이 작품은 독일 우수 이니셔티브 (CellNetworks DFG 실 81)와 공동 연구 센터 SFB638 부분 회계를 통해 독일 연구 위원회 (DFG)에 의해 융자 되었다.

<ol>
	<li>Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules,+big+targets:+drug+discovery+faces+the+protein-protein+interaction+challenge.">Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge.</a> Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Rhee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+mapping+of+mitochondria+in+living+cells+via+spatially+restricted+enzymatic+tagging.">Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging.</a> Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).</li><li>Kim, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+biotinylation+and+affinity+purification+are+complementary+approaches+for+the+interactome+mapping+of+chromatin-associated+protein+complexes.">Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes.</a> J Proteomics. 118, 81-94 (2015).</li><li>Morriswood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bilobe+components+in+Trypanosoma+brucei+identified+using+proximity-dependent+biotinylation.">Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation.</a> Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).</li><li>Schopp, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID+a+conditional+proteomics+approach+to+monitor+the+composition+of+spatiotemporally+defined+protein+complexes.">Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes.</a> Nat Commun. 8, (2017).</li><li>B&#233;thune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+reveals+successive+steps+leading+to+miRNA-mediated+silencing+in+mammalian+cells.">Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells.</a> EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li><li>Weidenfeld, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+coding+and+inhibitory+RNAs+from+retargetable+genomic+loci.">Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci.</a> Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Jonas, S., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+understanding+of+microRNA-mediated+gene+silencing.">Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing.</a> Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).</li><li>MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+human+RISC-loading+complex.">In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Opitz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Asc1p/Receptor+for+Activated+C+Kinase+1+(RACK1)+Microenvironment+at+the+Head+Region+of+the+40S+Ribosome+with+Quantitative+BioID+in+Yeast.">Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).</li><li>Mackmull, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+nuclear+transport+receptor+cargo+specificity.">Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity.</a> Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSITe:+A+Method+for+Direct+Detection+and+Quantitation+of+Site-Specific+Biotinylation.">BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation.</a> J Proteome Res. , (2017).</li><li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+biotin+enable+large-scale+detection+of+biotinylation+sites+on+proteins.">Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins.</a> Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).</li><li>Chapat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-binding+protein+4EHP+effects+translation+silencing+by+microRNAs.">Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).</li><li>Luker, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID:+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions.">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+TurboID+for+efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms.">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

개요 절차 플라스 미드, biotinylation 상호 작용 유도 대 한 테스트 하는 방법 및 질량 분석 분석에 대 한 biotinylated 단백질을 분리 하는 방법 분할 BioID에 관심사의 유전자를 복제 하는 방법을 설명 합니다. 여기 과도 transfection에 따라 절차를 설명 합니다. 융해 단백질의 표정은 dox 매체에 추가 금액에 의해 조정 될 수 있다, 그러나 과도 transfection 조잡 한 overexpress 융합 단백질은 내 생에 비교 될 때 일부 셀과 비 균질 단백질 식으로 이어질 수 있습니다. 대조 물입니다. 이 해당 interactomes의 왜곡 하 고 충실 하 게 내 인 성 단백질을 포함 하는 상호 작용을 반영 하지 않는 PPI로 이어질 수 있습니다. 그것은 따라서 일반적으로 분할 BioID 과도 시스템으로 설정 된 후 안정 된 세포를 구성 하는 것이 좋습니다. 플라스 미드 Flp 중재 재결합 시스템과 호환 되며 동일한 tet 응답 요소의 규정의 두 유전자 장소. 필요한 경우, 그리고 호환 포유류 세포와 함께 사용 하는 경우, 안정적인 유도할 수 있는 세포의 쉽게 만들을 수 있습니다. 예를 들어 우리 rtTA 항생물질 활성화 녹음 방송 활성 제와 항생물질 중재 하는 유전자 발현 단단히 규제12수 있는 독특한 대상 게놈 소재 시를 표현 하는 헬러-EM2-11 줄을 사용 합니다. 이 세포 선 및 재결합 Flp 중재를 사용 하 여, 2-3 주 이내는 transgene의 복사본을 하나만 포함 하는 안정적인 셀 라인을 얻을 수 있습니다. 또는, 하나 또한 관심사의 유전자의 네이티브 게놈 loci에 BirA * 조각 소개 현재 게놈 편집 기술을 사용할 수 있습니다.
태그는 단백질에 의존 하는 모든 분석 결과에서 하나 결과 융해 단백질 기능 인지 고려 해야 합니다. 사용할 수 있는 데이터는 관심사의 단백질 (GFP 이미징 연구에 대 한)와 예 태그 기능 테스트는 유용 BirA * 조각 한다 결정을 복제 상류 또는 하류 관심의 유전자. 이러한 데이터를 사용할 수 있는 하나 N 말기 테스트 해야 또는 C 말기 단백질 기능 분석 결과에 태그. 예를 들어 있는 생 단백질 노크 아웃 되었고 야생 타입 상황에 비해 셀 라인에서 융해 단백질의 활동을 테스트할 수 있습니다. 관심사의 단백질 모두 N 및 C 터미널 태그 경우, 둘 다 시험 되어야 한다. 실제로, BioID 실험, 융해 단백질의 방향22라벨의 효율성을 좌우할 수 있다. 또한, 우리는 관찰 그 때 분할 BioID 단백질의 쌍에 적용, 두 단백질의는 추가 중 하나는 NBirA * CBirA * 조각 또한 영향9라벨의 효율성. 분할-BioID 플라스 미드에는 16 아미노산 긴 글리신/떠들고 풍부한 링커 BirA * 조각에 관심사의 단백질을 결합 했다 다른 PCA23 에서 촬영 하 고 모든 상호 작용 단백질에 대 한 우리를 위해 일했다 테스트 했습니다 지금까지. 그러나, 하나는 일부 단백질 쌍 짧은 지 또는 긴지를 링커 함께 잘 작동 수 있습니다 고려해 야 합니다. 최종적인 노트의 또 다른 분석 결과 Bollen 그룹24에 의해 설명 되었다. 이 분석 결과에 BirA * 우리 (E256/G257) 보다 다른 사이트 (E140/Q141)에서 분할 됩니다. 우리 모두 분할 BioID 맛 측면-의해-측면 테스트 한 E256/G257,이 프로토콜에 설명 된 두 개의 상호 작용 단백질에 결합 될 때 더 강한 재 활성화를 이끌어 발견9.
이 방법의 1 개의 일반적인 결점은 라벨의 느린 속도. 일반적으로 6 ~ 24 h 보육 시간 biotin 감지할 수 biotinylation6, 단백질 복합물의 동적 개장 공부에 대 한이 기술의 사용을 제외를 얻을 필요가 있다. 이 분석 결과 부분적으로 상호 작용 하는 두 단백질 활성화만이 경고를 해결, 하는 동안 라벨의 저속 응답 매우 동적 프로세스 또는 짧은 단백질 분석 공부에 대 한 그것의 사용을 배제. 설계 된 과산화 효소 APEX2 1 분3이내 근 단백질의 효율적인 라벨 홍보로 알려져 있다. APEX2에 따라 PCA BioID 파생 분석 실험의 느린 표시 속도 한계를 주소 따라서 수 있습니다. 증거의 원리 연구 같은는 분할 APEX2 분석 결과25설명. 그러나, homodimerizing 단백질은 성공적으로 biotinylated, 증명 남아 여부 분석 결과 또한 사용할 수 있습니다 레이블 및 단백질 단백질 상호 작용의 한 쌍의 주위에 조립 확인 하. 최근 감독된 진화 했다 TurboID 그리고 miniTurbo, 10 분26으로 훨씬 짧은 표시 시간 창을 허용 하는 향상 된 활동의 BirA * 2 개의 이체를 만드는 데 사용 됩니다. 분할-BioID이 새로운 변종에 적응 추가 애플 리 케이 션의 광범위 한 분야에이 기술의 사용을 확장할 것입니다.

대부분 세포 기능 동적으로 조립 고분자 복합물 단백질에 의해 수행 됩니다, 단백질 단백질 상호 작용 (PPI)의 식별 생물 의학 연구에서 주요 노력 이다. 실제로, PPI 자주 질병에 폐지 하 고 치료제1에 대 한 잠재적인 목표를 나타냅니다. 가장 널리 사용 되는 메서드 PPI의 식별, 친 화력 정화 (AP) 접근을 위한 세포 세포의 용 해, 관심사의 단백질은 특히 행렬에 정화 하 고 관련된 단백질 질량 분석에 의해 확인 이후에 (MS)입니다. AP-MS는 강력한 접근, 그것은 일반적으로 수행 하지 않습니다 가난 하 게 녹는 단백질 복합물, 아주 일시적인 상호 작용 또는 subcellular 구조를 필요로 하는 PPI에 잘. 또한, 데이터의 해석 단일 단백질은 종종 여러 가지 단백질 복합물의 부분으로 PPI 네트워크의 동적 특성에 의해 복잡 될 수 있습니다.
BioID2 APEX23,4 등 근접 라벨 기술은 최근 AP MS 접근의 제한 사항 중 일부를 해결 하기 위해 개발 되었다. BioID에서 효소 BirA * (에 해당 하는 야생 타입 대장균 효소의 G115R 이체) catalyzes 정한 biotinyl-앰프 (바이오-앰프) 주 아민과 반응의 형성. 야생 타입 효소, 바이오-앰프의 활성 중심에 유지, 반대로 BirA * 해제 바이오 앰프 주변 환경에의 확산을 허용 합니다. 그러므로, 관심사의 단백질을 융합 하 고 셀에 표현, 근 단백질 biotinylated 10 nm5의 예상된 범위 내에서 될 수 있습니다. 이러한 근 위 표시는 다음 streptavidin 풀 다운에 의해 고립 된 단백질과 MS로 식별. AP-MS, 반대로 BioID 융합 단백질의 식이 필요합니다. 그것은 따라서만 적용할 수 있습니다 단백질 누구의 기능 태그 방해 하지. 또한, 라벨의 속도 느린, 일반적으로 6-24 h2,6, 도전 짧은 단백질의 탐지를 만들기. 아직, AP-MS에 비해, BioID MS 제공 합니다 여러 주요 장점: 첫 번째, 그 캡처 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상호 작용 두 번째, 레이블이 단백질 보다는 조립된 단지 세포 세포의 용 해; 다음 격리 됩니다. 셋째, streptavidin pulldowns 변성 버퍼 및 거친 세척 상태를 사용 하 여 허용 합니다. 따라서, 방법은 더 과도 또는 약한 상호 작용7 또는 특정에서 발생 하는 상호 작용에 민감하고 subcellular 구조8을 하드입니다.
그러나, 대부분의 단백질 보통 세포 신호 또는 수행 해야 하는 함수에 개장 수 큰 단지의 일부입니다. 따라서, 단일 단백질은 일반적으로 여러 단지, 뚜렷한 기능 단위에 대응, 고유 포함 및 PPI 중복의 부분 이다. 두 방법 모두 게 주어진된 단백질이 있을 수 있습니다, 모든 협회의 개요를 제공 하지만 그들은 개별 PPI의 상황을 해결 하기 위해 실패 합니다. 후자의 해상도 높이기 위해 설계 된 단백질 조각을 보완성 분석 결과 (PCA)는 2 개의 비활성 파편 BirA * (촉매 도메인에 포함 된 NBirA *, 그리고 CBirA * 재 활성화 도메인으로 볼 수 있는)의 수에 재어셈블 때 가까이에 두는 활성 효소로 단백질9상호 작용. 결과 분할 BioID 분석 결과는 단백질 상호 작용 단백질의 쌍의 주위에 조립 및 따라서 컨텍스트 식별 종속 단백질 어셈블리에 근접 종속 biotinylation을 집중 한다. 우리는 최근 중재 하는 miRNA 유전자 침묵 통로9에 관련 된 두 가지 단백질 복합물을 해결 하 여 분할-BioID의 뛰어난 해상도 파워를 시연.
전부, 단일 및 간단한 분석 결과, 분할 BioID 수 있습니다 발견 하 고 구체적으로 정의 된 기능 단위는 주어진된 단백질 관련, 해당 단백질 복잡 한의 추가 상호 작용 단백질 알려져 제공에 PPI를 할당.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td>To make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution 25% NH3</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>6012</td>
			<td>To dissolve biotin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9518</td>
			<td>To select transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor plus sonification device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Other sonification devices are also ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td>To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076</td>
			<td>Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Ultra reagent</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BFU05L</td>
			<td>Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99002</td>
			<td>Any other model is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td>If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA miniprep kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2951</td>
			<td>Dox is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2948</td>
			<td>Make 1M stock solution, store at -20 &#176;C and always use fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 680-conjugated streptavidin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21848</td>
			<td>to use with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A5097</td>
			<td>Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32205</td>
			<td>Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td>To adjust pH of biotin stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763</td>
			<td>Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td>12083</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>Any other transfection reagent is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145</td>
			<td>To block Western blot membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3198</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td>Make a 10% (w/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31434</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (Nonidet P40 substitute)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>To wash cells before scrapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Added to the lysis buffer to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90003</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90004</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90008</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90009</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0555S</td>
			<td>To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 4-20% SDS precast gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG42012</td>
			<td>To use when running samples for MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue LDS Sample Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB31010</td>
			<td>Running buffer for the RunBlue precast gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5030</td>
			<td>Comes as a 20% stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tet-free serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181T</td>
			<td>we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855</td>
			<td>Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127</td>
			<td>Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split-bioid &#8212; proteomic analysis of context-specific protein complexes in their native cellular environment

기존 친 화력 정화 (AP)를 보완 하기 위해 단백질 단백질 상호 작용 (PPI)의 식별에 대 한 접근, 효소는 살아있는 세포에 있는 단백질의 근접-종속 라벨 수 있도록 도입 되었습니다. 하나 같은 효소, BirA * (BioID 접근에서 사용), 중재 약 10의 범위 내에서 단백질의 biotinylation nm. 그러므로, 관심사의 단백질을 융합 하 고 셀에 표현, 그것은 그들의 네이티브 환경에서 근 단백질의 라벨 수 있습니다. 조립된 단백질 복합물의 정화에 의존 하는 AP, 반대로 BioID 아무리 여부 그들은 여전히와 상호 작용 하 관심사의 단백질 들은 고립 된 세포 내에서 표시 된 단백질을 감지 합니다. 이후 biotinylates 근 단백질, 하나 그들을 매우 효율적으로 biotin에 streptavidin의 뛰어난 선호도에 투자 또한 수 있습니다. BioID 식별 과도 또는 약한 상호 작용에 대 한 AP 보다 더 나은 수행 하는 동안 두 AP 및 BioID 질량 분석 방법 주어진된 단백질이 있을 수 있습니다 모든 가능한 상호 작용에 대 한 개요를 제공 합니다. 그러나, 그들은 각 확인 된 PPI의 맥락에서 정보를 제공 하지 않습니다. 실제로, 대부분의 단백질 일반적으로 뚜렷한 성숙 단계 나 다른 기능 단위에 해당 하는 여러 단지의 일부입니다. 두 방법의 일반적인 제한이를 해결 하기 위해 우리 BirA * 효소에 따라 단백질 조각 보완성 분석 결과 설계 했습니다. 이 분석 결과에 BirA *의 2 개의 비활성 파편 수 때 가까운 근접에서 있는 그들은 융합 하는 두 개의 상호 작용 단백질에 의해 활성 효소로 재조 립. 결과 분할 BioID 분석 결과 따라서 단백질 단백질 상호 작용의 한 쌍의 주위에 조립의 라벨 수 있습니다. 이 두 가지는 주어진 컨텍스트에서 상호, 제공 분할 BioID 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 특정 컨텍스트에 종속 기능 단위 분석을 다음 수 있습니다. 여기, 우리는 테스트 하 고 분할-BioID 상호 작용 단백질의 쌍에 적용 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다.

어떻게이 방법은, Ago2, 단백질의 열려있는 독서 프레임 (ORFs) 설명 하기 위해 TNRC6C 및 Dicer (모든 통로 입을 미르 중재 하는 유전자에 관련 된) 분할 BioID 플라스 미드에 복제 되었다. Ago2는 미르 유도 입을 단지 내 (miRISC)를 번역 명과 TNRC6C 상호 작용 및 대상 mRNAs14의 자극으로 알려져 있다. MiRISC, Ago2를 조립 하기 전에 Dicer, 성숙한 miRNAs는 그것 미르15로드 받을 수 있습니다 단지 내를 생성 하는 효소와 상호 작용. 따라서 분할 BioID Ago2/Dicer 쌍 또는 Ago2/TNRC6C 쌍에 적용 되었습니다. 테스트 단백질의 각 쌍에 대 한 Ago2 중 NBirA * 또는 CBirA * 우리의 분할 BioID 플라스 미드 (그림 2)를 사용 하 여 융합 Dicer와 TNRC6C는 해당 동족 BirA *를 조각 했다. 또한, 각 단백질에 CBirA * 융합 되었고와 NBirA *-부정적인 컨트롤로 GFP 융해. 이 테스트 단백질 (표 1)의 각 쌍에 대 한 4 개의 반복 테스트 결과.
분할 BioID 테스트 단백질의 쌍의 상호 작용에 따라 활성화 되어 있는지 여부를 테스트 하려면 우리는 그림 1에 표시 된 구성표를 따 랐 다. 플라스 미드는 tet 시스템 호환 HeLa 세포 라인에 페 뚜렷이 했다. 융해 단백질의 표정 doxycycline (dox)와 유도 되었다 그리고 biotinylation 성장 매체를 초과 biotin을 추가 하 여 자극 했다. Dox와 biotin 20 h 보육 시간, 다음 셀 lysed 되었고 서 부 럽 활용된 streptavidin를 사용 하 여 biotinylated 단백질을 검출 하 여 분석. 포유류 세포에서 두 주요 밴드 활용된 streptavidin untransfected 샘플 (그림 3, 별)에 의해 일반적으로 검색 하 고 endogenously biotinylated 단백질 (대부분의 아마 미토 콘 드 리아 carboxylases)에 해당. 이 두 밴드가 모든 샘플에는 내부 로드 컨트롤으로 편리 하 게 사용할 수 있습니다, 그리고 따라서, 동일한 단백질의 로딩을 제어 하는 가사 단백질의 검출은 불필요. BioID/분할-BioID 실험에 대 한 일반적인, 관찰 될 수 있다 추가 주요 밴드는 자체 biotinylated 있어 융해 단백질. 다른 biotinylated 단백질을 볼 경우에 이미이 단계에서 융합 단백질의 biotinylation를 감지 두 테스트 단백질 세포에 상호 작용을 나타냅니다. 그림 3에 표시 하는 실험에서 그것은 NBirA *는 데 분명-CBirA * TNRC6C 또는 Dicer 융해와 Ago2 융합 단백질에는 CBirA * 반대 조합 보다 더 효율적입니다-Ago2 NBirA * 다른 2의 융해를 결합 하 여 단백질 (그림 3, 위쪽 패널, 차선 2-3 차선 6-7의 농도 비교). 또한, 활성화 했다 특정 CBirA * 융해의 없음 활성화 수 NBirA *-GFP 제어 융합 단백질 감지할 수 수준 (그림 3, 비교 레인 1, 4-5 untransfected 세포에 해당 하는 8 레인). 와 있기 때문에 우리의 플라스 미드 NBirA * myc 태그 CBirA * 플래그 태그 (그림 2)는, 이러한 두 태그 (그림 3, 하단 패널)에 대 한 항 체와 각 융해 단백질의 표정 수준은 분석할 수 있습니다.
상호 작용 유도 biotinylation, 관찰 실험, 조정 될 수 있다 고 biotinylated 단백질 프로토콜 (그림 4)의 제 4에에서 표시 된 대로 streptavidin 결합 된 구슬에 격리. 처음으로 격리를 수행할 때 서쪽 더 럽 히 (그림 5) 정화의 모든 단계를 분석할 수 있습니다. 일반적으로, 바인딩 구슬에는 거의 양적 고 거의 통해 아무 누출은 세척 관찰 한다. 이전 질량 분석을 위한 샘플 처리, 유도-biotinylation 예상 대로 작동 하 고 융합 단백질 표현 되었다 서쪽 오 점 실행 권장 합니다. 표현의 융해 단백질의 부족 가난한 transfection 효율 또는 결함이 dox 유도 중 하나 이다. 융해 단백질 표현 되었다 그러나 아무 biotinylation 관찰, 경우 초과 biotin (50 μ M) 매체에 실제로 추가 했다 하 고 주식 biotin 여전히 활성 상태 인지 확인 합니다. Eluted 소재 Coomassie 스테인드 단백질 젤 (그림 6)에 일반적으로 분석은, 관찰 될 강한 밴드 약 17 kDa에 실행 하 고 해당 단위체 streptavidin 하. 밴드 내 생 biotinylated 단백질 및 융합 단백질에 해당 하는 또한 관찰 될 수 있습니다. 우리는 일반적으로 streptavidin 밴드 잘 로딩 (그림 6)까지 위의 샘플 레인의 영역을 삭제할. 삭제 밴드 1.5 mL 튜브에 저장 하 고 질량 분석 시설에 보낼 수 있습니다. 또는 바운드 단백질 결합 하는 streptavidin 구슬에 트립 신 소화 수도 있습니다 하 고 열을 형성 하는 eluted 소화 펩 티 드. 우리가 일상적으로 MaxQuant 소프트웨어16 (주로 기본 매개 변수를 사용 하 여 및 참조 9 및 일반적인 MS 결과 대 한 자세한 내용은 참조 가능한 포스트 번역 상 수정 추가 리 biotinylation,)를 사용 하 여 MS 원시 데이터를 분석 하 고 페르세우스 스위트17 후속 통계 분석을 위해 모두 자유 소프트웨어. 샘플 3 개의 생물 복제에 일반적으로 실행 됩니다. 레이블 없는 정량화를 사용 하 여, 특히 농축된 단백질 제어 상태에 확인할 수 있습니다. Endogenously biotinylated 단백질 및 단백질 비 특히 BirA * 효소에 의해 표시를 필터링 하려면 우리만 크게 6 없는 단백질 생성 된 6 개의 데이터 집합에서 히트 이상의 농축 단백질을 고려 하십시오. 또한, 우리는 NBirA * 퓨전 단백질 대체 되었다 NBirA * 분할 BioID 데이터 집합을 통해 풍성 하 게 안타 고려-GFP. 특히 세포 배양 (SILAC) 양이 많은 proteomics18아미노산 안정 동위 원소 라벨을 사용 하 여 다른 데이터 분석 전략 제안 되었습니다. 또한, 다양 한 전략의 biotinylated 펩 티 드를 사용 하 여 streptavidin 변종 약화 선호도 biotin18, 유기 용 제19 또는 biotin을 사용 하 여 특별 한 차입 조건을 직접 격리에 대 한 설명 되었습니다. 항 체20,21. 반드시 더 많은 단백질의 발견에 지도, 하는 동안 안타의 특이성으로 더 많은 자신감을 추가 하는 biotinylation 사이트의 식별 하 고 유용 때 상호 작용의 토폴로지를 주소입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg"> 그림 1: 분할 BioID 절차의 개요. 단백질 1 상호 작용 단백질 2 복잡 한 A의 한 부분으로 또는 복잡 한 b.의 한 부분으로 단백질 3 특별히 복잡 한 A의 구성, 분할 BioID 단백질 1와 2에 적용할 수 있습니다. 질량 분석기의 사진 크리에이 티브 코몬즈 저작자 표시-공유 모두 3.0 Unported 라이센스 이며 https://commons.wikimedia.org ThermoScientificOrbitrapElite.JPG의 파일 이름에서 다운로드 한. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg"> 그림 2: 분할 BioID 플라스 미드의 식 카세트. 4 개의 플라스 미드 NBirA * 및 CBirA * 융해 단백질의 모든 조합을 테스트할 수 있도록 제공 합니다. 플라스 미드 및 완전 한 지도 표시 번호 addgene.org에서 사용할 수 있습니다. 플라스 미드 tet 응답 요소 (7 x tetO) 및 tet 식 시스템과 호환 되는 셀 라인에 사용 해야. 또한 모든 플라스 미드에 ORFs의 FKBP와 FRB는 융합 NBirA * 및 CBirA * 조각 각각 note. Rapamycin의 존재만이 두 가지 단백질 작용 하 고 따라서 신속 하 게이 화학9의 유무에 시스템을 테스트 하는 플라스 미드를 사용할 수 있습니다. 표시 제한 사이트 독특합니다. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg"> 그림 3: 분할 BioID 실험에 대 한 전형적인 서쪽 오 점. 상단 패널: 붙일 레이블된 streptavidin와 biotinylated 단백질의 검출. 하단 패널: 안티 Myc 및 반대로 플래그 항 체 융합 단백질의 검출. 단백질의 2 개 쌍에서 시험 되었다: Ago2/TNRC6C 및 Ago2/Dicer. 2 & 3 차선에서 Ago2 CBirA * 조각에 추가 했다. 레인 6 & 7, Ago2 NBirA * 조각에 추가 했다. 중요 한 신호 때 세 가지 단백질의 결합 했다 NBirA * 관찰 되었다-GFP (레인 1, 4-5). 별 내부 로드 컨트롤로 사용할 수 있는 endogenously biotinylated 단백질에 해당 하는 밴드를 나타냅니다. 이 그림은 그림 5B Schopp 외 의에서 적응 크리에이 티브 코몬즈 저작자 표시 4.0 국제 라이센스 하에서 9 . <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg"> 그림 4: streptavidin 풀 다운 절차의 개요. 질량 분석 분석에 대 한 biotinylated 단백질의 격리에 대 한 주요 단계 묘사 된다. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg"> 그림 5: streptavidin 풀 다운 실험에 대 한 전형적인 서쪽 오 점. 표시 된 각 샘플의 볼륨을 동등 했다 SDS polyacrylamide 젤에 로드 된. 부 럽, 다음 biotinylated 단백질 결합 하는 HRP streptavidin과 감지 했다. NBirA *에 해당 하는 밴드-TNRC6C 및 CBirA *-Ago2 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg"> 그림 6: 질량 분석 분석에 대 한 일반적인 Coomassie 스테인드 단백질 젤. 결합 하는 streptavidin 구슬에서 eluted 샘플 캐스트 단백질 젤에 로드 하 고 샘플 2-3 cm를 마이그레이션할 때까지 실행 했다. 약 17 kDa에서 본 주요 밴드 streptavidin 이다. 바로 그 밴드 위에 지역 excised 이며 질량 분석 시설에 보낸. NBirA *에 해당 하는 밴드-TNRC6C 및 CBirA *-Ago2 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transfection 샘플</td>
			<td colspan="3">테스트 조건</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">아니 transfection</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 일반적으로 2 개의 단백질에 분할-BioID를 적용할 때 조건을 테스트.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시퀀싱 뇌관</td>
			<td>시퀀스</td>
		</tr>
<tr>
<td>카세트 1 역 뇌관 (CBirA * 퓨전)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>카세트 2 역 뇌관 (NBirA * 퓨전)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 시퀀싱 분할 BioID 플라스 미드를 위한 뇌관.

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Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

split-bioid-proteomic-analysis-context-specific-protein-complexes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

19.6K 조회수.  Heidelberg University. 우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

비디오: Split-BioID — Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.

We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

연구

생화학

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.

A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.

1,2- Azaborines의 합성과 T4 리소자임 돌연변이와 그들의 단백질 복합체의 제조

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular choroid layer. Different regions of the retina are anatomically and molecularly distinct, facilitating unique functions and demonstrating differential susceptibility to disease. Proteomic analysis of each of these regions and layers can provide vital insights into the molecular process of many diseases, including Age-Related Macular Degeneration (AMD), diabetes mellitus, and glaucoma. However, separation of retinal regions and layers is essential before quantitative proteomic analysis can be accomplished. Here, we describe a method for dissection and collection of the foveal, macular, and peripheral retinal regions and underlying RPE-choroid complex, involving regional punch biopsies and manual removal of tissue layers from a human eye.One-dimensional SDS-PAGE as well as downstream proteomic analysis, such as liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), can be used to identify proteins in each dissected retinal layer, revealing molecular biomarkers for retinal disease.

The human retina is composed of functionally and molecularly distinct regions, including the fovea, macula, and peripheral retina. Here, we describe a method using punch biopsies and manual removal of tissue layers from a human eye to dissect and collect these distinct retinal regions for downstream proteomic analysis.

Proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 RPE의 해 부

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...