Bu raporla ilgili hiçbir çatışması vardır.

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler Ulusal Sağlık enstitüleri ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Michigan Üniversitesi'nde kılavuz izledi. Ve ipuçları protokol boyunca pipet RNase free çözümleri kullanın. Çalışma alanı, Pipetler, tüpler ve santrifüj ( Malzeme tabloyabakın) Üretici yönergeleri izleyerek RNase dekontaminasyon çözüm ile temiz.
1. sgRNA hedef seçimi
<ol><li>Bir web tarayıcısı kullanarak Web sayfasını açın: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>~ 60 baz çifti (bp) istenen düzenleme ilgi kanat sırası giriş (Yani 30 bp 5' ve 3' istenen düzenleme).</li>
		<li>Caenorhabditis elegans genom açılan menüden seçin.</li>
		<li>Protospacer bitişik Motif seçin (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) açılan menüsünden.</li>
		<li>Gönder'i tıklatın. Sonuç sayfası faiz düzen için en yakın üst sırada hedef sırası seçin. Kanat 60 bp Giriş dizisi içinde hiçbir uygun hedef site varsa, en fazla 100 sorgu sırası genişletin bp (Yani 50 bp istenen her iki tarafında düzenleme).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir kaynaktan, örneğin synthego, aşağıdaki özelliklere sahip bir 20-mer hedef sgRNA elde etmek: 3 nmol; modifikasyon yok.</li>
	<li>Aldıktan sonra liyofilize sgRNA tüp, içeren santrifüj kapasitesi > 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk için. Tüp TE nükleaz Ücretsiz 60 µL ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı kullanarak 15 - 20 kez P200 pipet pipetting tarafından yeniden askıya. Son 50 µM bölgedir.</li>
</ol>2. homoloji-yönetmen onarım şablon tasarımı
<ol><li>Bir ssODN HDR şablonu içeren tasarım: 1) faiz mutasyon, 2) bir benzersiz çerçeve kısıtlama endonükleaz sitesi, birini veya her ikisini NGG PAM dizisi içinde Gs sessiz 3) bir mutasyon ve ilk ve son mutasyon kanat 4) 50 bp 5' 3' homoloji silah. (Şekil 1 c) 9 , 10.<ol>
<li>Mutasyon NGG PAM sırası mümkün değilse, 5-6 sgRNA-aracılı bölünme ssODN HDR şablonunun önlemek için sgRNA hedef tanıma dizisi içinde sessiz mutasyonlar tanıtmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir kaynaktan, örneğin idtdna, bir "Ultramer DNA Oligonükleotid" aşağıdaki parametrelerle elde etmek: Ölçek: 4 nmol; Formülasyon: None; Arıtma: Standart Desalting.</li>
	<li>Aldıktan sonra liyofilize ssODN tüp, içeren santrifüj kapasitesi > 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk için. Yavaşça ssODN 100 µM son bir konsantrasyon için GKD nükleaz ücretsiz2içinde O 15 - 20 kere P200 pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya alma.</li>
</ol>3. tasarım Genotipleme astar
<ol><li>~ 400-700 bp PCR amplicon11oluşturmak için genom değişiklik kanat ayarla bir astar tasarım.</li>
	<li>PCR bisiklet koşullarını tek ve belirli amplicon11üretmek için en iyi duruma getirme.</li>
</ol>4. enjeksiyon karışım hazırlamak
<ol><li>Tablo 1 reaktifler 4 ° C'de 2 min için maksimum hızda santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Listelenen sırayla Tablo 1 reaktifler bir nükleaz ücretsiz PCR tüp ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça aşağı yukarı 10 kez P20 pipet ile pipetting tarafından iyice karıştırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 dakika için enjeksiyon karışımı kuluçkaya.</li>
</ol>5. enjeksiyon Protokolü
<ol><li>Yük enjeksiyon micropipette yaklaşık yarısı enjeksiyon ile12karıştırın. Enjeksiyon iğne takunya ya da tatili halinde enjeksiyon mix kalan kaydedin.</li>
	<li>Yavaş yavaş akan çözüm12~ 20-30 psi üretir micropipette ipucu break. Not: Büyük çap ipuçları olumsuz hayvan sağlığını etkileyen ve F1 döl verim azaltın.</li>
	<li>10-15 genç enjekte yetişkin solucanlar her iki eşey kollarında mümkünse12. Eğer değilse, bir eşey kol içine enjeksiyon yeterlidir.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1-2 h için kurtarmak enjekte hayvanlar (P0) 35 mm OP50 numaralı seribaşı nematodunun büyüme medya (NGM) plaka üzerinde izin. Daha sonra bireysel OP50 numaralı seribaşı 35 mm NGM tabak Platin tel solucan kullanarak tek enjekte P0 hayvanlara12seç.</li>
</ol>6. ekran P0 plakaları ve tek mCherry(+) F1s
<ol><li>İki gün sonrası enjeksiyon, F1 döl mCherry floresan stereomicroscope kullanarak yutak olarak ifade içeren P0 plakaları tanımlamak (şekil 1 d, gün 2 - 3). En mCherry(+) F1 hayvanlar içeren üç P0 plakaları seçin.</li>
	<li>Her üç seçili P0 plakalar, 8-12 mCherry(+) F1 hayvanlar 24-36 mCherry(+) F1s bir solucan kullanarak toplam tek seçin (şekil 1 d, gün 2 - 3). Not: mCherry(-) hayvan-da var saydı P0 tabakları, ancak doğru bir şekilde belirlenmesi olasılığını hayvanlar çok düzenlenmiş (şekil 2A) daha düşük.</li>
	<li>Bireysel F1ler Self-fertilize ve oda sıcaklığında 1-2 gün boyunca yumurtlamak izin verir.</li>
</ol>7. tek solucan PCR ve Genotipleme
<ol><li>1-2 gün sonra yumurta atma, F1s 7 µL solucan lizis bir solucan pick (Tablo 2, şekil 1 d, gün 4-5) kullanarak arabellek içeren bireysel PCR şerit tüp kapakları aktarın.</li>
	<li>Santrifüj PCR tüpleri tüp altına hayvan getirmek ve tüpler için 1 h-80 ° C'de dondurmak için oda sıcaklığında 1 dk. için maksimum hızda. Not: Worms-80 ° C'de süresiz olarak saklanır.</li>
	<li>Aşağıdaki programı kullanarak bir thermocycler de donmuş solucan parçalayıcı: 4 ° C 60 ° C 60 dk, 15 dk, 95 ° C için tutun.</li>
	<li>Tablo 3' te gösterilen kurulum PCR mastermix.</li>
	<li>21 µL PCR mastermix temiz PCR tüpler içine ekleyin ve sonra adım 3 4 µL solucan lizis ekleyin. İyi bir pipet kullanarak mix ve ( Malzeme tabloyabakın) üreticileri yönergeleri izleyerek PCR programını çalıştırın.</li>
	<li>Üreticinin yönergelerini izleyerek bir DNA temiz ve konsantre kit kullanarak PCR reaksiyonları arındırmak ( Malzeme tabloyabakın). DNA spin sütun 10 µL su ekleyerek elute.</li>
	<li>Tablo 4' te gösterildiği gibi set-up restriksiyon enzimi mastermix.</li>
	<li>Restriksiyon enzimi mastermix 10 µL temizlenmiş her PCR reaksiyon ekleyin ve 1-2 h 37 ° C13için kuluçkaya.</li>
	<li>Ayrı 120 V 1 x Tris-asetat-EDTA (TAE) arabellek14kullanarak çalıştırmak % 1.5 özel jel PCR ürünleri sindirilir.</li>
</ol>8. kimlik ve sıra doğrulama düzenlenen hayvan
<ol><li>Potansiyel hayvanlar14 (şekil 1 d, 4-5 gün) düzenlenmiş belirtmek bantları varlığı için sindirilmiş enzim örnekleri inceleyin. Not: Grup boyutu ve/veya desenleri bantlama beklenmedik ve karmaşık restriksiyon enzimi sindirim nöbetleşe olarak gözlenen potansiyel Indel mutasyonlar tanımlamak için bir N2 denetimini yükleyin.</li>
	<li>Potansiyel düzenlenen hayvan belirlenmesi sonra solucan lizis kalan 3 µL kullanın ve PCR reaksiyon tekrarlayın. Temiz mi veya restriksiyon enzimi sindirmek PCR reaksiyon program tamamlandıktan sonra. PCR reaksiyon % 1'özel jel, ayrı olarak yüklemek ve bir jel ekstraksiyon kiti15 kullanarak Grup ayıklamak ( Malzeme tabloyabakın).</li>
	<li>Sanger sıra16 jel doğru düzenlenmiş hayvanlar (şekil 1A) tanımlamak için F1 astar kullanarak DNA elde Not: okuma içerir Heterozygote doruklarına vahşi türü varlığı nedeniyle overlaid ve alleli tasarlanmış.</li>
	<li>Homozigoz hayvanlar doğrulanmış heterozigoz düzenlenen hayvanlardan, tek 8-12 F2 hayvanlar almak ve 7-8 adımları gerçekleştirmek için.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms.">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li><li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Guided+Genome+Engineering+in+C.+elegans.">CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).</li><li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+technologies+for+genome+editing.">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148 (2016).</li><li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans.">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li><li>Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient,+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests."> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis+.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Gel+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sanger+sequencing.">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li><li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+(and+Other+&amp;#34;Omics&amp;#34;)+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care.">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &amp;#34;Omics&amp;#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li><li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis?.">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?.</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li><li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse,+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis.">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li></ol>

Biz üyeleri Beg laboratuvar bu el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis genetik Merkezi tarafından temin edilmiştir. Beg laboratuvar araştırma hibe tarafından NIH (R01 NS094678) ve Musküler Distrofi Derneği (MDA382300) A.A.B. için desteklenir

CRISPR-Cas9 sistemi tam olarak canlılar genom değiştirmek için güçlü ve etkili bir araçtır. Burada, biz o chimeric sgRNAs20 ssODN HDR şablonları etkinleştir ile yüksek verimli üretimi C. elegansgenomik noktası mutasyonların birleştiğinde göstermek. Önemlisi, biz floresan bir eş seçimi marker olarak kullanıldığında RNP teslim yüksek Düzenleme verimliliği üreten göstermek kolaylık ve güvenilirlik-in teknik vurgulayarak.
C. elegans genom mühendisliği için CRISPR-Cas9 yöntemleri çoğunluğu belirli genetik arka planlar veya co-CRISPR stratejileri1itimat. Co-CRISPR yöntem başarılı genom düzen elde etme olasılığını artırır son derece yararlı bir araç olduğu ispatlanmıştır. Ancak, faiz genom düzenleme için zenginleştiren bir işaretleyici locus fenotip seçilebilir bir Düzenle tanıtımı co-CRISPR yöntemler gerektirir. Güçlü, seçilebilir fenotip taşıyan mutasyonlar tanıtımı düzenlemek için zorlanma veya istenen nokta mutasyon kendisi ilgi şiddetlenir bırakılabilecek veya marker fenotip tarafından bastırılmış fenotipleri sergileyen Eğer istenmeyen olabilir. Ayrıca, co-CRISPR stratejileri hedef kapalı efektleri için katkıda bulunabilir bir işaretleyici locus bir ek Çift Kişilik strand sonu oluşturma gerektirebilir. Burada, uygun genom düzenlemeleri için sadece başarıyla enjekte P0 hayvanlar tanımlanmasını sağlar, ama aynı zamanda zenginleştiren geçici bir floresan işaretçi kullanan bir yöntem mevcut. Bu yöntem önemli ölçüde floresan hayvanlar ile karşılaştırıldığında başarıyla düzenlenmiş hayvanlar için zenginleştirir ve birkaç farklı avantajlar sağlar bizim veri göstermek: 1) sadece bir siteye özgü sgRNA hedefleme gereklidir, 2) bir Cas9 5-fold azalma ve sgRNA konsantrasyonu, 3) zorlanma ve fenotip seçimi bağımsızlık ve 4) nominal tarama iş yükünü (~ 24 F1s). Sağlam CRISPR-Cas9 genom F1 üretimi düzenleme bu yöntemi kullanarak gözlendi. Özellikle, açıklanan PCR-kısıtlama enzim tabanlı algılama strateji mono ve BI allelic düzenlenen hayvan kesin tespiti F1 nesil sağlar. Son olarak, Genotipleme strateji PCR grubu ne zaman vardiya olarak görülebilir potansiyel Indel mutasyonlar tanımlaması kolaylaştırır olmayan olan N2 kontrollere, göre kısıtlama Özet veya verim karmaşık duyarlı ne zaman bantları sindirilir.
Advent yeni nesil hastalığı21ile ayırmak genomik türevleri tanımlaması büyük ölçekli genomik çabaları ile birleştiğinde sıralama hız kazandı. Ancak, patojen işlevsel testleri türevleri çoğunluğu için hücresel ve organizma modeli sistemlerinde gösterilmiştir değil. Bu çalışmada, yaygın olarak okudu tanıtmak C. elegans çimen-1 geni hedef ALS ilişkili SOD-1G93A mutasyon. Bugüne kadar bu mutasyon edilmiş modellenmiş ve C. elegans ve öncelikle transgenik overexpression kullanarak fare okudu. Overexpression hayvan modellerinde versiyonlarının anahtar hücresel özetlemek, hastalık, moleküler ve davranışsal yönleri 'doz' fenotipleri22belirlemede cezayı bir faktör olduğunu giderek açık olsa da. Örneğin, mutasyona uğramış insan SOD-1 gen kopyalarını ~ 24 taşıyan yüksek kopya SOD-1 numaralıG93A fareler sadece ~ 8-10 kopya23,24taşımak SOD-1G93Adl fareler için karşılaştırıldığında büyük ölçüde hızlandırılmış hastalığı sahası sergi. Burada, biz bizim CRISPR Cas9 RNP-tabanlı yöntemi transgenik overexpression, daha doğrusu genetik çoğaltmak için bir çaba gerek kalmadan insan değişken ilişkili mutasyonlar orthologous solucan gen hızla oluşturmak için kullanılması gereken göstermek hastalığı bağlamında. Bizim yöntem üretmek ve genomik değişik-in bilinmeyen önemi endojen düzenleyici denetimi ve overexpression sınırları engellemektedir ifade bağlamında test etmek için uygun bir platform sağlar. Son olarak, biz de türevleri protein yerelleştirme, toplama ve ciro etkilemesi görüntülenmesi için ek bir araç sağlar (Yani GFP), floresan proteinler ile endojen gen etiketlemek için bu yöntemi kullandık.

Son teknolojik gelişmeler kökten değiştirdi ve tam olarak mühendis genleri yeteneği hızlandırılmış. Özellikle, RNA güdümlü endonükleaz Çift Kişilik strand mola (DSB) faiz hedef sıra ikna etmek için Cas9 dayanan, CRISPR-Cas9 sistemi kapsamlı olarak doğru bir şekilde kullanılan model organizmalar çoğunluğu genom mühendisi kullanılmaya başlanmıştır Biyomedikal Araştırma1,2,3,4. Önemli ölçüde, CRISPR-Cas9 kullanımı bile zor türler C. elegans5gibi genom düzenleme kilidi. Türü ne olursa olsun, sistem düzenleme CRISPR-Cas9 dayalı genom ile nokta mutasyonlar üreten üç çekirdek bileşenleri üzerinde dayanır: 1) Cas9 endonükleaz, bir hedef sıra ve tasarlanmış 3) bir kullanıcı için Cas9 endonükleaz yönlendirir 2) bir tek Kılavuzu RNA (sgRNA) İstenen içeren homoloji yönetmen onarım (HDR) şablonunu faiz2/ edit(s).
Hedefleme sgRNA ve Cas9 tanıtmak için kullanabileceğiniz çeşitli yöntemler vardır nükleaz plazmid, RNA ve viral alan teslim yöntemleri6dahil olmak üzere hücre içine. Son zamanlarda, pre-complexed sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) doğrudan teslim CRISPR Cas9 esaslı genom7düzenleme güçlü ve etkili bir araç ortaya çıkmıştır. Pre-complexed CRISPR-Cas9 RNPs doğrudan teslim Yani birkaç farklı avantajı vardır: 1) RNPs bypass hücresel transkripsiyon ihtiyacını ve çeviri, 2) RNPs hızla temizlenir, hangi-ebilmek artmak özgüllük için kullanılabilir zamanı azaltarak kapalı-hedef bölünme ve 3) RNPs non-yerli dizileri rasgele tümleştirme yoluyla ana bilgisayar genom içine giriş circumvents hiçbir yabancı DNA/RNA unsurları içerir. Birlikte, bu öznitelikler muhtemel hedef kapalı etkileri en aza indirerek CRISPR hedef olarak düzenleme kısa ömürlü bir patlama sağlar.
C. eleganssiteye özgü genomik değişiklikleri tanıtmak için basit ve etkili bir iletişim kuralı tanımlar. Bu iletişim kuralı sgRNA ve tek telli Oligonükleotid (ssODN) HDR şablon tasarımı, sgRNA-Cas9 RNP kompleks ve teslim ve düzgün düzenlenmiş hayvanlar kesin tanımlaması için bir Genotipleme strateji hedefleme içerir. Bu stratejiyi kullanarak, sadece istediğiniz siteye özgü değişiklikleri elde edilebilir, ama diğer non-spesifik Indel mutasyonlar da kurtarılabilir. Böylece, bizim strateji allelic dizisi tek bir strateji kullanarak mono allelic, BI allelic nerede nesil verir ve Indel mutantlar F1 üretimi oluşturulabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1144">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">CRISPRevolution sgRNA&#160; EZ Kit</td>
			<td style="width:216px;">Synthego Inc.</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:227px;">chimeric sgRNA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free TE</td>
			<td>Synthego Inc.</td>
			<td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Synthego Inc.</td>
			<td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">4 nmole Ultramer DNA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>ssODN HDR template</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1078728</td>
			<td>Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pCFJ90&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19327</td>
			<td>Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass Borosilicate Glass Micropipettes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td>OD: 1.0mm. ID: 0.78mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNaseZap Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and facile pipeline for generating genomic point mutants in c. elegans using crispr/cas9 ribonucleoproteins

Kümelenmiş düzenli olarak serpiştirilmiş palindromik tekrarlar (CRISPR) - CRISPR - protein prokaryotik edinilmiş bağışıklık savunma sistemi kesin ökaryotik genom mühendisliği için güçlü bir araç olarak ortak tercih 9 (Cas9) ilişkili. Burada, C. elegansgenomik noktası mutasyonların verimli ve hassas nesil chimeric tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNA) ve CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) kullanarak hızlı ve basit bir yöntem mevcut. Biz bir boru hattı sgRNA hedef seçimi, homoloji yönetmen onarım (HDR) şablonu tasarım, CRISPR-Cas9-RNP kompleks ve teslim ve doğru düzenlenmiş hayvanlar sağlam ve hızlı tanımlaması sağlar bir Genotipleme strateji tanımlamak. Yaklaşımımız sadece facile üretimi ve istenen genomik noktası tanımlaması mutant hayvanlar izin verir, ancak aynı zamanda diğer karmaşık Indel allelleri algılama yaklaşık 4-5 gün içinde yüksek verimliliği ve azaltılmış tarama iş yükü ile kolaylaştırır.

Mutasyonların insan süperoksit dismutaz 1 (SOD1) ailesel amyotrofik lateral skleroz, felç ve ölüm17' ye kaçınılmaz götüren bir yıkıcı nörodejeneratif hastalık ~ 10-%20 hesabı. İnsan SOD-%1 55 kimlik ve % 70 benzerlik C. elegans SOD-1 protein ile (şekil 1B) paylaşımı örümceklerle korunmuş bir proteindir. Basitlik, fizibilite ve CRISPR-Cas9 RNP dayalı yaklaşım verimliliğini göstermek için C. elegans çimen-1 gen hastalık ilişkili insan G93A varyantı solucan genom (şekil 1A) içinde tanıtmak için hedef.
C. elegans genom G93A mutasyon mühendisi, bir sgRNA olan PAM tanıma sitesi 3 oturur seçildi kan basıncı upstream in G93 kodon (şekil 1 c). Biz bir ssODN HDR onarım şablonu içeren tasarlanmıştır: G93 kodon A93 için dönüştürmek için 1) nükleotit değişiklikleri (GGA GCA), NGG PAM sessiz 2) bir değişiklik sıra (CGG CAG) sgRNA-Cas9-aracılı bölünme HDR şablonunun sessiz 3) bir mutasyon (CT) önlemek için bu benzersiz bir HindIII restriksiyon enzimi site Genotipleme ve 4 için tanıttı) 50 bp 5' 3' homoloji silah (şekil 1 c). PCR astar seti (F1-R1) bir tek 592 bp PCR ürünü N2 denetimlerindeki (şekil 1A) üretmek için tasarlanmıştır. SgRNA içeren bir enjeksiyon karışım, Cas9, ssODN ve floresan marker plazmid (pCFJ90) birlikte karışık, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ve mikroenjeksiyon pipet yüklü.
Enjeksiyon karışımı bir enjeksiyon micropipette yüklendikten sonra şekil 1 d iş akışı gösterilmektedir. Gün 0, 10-15 P0 hayvanlar standart mikroenjeksiyon tekniği18,19kullanarak bir veya her iki erbezi kollarında enjekte edildi. Enjekte hayvan 1-2 h için yeniden elde etmek ve daha sonra tek tek OP50 numaralı seribaşı NGM Tabaklarda kaplama. 2-3 gün sonra başarılı P0 enjeksiyonları bu mCherry(+) F1 döl olan tarafından tespit edilmiştir. En iyi üç P0 tabak (Yani bu mCherry(+) F1s en fazla olan) daha sonraki analiz için seçilmiştir. Bu üç tabak (P0-8, P0-10, P0-12) herbirinden 8 mCherry(+) F1s saydı OP50 numaralı seribaşı bireysel 35 mm NGM tabak 24 mCherry(+) F1s toplam için. (Gün 4 - 5) yumurta atma 2-3 gün sonra bireysel F1s solucan lizis arabellek içeren PCR tüpler içine transfer ve-80 ° C'de 1 h için dondurulmuş Daha sonra F1s, genomik DNA kurtarmak için lysed ve PCR için tabi. PCR ürünleri o zaman saf ve HindIII ile 1 h için sindirilmiş ve üzerinde % 1.5 özel jel hayvan potansiyeli tanımlamak için düzenlenmiş çalıştırın. Doğru düzenlenmiş hayvanlarda HindIII sindirim tam uzunlukta PCR ürünü keser (592 bp) 370 iki grup içine kan basıncı ve 222 bp. Bu Genotipleme strateji belirsizliğe yer bırakmadan vahşi-türü arasında ayırır (592 bp), heterozygote (592, 370, 222 bp) ve homozigot (370, 222 bp) hayvanlar. Şekil 2A 24 mCherry(+) hayvanlar için Genotipleme sonuçları göstermektedir.
Floresan mCherry işaretçisi genom değiştirilmek üzere zenginleştiren göstermek için de 8 mCherry(-) hayvanlardan her üç P0 plakaların aldı. Ekranlı 24 mCherry(+) F1s (kırmızı çubuk), 10 allelic mono veya bi-allelic değişiklik (% 42), 10 edildi vahşi türü (% 42), bulunan 3 potansiyel indels (% 13) idi ve 1 PCR hatası (şekil 2A). Vahşi türü (% 96) 23 yaşından, buna ek olarak, ekranlı 24 mCherry(-) F1s sadece 1 hayvan doğru şekilde değiştirilmiş (%4); iken (Şekil 2A). Şekil 2B Kromatografik üzerinden tam uzunlukta ayıklanan PCR ürünü (F18-6) jel, kesin nükleotit değişiklikler ssODN HDR şablonu tasarladığınızı gösteren bu homozigoz F genom sadakatle dahil gösterir 1 hayvan. Özellikle, F1 hayvanlar 10-7, 10-8 ve 12-3 beklenmeyen PCR ürün boyutları ve kısıtlama Özet bantlama desenleri, bu hayvanların karmaşık Indel mutasyonlar (şekil 2A) taşıyabilir düşündüren sergiledi. Böylece, bizim yöntem sadece kolaylık, verimlilik ve sadakat ile istenen genom tüm değişiklik(ler) üretme yeteneğine sahip değil, ama aynı zamanda kimlik ve gen işlevi önemli ve beklenmedik içgörü dökmek benzersiz Indel allelleri kurtarılması izin verir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57518/57518fig1.jpg"> Resim 1 . CRISPR-Cas9 mühendislik C. elegansçimen-1 locus. (A) C. elegans çimen-1 locus exon-intron yapısı gösteren şematik. Kırmızı çubuk G93 konumda exon 3 gösterir. Astar çifti set Kırmızı oklar (F1-R1) tarafından belirtilmektedir. (B) sıra insan ve C. elegans (solucan) SOD-1 proteinler. Hedeflenen G93 kalıntı kırmızıyla vurgulanır. (C) Top, genomik DNA G93 kodon çevreleyen bir bölümünü bir referans olarak gösterilir ve PAM (yeşil) ve sgRNA (mavi) hedef siteleri vurgulanır. Alt, tek telli Oligonükleotid (ssODN) homoloji yönetmen onarım (HDR) şablonu içeren gösterilir: bir sessiz A93, sgRNA-Cas9 kompleksi tarafından bölünme önlemek için PAM motifi sessiz bir değişiklik için G93 değiştirme kodon Düzenle değiştirmek için benzersiz bir HindIII restriksiyon enzimi sitesi (sarı kutu) tanıtmak ve 5' ve 3' 50 bp homoloji kanat (siyah çubuklar) silah. SsODN tasarlanmış tüm nükleotid vurgulanan kırmızı değişikliklerdir. (D) üretmek ve CRISPR-Cas9 RNP-esaslı nokta mutantlar tanımlayan boru hattı şematik gösterimi. Gün 0, 10-15 P0 hayvanlar enjeksiyon karışımı enjekte et. Gün 2-3, floresan F1 döl içerenler tarafından başarılı bir şekilde enjekte P0 hayvanlar belirlemek ve üç P0 pilakalar ve en floresan döl seçin. Her üç P0 plakaların 8 Floresan F1 döl tek. Gün 4-5, (a) adım 1, bireysel F1s aldı ve lizis arabellek içeren PCR tüpler içine yerleştirilir; (b) adım 2,-F1 solucan içeren PCR tüpleri-80 ° C'de dondurma sonra lysed-PCR şablon olarak kullanılır genomik DNA serbest bırakmak için. PCR ürünlerinin sonra temizlenir ve benzersiz restriksiyon enzimi ile sindirilmiş; (c) adım 3, sindirilmiş enzim nerede vahşi ürünler üzerinde bir özel jel çözüldü türü (+/ +), heterozigoz (m / +), ve homozigoz (m/m) hayvan desenleri bantlama kısıtlama digest tarafından belirlenebilir. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57518/57518fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57518/57518fig2.jpg"> Resim 2 . Genotipleme veri için çimen-1 (G93A) mutantlar. (A) F görüntüsünü jel tek tek edildi 1 hayvanlar lysed, PCRed ve HindIII ile sindirilir. Her P0 için levha (P0-8, P0-10, P0-12), 8 mCherry(+) ve 8 mCherry(-) F1 hayvanlar analiz edildi. Mono-allelic (mavi rakam) ve bi-allelic (kırmızı numaraları) düzenlenen hayvan ele geçirildi. Boyutu PCR ürünleri veya Indel mutantlar (sarı numaraları) işaret etmektedir sindirilir bantları da ele geçirilmiştir gizemli HindIII değiştirdi. N2 denetimleri PCR ürünü boyutlandırma ve enzim özgüllük için bir başvuru olarak gösterilir. (B) üst, kodon aralığı ve amino asit çevirileri vahşi türü (WT) için yukarıda gösterilen ve aşağıda ipliklerini G93A için değiştirilebilir. İstenen düzenleme kırmızı bir kutuyla vurgulanır ve bir çerçeve HindIII kısıtlama sitesi oluşturmak sessiz değişiklikler sarı bir kutuyla vurgulanır. Tüm tasarlanmış nükleotit değişiklikler kalın olarak gösterilir. Alt, temsilcisi Kromatografik homozigoz F1 hayvan 8-6 dan. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57518/57518fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>Birim</td>
			<td>Son konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>GKD2O</td>
			<td>6.3 μL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl (4M)</td>
			<td>0,94 μL</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (0.5M) pH 7.4</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCFJ90 (25 ng/μL)</td>
			<td>1,25 μL</td>
			<td>2.5 ng/μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssODN (500 ng/μL)</td>
			<td>1,25 μL</td>
			<td>50 ng/μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA (50 mikron)</td>
			<td>1,25 μL</td>
			<td>5 MİKRON</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cas9 (61 mikron)</td>
			<td>1.03 μL</td>
			<td>5 MİKRON</td>
		</tr>
<tr>
<td>Son hacim</td>
			<td>12.5 μL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. CRISPR-Cas9 RNP enjeksiyon Mix. Tüm reaktifler GKD nükleaz ücretsiz2' O. ücretsiz teknikleri reaktifler işlerken ve enjeksiyon karışım yaparken kullanılan gerekir RNase yeniden askıya alınmış olmalıdır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>[Final]</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCl pH 8.3</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>2.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>% 0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ara-20</td>
			<td>% 0.45</td>
		</tr>
<tr>
<td>İndinavir K</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. Solucan lizis arabellek tarifi. İndinavir K taze her kullanımdan önce eklenmesi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>1 x</td>
			<td>24 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x Q5 Mastermix</td>
			<td>12.5 μL</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Astar F1 (10 mikron)</td>
			<td>1,25 μL</td>
			<td>30 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Astar R1 (10 mikron)</td>
			<td>1,25 μL</td>
			<td>30 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solucan lizis</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>GKD2O</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>144 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Son hacim</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>504 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3. PCR Mastermix. PCR mastermix-var karışık çözüm homojen olana de pipetting tarafından. 21 µL PCR mastermix temiz PCR tüpleri için eklenmelidir ve sonra 4 µL in bireysel kurt lysate düzgün etiketli tüpler eklenmelidir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>1 x</td>
			<td>24 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzim arabellek x 10</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>48 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temizlenmiş PCR reaksiyon</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>----</td>
		</tr>
<tr>
<td>GKD2O</td>
			<td>7 μL</td>
			<td>168 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Restriksiyon enzimi (10 U/μL)</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>24 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Son hacim</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>240 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4. Restriksiyon enzimi Mastermix. Restriksiyon enzimi mastermix çözüm homojen olana de pipetting tarafından karışık olması. Restriksiyon enzimi mastermix 10 µL temizlenmiş PCR ürünü 10 µL için eklenmelidir

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins at JoVE.com

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

7.5K Görüntüleme.  University of Michigan. Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Video: A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genetik

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...