Non ci sono nessun conflitti di interesse relazionati alla presente relazione.

Tutti cura degli animali e procedure sperimentali seguite le linee guida dal National Institutes of Health e istituzionali Animal Care e uso Committee (IACUC) presso l'Università del Michigan. Utilizzare soluzioni RNasi-free e dispensare consigli in tutto il protocollo. Pulire l'area di lavoro, le pipette, tubi e centrifuga con soluzione di decontaminazione di RNAsi seguendo le linee guida del produttore (Vedi Materiali tavolo).
1. sgRNA selezione destinazione
<ol><li>Utilizzando un browser web, aprire la pagina Web: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>~ 60 paia di basi (bp) di sequenza che fiancheggia la modifica desiderata di interesse di ingresso (cioè 30 bp 5' e 3' di modifica desiderata).</li>
		<li>Dal menu a discesa, selezionare il genoma di Caenorhabditis elegans .</li>
		<li>Selezionare il motivo adiacente Protospacer (HF1-20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) dal menu a discesa.</li>
		<li>Fare clic su Invia. Nella pagina dei risultati, scegliere la sequenza di destinazione n superiore più vicina per la modifica di interesse. Se esistono siti bersaglio adatto all'interno della sequenza di input bp 60 fiancheggianti, espandere la sequenza di query fino a 100 bp (cioè 50 bp entrambi i lati del desiderato modificare).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Da una fonte disponibile, ad esempio synthego, ottenere un 20-mer destinazione sgRNA con le seguenti specifiche: 3 nmol; senza modifiche.</li>
	<li>Al ricevimento, centrifugare sgRNA liofilizzato contenente tubo a > 12.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Aggiungere 60 µ l di TE privo di nucleasi alla provetta e Risospendere delicatamente pipettando su e giù per 15 - 20 volte superiori usando una pipetta P200. La concentrazione finale è di 50 µM.</li>
</ol>2. disegno del modello di riparazione omologia-regia
<ol><li>Progettare un modello HDR ssODN contenente: 1) la mutazione di interesse, 2) un sito unico endonucleasi di restrizione nel telaio, 3) una mutazione silenziosa di uno o entrambi del Gs all'interno della sequenza di NGG PAM e 4) 50 bp 5' e 3' omologia braccia che fiancheggiano la prima e l'ultima mutazione. (Figura 1) 9 , 10.<ol>
<li>Se non è possibile mutazione della sequenza NGG PAM, introdurre 5-6 mutazioni silenti all'interno della sequenza di riconoscimento di destinazione sgRNA per prevenire sgRNA-mediata scissione del modello HDR ssODN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Da una fonte disponibile, ad esempio idtdna, ottenere un "oligonucleotide Ultramer DNA" con i seguenti parametri: scala: 4 nmol; Formulazione: Nessuno; Purificazione: Standard desalificazione.</li>
	<li>Al ricevimento, centrifugare ssODN liofilizzato contenente tubo a > 12.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Risospendere delicatamente ssODN ad una concentrazione finale di 100 µM in ddH nucleasi-free2O pipettando su e giù per 15 - 20 volte superiori usando una pipetta P200.</li>
</ol>3. design genotipizzazione primer
<ol><li>Progettare un set che fiancheggiano la modificazione del genoma per generare un ~ 400-700 bp PCR amplicone11di primer.</li>
	<li>Ottimizzare le condizioni di ciclismo di PCR per produrre un singolo e specifico amplicone11.</li>
</ol>4. preparare la miscela di iniezione
<ol><li>Centrifugare i reagenti di tabella 1 alla massima velocità per 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Nell'ordine elencato, è necessario aggiungere tabella 1 reagenti ad un tubo PCR nucleasi-free.</li>
	<li>Mescolare accuratamente pipettando delicatamente su e giù 10 volte con una pipetta P20.</li>
	<li>Incubare il mix di iniezione per 10 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. iniezione protocollo
<ol><li>Carico iniezione micropipetta con circa la metà dell'iniezione mescolare12. Salvare restanti mix di iniezione nel caso in cui l'ago per iniezione zoccoli o si rompe.</li>
	<li>Rompere una micropipetta punta affinché p.s.i. ~ 20-30 produce una graduale che scorre soluzione12. Nota: Più grande diametro consigli negativamente incidere sulla salute degli animali e diminuiscono il rendimento di progenie di F1 .</li>
	<li>Iniettare 10-15 giovane adulto worm in entrambi i bracci gonadici possibilmente12. In caso contrario, l'iniezione in un braccio gonadico è sufficiente.</li>
	<li>Permettono animali iniettati (P0) recuperare per 1-2 h a temperatura ambiente su un piatto di media (NGM) crescita del nematode OP50-seminato 35 mm. Successivamente, singoli animali di0 P iniettati a piastre NGM individuali OP50-seminato 35 mm utilizzando una vite senza fine del legare di platino pick12.</li>
</ol>6. schermo P0 piastre e singolo mCherry(+) F1s
<ol><li>Post-iniezione di due giorni, identificare piastre0 P contenente progenie di1 F esprimendo mCherry nella faringe utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente (Figura 1, giorno 2 - 3). Scegliere piastre0 tre P che contengono la maggior parte degli animali1 mCherry(+) F.</li>
	<li>Da ciascuna delle tre selezionate piastre0 P, scegliere singola 8-12 mCherry(+) F1 animali per un totale di 24-36 mCherry(+) F1s utilizzando una vite senza fine (Figura 1, giorno 2 - 3). Nota: mCherry(-) animali possono anche essere individuati da queste piastre0 P, ma la probabilità di identificare correttamente modificato gli animali è molto più basso (Figura 2A).</li>
	<li>Consentire singoli F1s per note e deporre le uova per 1-2 giorni a temperatura ambiente.</li>
</ol>7. singolo verme PCR e genotipizzazione
<ol><li>Dopo 1-2 giorni di deposizione delle uova, è possibile trasferire il F1s nei tappi individuali di tubo del striscia PCR contenente 7 µ l di tampone di lisi Worm usando un plettro di vite senza fine (tabella 2, Figura 1, giorno 4-5).</li>
	<li>Provette per PCR centrifuga alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente per portare gli animali alla parte inferiore del tubo e congelamento tubi a-80 ° C per 1 h. Nota: Vermi possono essere memorizzati a-80 ° C a tempo indeterminato.</li>
	<li>Lyse vermi congelati in un termociclatore usando il seguente programma: 60 ° C per 60 min, 95 ° C per 15 min, 4 ° C tenere.</li>
	<li>Set-up PCR mastermix come mostrato nella tabella 3.</li>
	<li>µ L 21 di PCR mastermix nelle provette PCR puliti e quindi aggiungere 4 µ l di lisi verme dal passaggio 3. Mescolare bene usando una pipetta ed eseguire il programma PCR seguendo le indicazioni del produttore (Vedi Materiali tavolo).</li>
	<li>Purificare le reazioni di PCR usando un kit DNA pulito e concentrato, seguendo le istruzioni del produttore (Vedi Materiali tavolo). Eluire il DNA aggiungendo 10 µ l acqua nella colonna di selezione.</li>
	<li>Set-up degli enzimi di limitazione mastermix come illustrato nella tabella 4.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di mastermix l'enzima di restrizione ad ogni reazione di PCR puliti e incubare per 1-2 h a 37 ° C13.</li>
	<li>Separato digerito i prodotti di PCR su un gel di agarosio 1.5% a 120 V utilizzando 1. tampone Tris-acetato-EDTA (TAE) x14.</li>
</ol>8. identificazione e verifica di sequenza degli animali modificati
<ol><li>Esaminare campioni di enzima digerito per la presenza di bande che indicano il potenziale modificato animali14 (Figura 1, giorno 4-5). Nota: Caricare un controllo N2 per identificare potenziali mutazioni indel che possono essere osservate come turni in taglia e/o digestione degli enzimi di restrizione di imprevisti e complessi disegni a strisce.</li>
	<li>Dopo aver identificato potenziali animali modificati, utilizzare i rimanenti 3 µ l di lisi di vite senza fine e ripetere la reazione di PCR. Non pulire o degli enzimi di limitazione digerire la reazione di PCR dopo avere completato il programma. Caricare la reazione di PCR su un gel di agarosio all'1%, separato ed estrarre la band utilizzando un kit di estrazione gel15 (Vedi Materiali tavolo).</li>
	<li>Gel di Sanger sequenza16 estratto il DNA utilizzando il primer di F1 per identificare correttamente modificati animali (Figura 1A) Nota: Heterozygote letture conterrà sovrapposti picchi a causa della presenza di tipo selvatico e ingegnerizzato allele.</li>
	<li>Per ottenere animali omozigoti da verificato eterozigoti modificati animali, singoli 8-122 animali ed eseguire i passaggi 7-8.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms.">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li><li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Guided+Genome+Engineering+in+C.+elegans.">CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).</li><li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+technologies+for+genome+editing.">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148 (2016).</li><li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans.">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li><li>Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient,+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests."> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis+.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Gel+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sanger+sequencing.">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li><li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+(and+Other+&amp;#34;Omics&amp;#34;)+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care.">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &amp;#34;Omics&amp;#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li><li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis?.">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?.</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li><li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse,+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis.">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li></ol>

Ringraziamo i membri del laboratorio Beg per la lettura critica di questo manoscritto. Ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Ricerca in laboratorio Beg è sostenuta da sovvenzioni dal NIH (R01 NS094678) e Muscular Dystrophy Association (MDA382300) a A.A.B.

Il sistema di CRISPR-Cas9 è uno strumento potente ed efficace per proprio modificando il genoma degli organismi modello. Qui, dimostriamo che chimerico sgRNAs20 accoppiato con ssODN HDR modelli permettono la generazione altamente efficiente di mutazioni genomiche di punto di c.elegans. D'importanza, dimostriamo che consegna RNP produce alta efficienza di editing quando fluorescenza viene utilizzato come un indicatore di co-selezione, mettendo in evidenza la facilità e l'affidabilità della tecnica.
La maggior parte dei metodi di CRISPR-Cas9 per l'ingegneria del genoma di c. elegans si basa su specifici ambiti di provenienza genetici o co-CRISPR strategie1. Il metodo di co-CRISPR ha dimostrato di essere uno strumento incredibilmente utile che aumenta la probabilità di ottenere una modifica del genoma di successo. Tuttavia, i metodi di co-CRISPR richiedono l'introduzione di una modifica di fenotipo selezionabile in un locus marcatore che arricchisce per la modifica del genoma di interesse. Mentre potente, l'introduzione di selezionabile fenotipo-cuscinetto mutazioni può essere indesiderato se il ceppo per modificare o la mutazione di punto desiderata di interesse si esibisce fenotipi che potrebbero essere aggravati o soppressa dal fenotipo di marcatore. Inoltre, strategie di co-CRISPR necessitano di creazione di un'interruzione di ulteriori doppio filo in un locus marcatore che può contribuire per effetti fuori bersaglio. Qui, presentiamo un metodo che utilizza un marcatore fluorescente transitorio che non solo serve a identificare correttamente iniettato P0 animali, ma arricchisce anche per le modifiche del proprio genoma. I nostri dati dimostrano questo metodo significativamente arricchisce per animali correttamente modificati rispetto agli animali non fluorescenti e offre diversi vantaggi distinti: 1) uno sgRNA site-specific di targeting è richiesto, solo 2) una riduzione di 5 volte in Cas9 e sgRNA concentrazione, 3) selezione del ceppo e del fenotipo indipendenza e 4) un carico di lavoro nominale screening (~ 24 F1s). Robusto CRISPR-Cas9 editing genomico nella generazione F1 è stata osservata mediante questo metodo. In particolare, la strategia di rilevazione basata su enzima di PCR-limitazione descritta consente la rilevazione inequivocabile di mono - e bi-allelica animali modificati nella generazione1 F. Infine, la strategia di genotipizzazione facilita l'identificazione di potenziali mutazioni indel, che può essere osservato come banda PCR turni quando confrontati ai comandi di N2, che non sono soggetti a restrizione digest o resa complessa bande quando digerito.
L'avvento di ultima generazione sequenziamento genomico Tugendbund su larga scala ha accelerato l'identificazione di varianti genomiche che segregano con malattia21. Tuttavia, i test funzionali di patogenicità non sono stati dimostrati per la maggior parte delle varianti in sistemi modello di cellulare e organismica. In questo studio, siamo presi di mira il gene sod-1 in c. elegans di introdurre l'ampiamente studiato ALS-collegato SOD-1G93A mutazione. Ad oggi, questa mutazione è stata modellata e studiata in c. elegans e topi utilizzando principalmente sovraespressione transgenica. Sebbene la sovraespressione di varianti nei modelli animali può ricapitolare chiave cellulare, aspetti molecolari e comportamentali della malattia, è sempre più chiaro che la 'dose' è un fattore attenuante nel determinare fenotipi22. Ad esempio, alta copia numero SOD-1G93A topi portando ~ 24 copie del gene mutante umano SOD-1 mostrano il decorso della malattia notevolmente accelerato rispetto ai topi SOD-1G93Adl , che trasportano solo ~ 8-10 copie23,24. Qui, dimostriamo che nostro metodo basati su CRISPR-Cas9 RNP può essere utilizzata per generare rapidamente mutazioni associate a variante umane del gene di verme orthologous senza richiedere transgenica sovraespressione, nel tentativo di replicare più precisamente la genetica contesto della malattia. Il nostro metodo fornisce una piattaforma fattibile per produrre e testare varianti genomiche di importanza sconosciuta nel contesto di controllo regolatore endogeno e di espressione, che esclude i confini della sovraespressione. Infine, abbiamo anche utilizzato questo metodo per contrassegnare geni endogeni con proteine fluorescenti (cioè GFP), che forniranno uno strumento aggiuntivo per la visualizzazione come varianti riguardano fatturato, l'aggregazione e la localizzazione della proteina.

I recenti progressi tecnologici hanno radicalmente trasformato e accelerato la possibilità al proprio genoma di ingegnere. In particolare, il sistema CRISPR-Cas9, che si basa sull'endonucleasi di RNA-guida Cas9 per indurre una rottura del doppio filamento (DSB) vicino alla sequenza di destinazione di interesse, è stato ampiamente utilizzato per progettare accuratamente il genoma della maggior parte degli organismi di modello utilizzato in ricerca biomedica1,2,3,4. Significativamente, l'uso di CRISPR-Cas9 ha sbloccato l'editing genomico anche in specie difficili come elegans del c.5. Indipendentemente dalla specie, generando mutazioni puntiformi con il genoma di CRISPR-Cas9 basato sistema di editing si basa su tre componenti principali: 1) Cas9 endonucleasi, 2) una singola guida RNA (sgRNA) che indirizza l'endonucleasi Cas9 a una sequenza di destinazione e 3) un utente progettato modello di omologia-regia di riparazione (HDR) contenente la modifica desiderata in/he / di interesse2.
Ci sono diversi metodi che possono essere utilizzati per introdurre il targeting sgRNA e Cas9 nucleasi nelle cellule incluse plasmide e RNA virale basato consegna metodi6. Recentemente, consegna diretta di pre-complessati sgRNA-Cas9 ribonucleoproteine (RNP) è emerso come uno strumento potente ed efficace nel genoma basati su CRISPR-Cas97di editing. La consegna diretta di pre-complessati CRISPR-Cas9 RNP ha diversi vantaggi distinti, vale a dire: 1) RNP ignorare la necessità di trascrizione cellulare e traduzione, 2) RNP sono rapidamente eliminato, che può aumentare la specificità riducendo il tempo disponibile per fuori bersaglio fenditura e 3) RNP non contenere nessun elementi di DNA/RNA estranei che aggira l'introduzione delle sequenze non-nativi nel genoma ospite attraverso integrazione casuale. Insieme, questi attributi probabili forniscono una breve raffica di on target CRISPR editing riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio.
Descriviamo un protocollo semplice ed efficace per introdurre cambiamenti genomici site-specific in c. elegans. Questo protocollo include destinazione sgRNA e disegno del modello HDR singolo incagliato oligonucleotide (ssODN), sgRNA-Cas9 RNP complessante e consegna e una strategia di genotipizzazione per l'identificazione inequivocabile degli animali correttamente modificati. Utilizzando questa strategia, non solo possono essere recuperate le modifiche desiderate e site-specifiche, ma altre mutazioni indel non specifici possono anche essere recuperati. Così, la nostra strategia consente la generazione di una serie allelica usando una strategia unica, dove entrambi allelica mono, bi-allelica e indel mutanti possono essere generati nella generazione1 F.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1144">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">CRISPRevolution sgRNA&#160; EZ Kit</td>
			<td style="width:216px;">Synthego Inc.</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:227px;">chimeric sgRNA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free TE</td>
			<td>Synthego Inc.</td>
			<td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Synthego Inc.</td>
			<td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">4 nmole Ultramer DNA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>ssODN HDR template</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1078728</td>
			<td>Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pCFJ90&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19327</td>
			<td>Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass Borosilicate Glass Micropipettes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td>OD: 1.0mm. ID: 0.78mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNaseZap Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and facile pipeline for generating genomic point mutants in c. elegans using crispr/cas9 ribonucleoproteins

Si ripete regolarmente sparpagliata palindromica cluster (CRISPR) - CRISPR - associati proteina 9 (Cas9) sistema di difesa immunitario adattivo prokaryotic ha stato cooptato come un potente strumento per l'ingegneria precisa del genoma eucariotico. Qui, presentiamo un metodo rapido e semplice utilizzando RNA chimerico guida singola (sgRNA) e CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine (RNP) per la generazione efficiente e precisa di mutazioni genomiche di punto di c.elegans. Descriviamo una pipeline per selezione target sgRNA, disegno del modello di omologia-regia di riparazione (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complessante e consegna e una strategia di genotipizzazione che consente l'identificazione robusto e rapido degli animali correttamente modificati. Il nostro approccio non solo consente la facile generazione e l'identificazione del punto desiderato genomico animali mutanti, ma facilita anche la rilevazione di altri alleli complessi indel in circa 4-5 giorni con alta efficienza e un carico di lavoro ridotto lo screening.

Mutazioni in umano superossido dismutasi 1 (SOD1) rappresentano ~ 10-20% di sclerosi laterale amiotrofica familiare, una devastante malattia neurodegenerativa che conduce invariabilmente a paralisi e morte17. SOD-1 umana è una proteina evolutivamente conservata condivisione di somiglianza di identità e il 70% di 55% con la proteina SOD-1 c. elegans (Figura 1B). Per dimostrare la semplicità, la fattibilità e l'efficacia dell'approccio basato su CRISPR-Cas9 RNP, siamo presi di mira il gene di c. elegans sod-1 per introdurre la variante di G93A umana malattia-collegati del genoma della vite senza fine (Figura 1A).
Per progettare la mutazione G93A nel genoma di c. elegans , un sgRNA è stato scelto il cui sito di riconoscimento del PAM si siede 3 bp a Monte del codone G93 (Figura 1). Abbiamo progettato un ssODN HDR riparazione modello contenente: cambiamenti 1) del nucleotide per convertire il codone G93 A93 (GGA GCA), 2) un cambiamento silenzioso per il PAM NGG sequenza (CGG CAG) per evitare la scissione sgRNA-Cas9-mediata del modello HDR, 3) una mutazione silenziosa (CT) che introduce un sito unico di enzima di restrizione HindIII per genotipizzazione e 4) braccio di 50 bp 5' e 3' omologia (Figura 1). Un set di primer PCR (F1-R1) è stato progettato per produrre un singolo prodotto PCR bp 592 in N2 controlli (Figura 1A). Un mix di iniezione che contiene il sgRNA, Cas9, ssODN e un plasmide marcatore fluorescente (pCFJ90) sono stati mescolati insieme, incubate per 10 min a temperatura ambiente e caricati in una pipetta di microiniezione.
Figura 1 raffigura il flusso di lavoro dopo il mix di iniezione viene caricato in una micropipetta di iniezione. Il giorno 0, P 10-150 gli animali sono stati iniettati in una o entrambe le braccia di gonade utilizzando la tecnica di microiniezione standard18,19. Animali iniettati recupero per 1-2 h e quindi erano cromati individualmente sulle piastre di NGM OP50-seminato. Dopo 2-3 giorni, le iniezioni di0 P successo sono state identificate da coloro che hanno mCherry(+) F1 progenie. I piatti di cima tre P0 (cioè quelli che hanno il maggior numero di mCherry(+) F1s) sono stati scelti per la successiva analisi. Da ciascuno di questi tre piastre (P0-8, P0-10, P0-12), sono stati individuati 8 mCherry(+) F1s a piastre NGM 35mm OP50-seminato individuali per un totale di 24 mCherry(+) F1s. Dopo 2-3 giorni di deposizione delle uova (giorno 4 - 5), l'individuale F1s sono stati trasferiti nelle provette PCR contenente tampone di lisi del verme e congelato per 1 h a-80 ° C. Successivamente, il F1s sono state lisate per liberare il DNA genomico e sottoposti a PCR. I prodotti PCR erano quindi purificati e digeriti con HindIII per 1 h e correre su un gel di agarosio 1.5% per identificare il potenziale modificato gli animali. Negli animali correttamente modificati, HindIII digestione tagli il prodotto PCR Full-Length (592 bp) in due bande di 370 bp e 222 bp. Questa strategia di genotipizzazione inequivocabilmente differenzia fra selvaggio-tipo (592 bp), eterozigote (592, 370, 222 bp) e omozigote (370, 222 bp) animali. Figura 2A illustra i risultati di genotipizzazione per gli animali mCherry(+) 24.
Per dimostrare che il marcatore fluorescente mCherry arricchisce per la modificazione del genoma, abbiamo anche preso 8 mCherry(-) animali da ciascuna delle piastre0 tre P. Del 24 mCherry(+) F1s proiettato (barra rossa), 10 contenuti modifica allelica mono o bi-allelica (42%), 10 erano wild-type (42%), 3 erano potenziali indels (13%), e c'era 1 PCR guasto (Figura 2A). Al contrario, il 24 mCherry(-) F1s proiettato, solo 1 animale era correttamente modificate (4%); mentre, 23 erano wild-type (96%) (Figura 2A). Figura 2B Mostra il cromatogramma dal full-length gel prodotto PCR Estratto (F18-6), dimostrando che i cambiamenti del nucleotide preciso progettato nel modello HDR ssODN fedelmente sono state incorporate nel genoma di questo F omozigotica 1 animale. In particolare, gli animali di1 F 10-7, 10-8 e 12-3 hanno esibito inattesi formati del prodotto PCR e restrizione del digest disegni a strisce, suggerendo che questi animali possono trasportare indel complesse mutazioni (Figura 2A). Così, il nostro metodo non è solo in grado di generare desiderato genoma modification (s) con facilità, di efficienza e di fedeltà, ma permette anche l'identificazione e il recupero degli alleli di indel unici che possono gettare importante e inattesi, spaccato di funzione del gene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57518/57518fig1.jpg"> Figura 1 . CRISPR-Cas9 Ingegneria del di c. eleganssod-1 locus. (A) Illustrazione schematica raffigurante la struttura esone-introne del locus sod-1 c.elegans. La barra rossa indica la posizione del G93 in essone 3. Il set di coppia di primer è indicato dalle frecce rosse (F1-R1). (B) allineamento di umani e c. elegans (verme) SOD-1 proteine di sequenza. Il residuo G93 mirato è evidenziato in rosso. (C) Top, è riportata una sezione del DNA genomico che circonda il codone G93 come riferimento e PAM (verde) e siti di destinazione (blu) sgRNA sono evidenziati. Fondo, l'omologia di singolo incagliato oligonucleotide (ssODN) diretto modello di riparazione (HDR) è visualizzato contenente: modifica codone cambiando G93 a A93, un cambiamento silenzioso al motivo PAM per evitare la scissione dal complesso sgRNA-Cas9, un silenzioso modificare in introdurre un unico sito di enzima di restrizione HindIII (riquadro giallo), e che fiancheggiano il 5' e 3' 50 bp omologia delle armi (barre nere). Tutti i cambiamenti del nucleotide progettati nella ssODN sono evidenziate in rosso. (D) illustrazione schematica della pipeline per la generazione e identificazione punto basato su CRISPR-Cas9 RNP mutanti. Il giorno 0, iniettare animali0 10-15P con mix di iniezione. Il giorno 2-3, identificare correttamente iniettato P0 animali da quelli contenenti fluorescente progenie di F1 e selezionare tre P0 piastre con la progenie più fluorescente. Da ciascuna delle piastre0 tre P, single 8 progenie di1 F fluorescente. Il giorno 4-5, (a) fase 1, individuale F1s vengono prelevati e depositati nelle provette PCR contenente tampone di lisi; (b) fase 2, dopo il congelamento a-80 ° C, PCR provette contenenti F1 worm vengono lisate per liberare il DNA genomico, che viene utilizzato come un modello PCR. I prodotti PCR vengono poi puliti e digeriti con l'enzima di restrizione unico; (c) passaggio 3, enzima digerito prodotti vengono risolti su un gel di agarosio dove selvatici tipo (+ / +), eterozigoti (m / +), e gli animali omozigoti (m/m) possono essere identificati da raccolta di limitazione disegni a strisce. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57518/57518fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57518/57518fig2.jpg"> Figura 2 . Dati di genotipizzazione per sod-1 (G93A) mutanti. (A) Immagine di gel di F 1 animali che sono stati singolarmente lisate, PCRed e digerito con HindIII. Per ogni piatto di0 P (P0-8, P0-10, P0-12), sono stati analizzati mCherry(+) 8 e 8 mCherry(-) F1 animali. Sia mono-allelica (numeri blu) e bi-allelica (numeri rossi) modificato gli animali sono stati recuperati. Dimensione ha spostato i prodotti di PCR o unpredicted HindIII digeriti bande sono stati anche recuperati che sono indicativi di indel mutanti (numeri gialli). N2 controlli vengono visualizzati come un riferimento per specificità di dimensionamento ed enzima prodotto PCR. (B) Top, spaziatura di codone e traduzioni dell'amminoacido sono riportati sopra per wild type (WT) e di sotto per G93A modificato fili. La modifica desiderata viene evidenziata da un riquadro rosso, e i cambiamenti silenziosi che creare un sito di restrizione HindIII in-frame sono evidenziati da un riquadro giallo. Tutti i nucleotidi progettato le modifiche vengono visualizzate in grassetto. Fondo, rappresentanza cromatogramma da omozigoti F1 animale 8-6. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57518/57518fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>6,3 ΜL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl (4M)</td>
			<td>0.94 ΜL</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PH 7.4 di HEPES (0.5 m)</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCFJ90 (25 ng/μL)</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
			<td>2,5 ng/μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssODN (500 ng/μL)</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
			<td>50 ng/μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA (50 μM)</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
			<td>5 ΜM.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cas9 (61 μM)</td>
			<td>1.03 ΜL</td>
			<td>5 ΜM.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume finale</td>
			<td>12.5 ΜL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. CRISPR-Cas9 RNP iniezione Mix. Tutti i reagenti devono essere risospesi in ddH nucleasi-free2O. RNasi gratis tecniche devono essere utilizzate quando si maneggia reagenti e quando si effettua il mix di iniezione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>[Finale]</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCl pH 8.3</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>2,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,45%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tween-20</td>
			<td>0,45%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteinasi K</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2. Vite senza fine Lysis Buffer ricetta. Proteinasi K dovrebbe essere aggiunto fresco prima di ogni utilizzo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>1 x</td>
			<td>24 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x Q5 Mastermix</td>
			<td>12.5 ΜL</td>
			<td>300 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer F1 (10 μM)</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
			<td>30 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer R1 (10 μM)</td>
			<td>1.25 ΜL</td>
			<td>30 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lisi di vite senza fine</td>
			<td>4 ΜL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>6 ΜL</td>
			<td>144 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume finale</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>504 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3. Mastermix PCR. The PCR mastermix devono essere mescolati bene pipettando finché la soluzione non è omogenea. 21 µ l di mastermix la PCR deve essere aggiunto al pulito provette per PCR, e poi 4 µ l di singoli worm lisato dovrebbe aggiungersi ai tubi correttamente etichettati.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>1 x</td>
			<td>24 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X tampone enzimatico</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>48 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reazione di PCR puliti</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>7 ΜL</td>
			<td>168 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzima di restrizione (10 U/μL)</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>24 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume finale</td>
			<td>20 ΜL</td>
			<td>ΜL 240</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4. Mastermix degli enzimi di limitazione. Il mastermix enzima di restrizione deve essere mescolato bene pipettando finché la soluzione non è omogenea. 10 µ l di mastermix l'enzima di restrizione deve essere aggiunto al 10 µ l di prodotto PCR pulito

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A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

Qui, presentiamo un metodo per progettare il genoma di c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine e modelli di omologia riparazione dipendente.

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

7.5K Views.  University of Michigan. Qui, presentiamo un metodo per progettare il genoma di c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine e modelli di omologia riparazione dipendente.

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Ricerca

Genetica

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...