한 생식 mutagenesis 효율성을 극대화 하면서 치 사 율 감소 사이의 균형을 달성 하는. 두 번째 문제 표준 사육 체계에서 발생 하는 phenotypic 분석 F2 세대까지 지연 됩니다. 표준 방식을 사용 하 여, 성적 돌연변이 체 대립 유전자는 생식을 통해 F1 heterozygous "캐리어", 성적 성숙 성장 다음 생산 outcrossed는 전송 하는 F0 동물 성숙. 2 F1 heterozygotes는 다음 25%의 예상된 Mendelian 주파수에서 F2 돌연변이 배아를 생산 하기 위해 intercrossed. 따라서, 번 식의 2 세대 돌연변이 고기의 분석을 위해 필요 하다. 돌연변이 동물 homozygotes 또는 복합 heterozygotes (즉, 자손 포함 하는 두 개의 다른 돌연변이 체 대립 유전자 F1 intercross에서 사용 하는 부모의 동물의 genotypes에 달려 있는) 수 있습니다.
프로그래밍 가능한 nuclease 중재 mutagenesis 세균 세포에 기초가 넘기17라는 새 메서드를 제한 하 여 이러한 장애물을 극복할 수 있습니다. 두 가지 주요 구성 요소는 leapfrogging: Cas mRNA sgRNA, 또는 nuclease sgRNA 단지 (또는, 원리, TALENs 또는 아연 손가락 nucleases)의 (1) microinjection 단일 셀 단계에서 효율적으로 배아 유전자 mutagenize를, 다음 (2) PGCs의 생 PGCs 제거 되었습니다 wildtype 형제 배아로 이식. 두 단계는 돌연변이 세균 세포로 효율적이 고 완전 한 생식 보충 때 얻어질 수 있다. Blackler 1960 년대 Xenopus PGCs 늦은 neurula에서 배아 초기 tailbud 단계18,19사이 이식 될 수 있는 시연. Leapfrogging, Blackler의 접근 PGCs 태아20,21의 식물성 극에 지역화는 blastula 단계17, 간이식을 수행 하 여 수정 되었습니다. Gastrulation 전에 이식 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 이식 및 후속 표준 개발의 engraftment 이식 blastula 단계 (관찰 되지 않은)에서 수행 하는 경우 더 효율적으로 발견 되었다. 둘째, zygotic 녹음 방송 시작 직후 blastula 단계 간이식을 수행, 하나 치 발달 유전자 변이 gastrulation 또는 그 방해를 그렇지 않으면 잘못 된 늦은 neurulae 이어질에서 발생을 피할 수 있다. PGC 이식-베어링 ("사간") 배아는 성적 성숙, 성장 및 이러한 F0 동물 사이 intercrosses는, 많은 경우에, F1 자손의 100% (대부분 되 고 복합 LOF 형 표시 증명 heterozygotes), 대상된 돌연변이와 완전 한 생식 교체를 나타내는.
그것 leapfrogging Xenopus에 유전 접근을 가속화 될 것으로 예상 된다. 또한 임산부 효력 유전자 (게시 되지 않은 관찰) LOF 분석에 대 한 "호스트 전송" 방법22 에 대 한 대안을 제공 leapfrogging. 현재 발행물에서 PGC 이식에 초점 특히 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 됩니다 X. tropicalis 에서 ( X. laevis에 대 한 작은 수정). Xenopus작업 다른 실험실에 더 빠른이 기술 이전을 촉진 하기 위하여 여기 PGCs의 식은 설명 했다. 이 방법의 원리 (예: urodeles), 다른 양서류에 성공 해야 하 고 방법론에서 유기 체 관련 수정 효율적인 mutagenesis 달성 될 수 있는 다른 많은 동물을 응용 프로그램에 대 한 허용 해야 하 고 PGCs는 쉽게 transplantable.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20 or 11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyebrow hair knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td>KG581</td>
			<td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 kit</td>
			<td>Ambion/ThermoFisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, Tris buffered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality chloroform from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality ethanol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>D5758-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td>
			<td>PNA Bio, Inc.</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#39;s recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Marc&#39;s Modified Ringers solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 X15 mm Petri plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>C7352-100G</td>
			<td>Free base, not HCl salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03 115 828 001</td>
			<td>Typically ~20mg/ml from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sera Micron</td>
			<td>sera</td>
			<td></td>
			<td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

편집 하는 게놈 돌연변이 라인의 창조 많은 유기 체에서 유전자 분석을 가속. CRISPR/Cas9 메서드가 아프리카 발톱된 개구리, Xenopus, 생물 의학 연구에 대 한 오랜 모델 유기 체에서에서 사용 하기 위해 적응 되었습니다. CRISPR/Cas9-타겟 mutagenesis와 homozygous 돌연변이 라인을 만들기 위한 전통적인 번 식 계획 몇 가지 어렵고 힘 드는 단계 있다. 특히 노크 embryogenesis에 필수적인 유전자와 관련 된 장애를 극복 하기 위해 돌연변이 배아의 생성을 촉진 하기 위하여 leapfrogging 이라는 새로운 방법을 개발 되었다. 이 기술을 활용 하 여 "잘라내기 및 붙여넣기" Xenopus 배아의 견고성 embryological 방법. Leapfrogging PGC 연기나 wildtype 형제에 효율적으로 mutagenized 기증자 배아에서 원시 생식 세포 (PGCs)의 전송을 사용합니다. 이 메서드는 공상 동물 wildtype 체세포 돌연변이 생식을가지고 작성 하 여 필수적인 유전자의 효율적인 돌연변이 대 한 수 있습니다. 때 두 F0 동물 운반 "도약 이식" (즉, 돌연변이 세균 세포)는 intercrossed, 그들은 생산 homozygous, 또는 복합 heterozygous, null F1 배아, phenotypic 데이터를 얻기 위해 전체 생성 시간 절약. F0 phenotypic 분석 CRISPR/Cas9 mutagenesis 다음 내 화물은 임산부 효력 유전자 분석을 위한 새로운 접근 방법을 제공 합니다 또한 leapfrogging. 이 원고 leapfrogging PGC 이식 성공적으로 수행 하는 방법에 대 한 특별 한 강조와 함께 하는 방법을 자세히 설명 합니다.

이식, 다음 CRISPR/Cas9 mutagenesis의 효능의 질적 결정 축산 성장과 성적 성숙 동물 유지에 노력을 소비 하기 전에 수행 되어야 합니다. 때문에 들고 토끼 뜀 이식 동물 somatically wildtype는 생식은 직접 측정을 위한 접근 하기 어려운, 기증자 태아의 시체를 저장 중요 해 집니다. 시체에서 DNA 분석 이식된 생식17에서 발생 하는 mutagenesis의 범위에 대 한 프록시 역할을 합니다.
Mutagenesis의 성공을 평가 하는 한 가지 방법은 직접 시퀀스 PCR amplicons 대상 게놈 영역에 걸친 것입니다. 이것은 특히 비용과 비효율적인 경우 하고자 많은 동물에서 수많은 개별적으로 복제 된 DNA 파편을 연속 된다. 대신, 그들은 모자이크 배아 유전자에서 파생 된 대로 대상 사이트에서 다른 유형의 amplicons 시퀀싱 각 배아19mutagenesis 효율성을 평가 하기 위해 사용 됩니다. Chromatograms의 시각화 표시 상류는 야생 타입 시퀀스 (봉우리) 대상의 시퀀스와 봉우리 될 "발진" (즉, 각 뉴클레오티드 위치에 나타나는 여러 기초에 해당 하는 봉우리의 동시 발생)의 하류 Cas9 촉매 두 배 물가 틈의 사이트. 이러한 프로 파일의 예는 그림 S1 공습 외에 찾을 수 있습니다. 17. 시퀀스 분해 알고리즘, 조류 (https://tide-calculator.nki.nl/)31를 사용 하 여 정확한 정량 mutagenesis 스크램블된이 봉우리에 표시의 범위를 얻을 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여 개별 배아 상영 자신감 각 배아는 제대로 주입 하 고 mutagenesis에 대 한 대상으로 제공 합니다. 붙일 태그가 dextran 등 추적 성공적인 주입24 를 확인 하는 데 사용 수 고는 올챙이 이식된 조직 (되지 않은 데이터)를 들고 실제로 수립에 도움이 될 수 있습니다. 그것은 Cas9 sgRNA 함께 형광 dextran의 coinjection Cas9 mutagenesis 효율을 변경할 수 있습니다 정식 가능성 탐험 되지 않은 참고 해야 합니다. 저조한 또는 unmutagenized 기증자 로부터 식을 포함 하는 어떤 "leapfrogged" 배아 폐기 수 있습니다.
Leapfrogging F1 배아에서 효율적인 phenotypic 분석을 허용 하 여 F2 세대 분석 표준 유전 번 식 체계를 위한 필요를 circumvents. 표준 접근을 사용 하 여 필수 유전자 변이, Cas9-sgRNA 복용량의 주의 적정이 감소 mutagenesis 효율성이 설립자 배아의 생존 능력을 보장 하기 위해 필요 합니다. 살아남는 F0 를 가능한 F1 배아, 사업자 식별 하는 검사는 wildtypes와 outcrossed 다음는이 표준 체계에서 동물. 마지막으로, 이러한 F1 heterozygotes는 성적 성숙 고 성장 homozygous F2 개인 돌연변이 고기 표시를 intercrossed. 반면, 돌연변이 체 대립 유전자와 그들의 germlines의 완전 한 교체를 생산 동물 leapfrogging, 때문에 F1 세대에서 돌연변이 고기 생산 intercrossing이 F0 동물. 습격 형 외. 17 보고 F0 동물 대상으로 melanocytes와 망막의 색소에 대 한 필요한 tyrosinase (tyr) 로커 스의 대부분 100% 생식 전송 ( 와 outcrossing 측정 했다 tyr-/-알 비 노 동물)의 기증자 파생 된 돌연변이 유전자 ( 그림 4A-B 및 표 1참조). 따라서, 두 동물 leapfrogging 제작한 intercrossing homozygous 또는 복합 heterozygous 돌연변이 F1 배아 얻을 것 이다.
비슷한 결과 F0 사간 동물 homeobox (인코딩 DNA 바인딩 homeodomain) goosecoid (gsc) 유전자의 돌연변이 들고 intercrossing 하 여17 가져온 ( 그림 4A, C H참조). Gsc 식 morpholino 센스 oligonucleotides를 사용 하 여 X. laevis 에 knockdowns 제안 gsc 유전자는 앞쪽 머리32의 완전 한 개발에 필요한 Cas9 sgRNA 주입 tadpoles 또한 쇼 배아 치명적인 고기17. 그러나, leapfrogged F0 동물, 야생 타입, somatically 되는 실용적이 고 강력한, 그리고 F1 intercross X. laevis knockdowns17에 게시 그 동일한 LOF 고기와 배아를 생산. 이러한 데이터 제공 뿐만 아니라 원리의 증거로 그 leapfrogging morpholino 형의 확증을 유전 배아 치명적인 고기를 극복 하기 위해 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig1.jpg"> 그림 1: 자료 이식에 필요한. (A) 붕 규 산 유리 파스퇴르 펫 눈 썹 머리 및 머리를 만들기 위해 사용 되는 미세 초기 배아에 대 한 루프. 분 젠 버너를 사용 하 여 유리 밖으로 그리기는 머리의 삽입을 위한 좁은 끝에 대 한 수 있습니다. 빨간색 화살표는 유리를 깰 수 있는 대략적인 위치를 표시 합니다. (B) 예를 들어 눈 썹 머리 칼 (맨 위) 및 헤어 루프 (아래)의 펫으로 빠른 건조 접착제로 고정. PCR 96 잘 접시의 (C) 부분 1 %agarose 금형 주위를 공고히 함으로써 agarose 접시에 우울증을 만드는 데 사용 됩니다 (agarose 0.3 x 또는 1에서 만든 x MMR, X. tropicalis에에서는 간이식 수행 되 고 있는지 여부에 따라 또는 X. laevis각각). agarose의 두께 3-4 m m ~ 5 m m-깊은 우물. (D)는 agarose의 예 12 우울증과 이식에 대 한 패널 C와 같이 접시. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig2.jpg"> 그림 2: 초기 gastrula 단계를 해 부에 대 한 전략 늦은 blastula 동안 식물성 극의 형태. (A-F) Xenopus tropicalis 배아 blastula 단계 9의 시작 부분에서 뉴캐슬과 시간 간격 식물성 뷰에 표시 (4.5 hpf) 초기 gastrula 단계 ~10.25를 (7 hpf). 5 이전 hpf, blastomeres는 크고 더 쉽게 손상. 흰색, 파선된 원형 패널 (E 와 F)에 등 (위)에 시작을 형성 볼 수 있는 gastrulation 동안 병 세포 형성의 예상된 위치를 표시 합니다. Leapfrogging에 대 한 4 개의 절 개는 사각형 내에서 검은 점선으로 그려져, 최종 잘라 만든된 병렬 조직 (표시 된)의 표면에 식물 explant 무료. 눈금 막대 = 400 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig3.jpg"> 그림 3: 이식. (A) 식물성 PGC 포함 된 조직의 제거 후 ~5.5 hpf 태아의 예. 검은 점선된 상자와 흰 점선된 동그라미 그림 2에 표시 된 대로 동일한 상대적 차원 이다. (B)는 식물성 explant 패널, 뷰어, 직면 하는 내부 표면에서에서 태아에서 제거 약 0.4-0.45 m m 면 당 0.25-0.3 m m 깊이에서입니다. (C) 배아 이식된 식물 조직으로. 이미지는 이식 후 ~ 10 분을 인수 했다. (D)는 식물 이식 후 30 분 조직 (부드러운 소용돌이 눈 썹 머리 칼으로 위 태아 패널 C에서 파편을 멀리 공중 소탕 하는 소용돌이 만드는 데 사용 된)으로 치료 해야 볼 수 있다. 1/9 x MMR와 25 ° C에 외피를 전송, 후 대부분 배아 일반적으로 gastrulation를 완료합니다. 눈금 막대 = 400 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56035/56035fig4v2.jpg"> 그림 4: F0 동물에서 생식 전송 leapfrogging 제작한. (A) leapfrogging, 대 한 두 개의 유전자 CRISPR/Cas9, tyrosinase (맨 위) 및 goosecoid (아래)에 의해 표적으로 했다. Tyr 유전자는 N 맨끝 신호 펩 티 드 (SP, 빨간색 음영)에 대 한 코딩 시퀀싱 (파란색 음영) 내에서 타겟된4,5 는, gsc 유전자 코딩에 시퀀스 내에서 타겟된17 동안에 homeobox (빨간색 음영)의 시작, 두 개의 exons 사이 분할 되는. 번역 되지 않은 5'과 3' exonic 지역 음영 처리 됩니다. (B)에서 모두 160 F1 tadpoles ( 표 1참조)는 leapfrogged F0 (LF1) 남성과 흰둥이의 짝짓기 (tyr-/-) 여성 했다 나타내는 흰둥이 leapfrogged 남성에서 전체 생식 왔다 tyr 돌연변이 세균 세포로 대체. 삽입 된 정상 망막 및 melanocyte 색소와 야생-타입 올챙이 보여줍니다. (C H) F1 배아 두 F0 사이 intercross에서 파생 된 사간 Xenopus homeobox 유전자를 대상으로 gsc. 배아의 약 2/3rds phenotypically gsc를 위한 돌연변이, 표현 형으로 되 고 (E-H) 머리의 앞쪽 자르기의 다양 한 각도. 돌연변이의 절반 중 cyclopic 또는 밀접 하 게 간격 눈 (F), 나머지 절반은 눈이 (H) 했다. 유전형이 homozygotes 또는 복합 heterozygotes 보였다. 야생-타입 형 (C, D)를 보여주는 배아의 1/3rd homozygous 야생 타입 또는 heterozygotes 했다. 현장에서 교 잡 otx2 (개, midbrain, 및 눈의 표식), egr2 (마커 hindbrain rhombomeres 3와 5, 그리고 신경 크레스트의 흐름) 및 hoxb9 (척수의 마커) 표시 의 손실 gsc 함수 otx2 도메인의 앞쪽 부분에만 영향을 줍니다. 이러한 데이터는 공습 외 에서 재현 생물학의 회사 허가 17 . <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56035/56035fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>크로스</td>
			<td>남성</td>
			<td>여성</td>
			<td>알 비 노</td>
			<td>야생 타입</td>
			<td>총</td>
			<td>% 흰둥이</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>LF1</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>160</td>
			<td>0</td>
			<td>160</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>LF2</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>148</td>
			<td>0</td>
			<td>148</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF3</td>
			<td>409</td>
			<td>0</td>
			<td>409</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF4</td>
			<td>0</td>
			<td>519</td>
			<td>519</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF5</td>
			<td>223</td>
			<td>0</td>
			<td>223</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>LF6</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>493</td>
			<td>703</td>
			<td>1196</td>
			<td>41.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF7</td>
			<td>1</td>
			<td>94</td>
			<td>95</td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF8</td>
			<td>125</td>
			<td>0</td>
			<td>125</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF9</td>
			<td>0</td>
			<td>417</td>
			<td>417</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>tyr-/-</td>
			<td>LF10</td>
			<td>252</td>
			<td>0</td>
			<td>252</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 효율적인 생식 교체 tyrosinase에서 돌연변이 들고 토끼 뜀 이주 여. Tyrosinase를 대상으로, 남녀의 이식 베어링 동물 획득 했다. 이 동물 homozygous tyr-/-, 돌연변이 체 대립 유전자, 생식 전송과 獸 올챙이 단계에서 분석은 보여주었다 F1 배아의 %의 효율성을 테스트 하는 알바 이노와 교차 했다. "남자"와 "여자" 라고 표시 된 열에서 항목을 부모 tyr-/-또는 넘기 (LF)에서 파생 된 테스트 동물 나타냅니다. 알 비 노 형 "흰둥이 %." 아래 표시 됩니다 십자가 표시 내에서 배아의 % 참고 6 leapfrog 이식 10 동물의 돌연변이 체 대립 유전자와 교체 완료 (100%)을 보였다. 이 테이블은 블리치 외 에서 재현 17, 허가입니다.

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

생존을 위해 필수적인 유전자 돌연변이 라인을 만들기 위한 기술 장애물 포즈. Leapfrogging 게놈 야생-타입 동물 생식 변이 들고 만드는 원시 생식 세포 이식으로 편집을 결합 하 여 치 사 율 circumvents. Leapfrogging 또한 F1 세대에서 null homozygous 돌연변이의 효율적인 생성을 허용합니다. 여기, 이식 단계는 보여 줍니다.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K 조회수.  University of California, Irvine. 생존을 위해 필수적인 유전자 돌연변이 라인을 만들기 위한 기술 장애물 포즈. Leapfrogging 게놈 야생-타입 동물 생식 변이 들고 만드는 원시 생식 세포 이식으로 편집을 결합 하 여 치 사 율 circumvents. Leapfrogging 또한 F1 세대에서 null homozygous 돌연변이의 효율적인 생성을 허용합니다. 여기, 이식 단계는 보여 줍니다.

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...