Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca tedesco (DFG) attraverso l'iniziativa di eccellenza tedesco (CellNetworks DFG-EXC 81) e un finanziamento parziale dal centro di ricerca in collaborazione SFB638.

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein-protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>De Munter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-BioID:+a+proximity+biotinylation+assay+for+dimerization-dependent+protein+interactions.">Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions.</a> FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+fragment+complementation+of+APEX2+for+detection+of+specific+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+TurboID+for+efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms.">Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms.</a> bioRxiv. , (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La procedura delineata descrive come clonare geni di interesse in Spalato-BioID plasmidi, come testare per biotinylation indotta da interazione e come isolare proteine biotinilate per analisi di spettrometria di massa. Descriviamo qui una procedura basata sulla trasfezione transiente. Mentre l'espressione delle proteine di fusione può essere regolato dalla quantità di dox aggiunto al medium, trasfezione transiente può portare all'espressione di proteine non omogenea con alcune cellule che iperesprimono grossolanamente le proteine di fusione rispetto all'endogena controparti. Questo può causare distorsioni dell'Interattomi corrispondente e al PPI che non rispecchiano fedelmente le interazioni che coinvolgono le proteine endogene. Così è in genere consigliabile costruire linee cellulari stabili una volta Spalato-BioID stabilita con il sistema transitorio. I plasmidi sono compatibili con il sistema di ricombinazione Flp-mediata e posizionare entrambi i geni di interesse ai sensi del regolamento dello stesso elemento tet-sensible a reagire. Se necessario e quando viene utilizzato con cellule di mammifero compatibili, consentono la facile creazione di linee cellulari stabilizzate inducibile. Ad esempio, usiamo la linea di HeLa-EM2-11 che esprime l'attivatore di trascrizione attivato da tetraciclina rtTA e un unico locus genomico indirizzabile da cui l'espressione genica di tetraciclina-mediata può essere strettamente regolato12. Utilizzare questa linea cellulare e ricombinazione Flp-mediata, linee cellulari stabili che contengono solo una copia del transgene possono essere ottenuti entro due-tre settimane. In alternativa, uno potrebbe anche utilizzare attuali tecniche di editing del genoma per introdurre i frammenti di BirA * nei nativi loci genomici dei geni di interesse.
Come in qualsiasi test che si basa sulla codifica una proteina, uno deve considerare se le proteine di fusione risultante sono funzionali. Dati disponibili nelle quali le proteine di interesse sono stata codificate (per esempio con GFP per gli studi di imaging) e funzionalmente testato sono utili per decidere se i frammenti di BirA dovrebbero essere clonato a Monte o a valle dei geni di interesse. Se tali dati non sono disponibili, uno dovrebbe testare N-terminalmente o C-terminali contrassegnati proteine in un'analisi funzionale. Ad esempio, l'attività delle proteine di fusione possa essere testato in una linea cellulare in cui la proteina endogena è stato eliminato e rispetto alla situazione di tipo selvaggio. Se le proteine di interesse tollerano entrambi i tag N - e C-terminale, entrambi devono essere testati. Infatti, in esperimenti di BioID, l'orientamento della proteina di fusione possa influenzare l'efficienza di etichettatura22. Inoltre, abbiamo osservato che quando l'applicazione di Spalato-BioID a una coppia di proteine, che delle due proteine viene aggiunto a entrambi i NBirA * o CBirA * frammento inoltre influenza l'efficienza di etichettatura9. Nei plasmidi di Spalato-BioID, l'16 amminoacido lungo glicina/serina ricco linker accoppiamento le proteine di interesse per i frammenti di BirA vennero presi da un altro PCA23 e ha lavorato per noi per tutte le proteine interagenti abbiamo testato finora. Tuttavia, si dovrebbe considerare che alcune coppie di proteine potrebbero funzionare meglio con linker più o meno lunghi. Della nota finale, un altro saggio è stato descritto dal gruppo Bollen24. In questo saggio, BirA * è diviso in un altro sito (E140/Q141) della nostra (E256/G257). Abbiamo testato entrambi sapori di Spalato-BioID side-by-side e trovato che E256/G257, descritti nel presente protocollo, porta alla riattivazione più forte quando accoppiati a due proteine interagenti9.
Generale uno svantaggio di questo metodo è la lenta velocità di etichettatura. In genere, il tempo di incubazione di 6-24 h con biotina è necessario ottenere apprezzabili biotinylation6, precludendo l'utilizzo di questa tecnica per lo studio della dinamica di rimodellamento dei complessi della proteina. Mentre questo test risolve parzialmente questo avvertimento come si attiva solo quando le due proteine interagiscono, la bassa velocità di etichettatura precludono l'uso per lo studio della risposta di processi molto dinamici o per analizzare le proteine di breve durata. La perossidasi derivati dal APEX2 è conosciuta per promuovere etichettatura efficiente delle proteine prossimale entro 1 min3. Un PCA basato su APEX2 così potrebbe affrontare le limitazioni della velocità d'etichettatura lenta di saggi BioID-derivato. Uno studio di prova-de-principio descritto un tale Spalato-APEX2 dosaggio25. Tuttavia, anche se una proteina di homodimerizing era con successo biotinilato, se l'analisi può anche essere usata per etichettare e identificare le proteine che assemblano intorno a una coppia di proteine interagenti resta da dimostrare. Molto recentemente, diretta evoluzione è stata utilizzata per creare TurboID e miniTurbo, due varianti di BirA * con attività migliorata che consentono a windows molto più breve di tempo a etichettatura, fino a 10 min26. Spalato-BioID per queste nuove varianti di adattamento estenderà ulteriormente l'uso di questa tecnica a un più ampio campo di applicazioni.

Funzioni più cellulari sono interpretato da proteine che assemblare dinamicamente complessi macromolecolari, l'identificazione delle interazioni proteina-proteina (PPI) è uno sforzo maggiore nella ricerca biomedica. Infatti, PPI sono spesso liberalizzati nella malattia e rappresentare un potenziale bersaglio per terapie1. Metodo il più ampiamente usato per l'identificazione di PPI è l'approccio di purificazione (AP) di affinità in cui, a seguito di lisi delle cellule, una proteina di interesse viene purificata in particolare su una matrice e proteine associate vengono successivamente identificate mediante spettrometria di massa (MS). Mentre AP-MS è un approccio potente, in genere non esegue bene su complessi proteici scarsamente solubili, interazioni molto transitorie o PPI che richiedono una struttura subcellulare intatta. Inoltre, l'interpretazione dei dati può essere complicata dalla natura dinamica delle reti PPI, come una singola proteina è spesso parte di diversi complessi proteici distinti.
Tecniche di prossimità-etichettatura come BioID2 o APEX23,4 recentemente sono state sviluppate per risolvere alcune delle limitazioni degli approcci AP-MS. In BioID, l'enzima BirA * (corrispondente a una variante di G115R dell'enzima wild-type e. coli ) catalizza la formazione di biotynil-AMP labile (bio-AMP) che possono reagire con le ammine primarie. In contrasto con l'enzima di tipo selvaggio, che conserva bio-AMP nel suo centro attivo, BirA * rilascia bio-AMP permettendo la sua diffusione al suo ambiente limitrofo. Quindi, quando fusa ad una proteina di interesse ed espressa in cellule, proteine prossimale possono essere biotinilati entro un intervallo stimato di 10 nm5. Questi contrassegnati prossimali proteine sono quindi isolate da streptavidina pulldown e identificate da MS. Al contrario di AP-MS, BioID richiede l'espressione di una proteina di fusione. Solo così può essere applicato a proteine la cui funzione non è ostacolata da tagging. Inoltre, la velocità di etichettatura è lenta, in genere 6 – 24 h2,6, rendendo difficile il rilevamento delle proteine di breve durata. Eppure, rispetto ad AP-MS, BioID-MS offre parecchi vantaggi chiave: primo, la sua cattura le interazioni in ambiente nativo di cellulare; in secondo luogo, etichettate proteine piuttosto che complessi montati sono isolati dopo lisi cellulare; in terzo luogo, streptavidina pulldowns consentire l'utilizzo di buffer denaturante e condizioni di lavaggio difficili. Quindi, il metodo è più sensibile per rilevare transitori o interazioni deboli7 interazioni che si verificano su una specifica e difficile da isolare la struttura subcellulare8.
Tuttavia, la maggior parte delle proteine sono solitamente parte di più grandi complessi che possono rimodellare secondo stimoli cellulari o per la funzione che deve essere eseguita. Quindi, una singola proteina è in genere parte di diversi complessi, corrispondenti a distinte unità funzionali coinvolgendo distinte o sovrapposizione PPI. Entrambi gli approcci offrono una panoramica di tutte le associazioni che può avere una data proteina, ma non riescono ad affrontare il contesto di PPI individuali. Per aumentare la risoluzione di quest'ultimo, abbiamo progettato un test di complementazione di frammenti proteici (PCA) in cui due frammenti inattivi di BirA * (NBirA *, che contiene il dominio catalitico, e CBirA * che può essere visto come il dominio di riattivazione) può Rimontare in un enzima attivo quando portato in prossimità di due interagendo proteine9. Il dosaggio di Spalato-BioID risultante si concentra il biotinylation vicinanza-dipendente sulle proteine che assemblare intorno a una coppia di proteine interagenti e così permette l'identificazione del contesto gli assembly dipendenti della proteina. Recentemente abbiamo dimostrato la potenza di un'eccezionale risoluzione di Spalato-BioID risolvendo due distinte proteine complessi coinvolti nel miRNA-mediata silenziamento genico via9.
Complessivamente, in un'unica e semplice analisi, Spalato-BioID permette alla scoperta e in particolare assegnando PPI definiti unità funzionali in cui una data proteina è coinvolta, fornito che un ulteriore interazione della proteina della corrispondente proteina complessa è noto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td>To make TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution 25% NH3</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>6012</td>
			<td>To dissolve biotin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9518</td>
			<td>To select transformed bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor plus sonification device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Other sonification devices are also ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td>To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin fraction V</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8076</td>
			<td>Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Ultra reagent</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BFU05L</td>
			<td>Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrappers</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99002</td>
			<td>Any other model is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6046</td>
			<td>If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA miniprep kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2951</td>
			<td>Dox is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2948</td>
			<td>Make 1M stock solution, store at -20 &#176;C and always use fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 680-conjugated streptavidin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>21848</td>
			<td>to use with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td>The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A5097</td>
			<td>Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32205</td>
			<td>Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>FG-91302</td>
			<td>Any other kit is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td>To adjust pH of biotin stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763</td>
			<td>Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45&#160;&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Gr&#252;ssing GmbH</td>
			<td>12083</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>Any other transfection reagent is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145</td>
			<td>To block Western blot membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MluI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3198</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td>Make a 10% (w/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31434</td>
			<td>Make a 5M stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (Nonidet P40 substitute)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>806552</td>
			<td>To wash cells before scrapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PmeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0560</td>
			<td>Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Added to the lysis buffer to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90003</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90004</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90008</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90009</td>
			<td>Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity PCR kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0555S</td>
			<td>To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick ligation kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 4-20% SDS precast gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG42012</td>
			<td>To use when running samples for MS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue LDS Sample Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB31010</td>
			<td>Running buffer for the RunBlue precast gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5030</td>
			<td>Comes as a 20% stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tet-free serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181T</td>
			<td>we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704150</td>
			<td>High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4855</td>
			<td>Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975</td>
			<td>Make a 20% (v/v) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127</td>
			<td>Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

split-bioid &#8212; proteomic analysis of context-specific protein complexes in their native cellular environment

Per completare la purificazione di affinità esistente (AP) e approcci per l'identificazione delle interazioni proteina-proteina (PPI), sono stati introdotti gli enzimi che permettono l'etichettatura di prossimità-dipendente delle proteine in cellule viventi. Una tale enzima, BirA * (utilizzato nell'approccio BioID), media la biotinilazione delle proteine all'interno di un intervallo di circa 10 nm. Quindi, quando fusa ad una proteina di interesse ed espressa in cellule, permette l'etichettatura delle proteine prossimale nel loro ambiente nativo. Al contrario di AP che si basa sulla purificazione dei complessi della proteina assemblato, BioID rileva proteine che sono state contrassegnate all'interno delle cellule non importa se ancora stanno interagendo con la proteina di interesse quando sono isolate. Dal momento che biotinylates prossimale proteine, uno può inoltre sfruttare l'eccezionale affinità di streptavidina per biotina per isolarli in modo molto efficiente. Mentre BioID si comporta meglio di AP per identificazione transitori o interazioni deboli, entrambi gli approcci spettrometria di massa di AP e BioID forniscono una panoramica di tutte le possibili interazioni che può avere una data proteina. Tuttavia, non forniscono informazioni sul contesto di ogni PPI identificati. Infatti, la maggior parte delle proteine in genere fanno parte di diversi complessi, corrispondenti a maturazione distinti passaggi o diverse unità funzionali. Per risolvere questa limitazione comune di entrambi i metodi, abbiamo progettato un saggio di complementazione di frammenti proteici basato sull'enzima di BirA. In questo test, due frammenti di BirA * inattivi possono Riassemblare in un enzima attivo quando portato in prossimità di due proteine interagenti a cui essi sono fuse. Il dosaggio di Spalato-BioID risultante permette così l'etichettatura delle proteine che assemblano intorno a una coppia di proteine interagenti. Purché questi due interagire solo in un determinato contesto, Spalato-BioID quindi permette l'analisi di specifiche unità funzionali di contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Qui, forniamo un protocollo passo-passo per testare e applicare Spalato-BioID a una coppia di proteine interagenti.

Per illustrare il funzionamento di questo metodo, l'open reading frame (ORF) delle proteine Ago2, TNRC6C e Dicer (tutti i soggetti coinvolti nel gene miRNA-mediata del silenziamento via) sono stati clonati in plasmidi di Spalato-BioID. Ago2 è noto per interagire con TNRC6C all'interno di un indotto da miRNA silenziamento complesso (miRISC) che reprime la traduzione e stimolare il decadimento di destinazione mRNAs14. Prima di montare la miRISC, Ago2 interagire con Dicer, l'enzima che produce Mirna maturi, all'interno di un complesso in cui potrebbe ottenere caricato con un miRNA15. Spalato-BioID è stato quindi applicato alla coppia Ago2/Dicer o la coppia Ago2/TNRC6C. Per ogni coppia di proteine provate, Ago2 era sia fuso a NBirA * o CBirA * utilizzando nostro Spalato-BioID plasmidi (Figura 2) e il giocatore di dadi e TNRC6C a BirA cognate corrispondente * frammento. Inoltre, ogni proteina è stata fusa per CBirA * e accoppiato con un NBirA *-fusione di GFP come controllo negativo. In questo modo test quattro iterazioni per ogni coppia di testata della proteina (tabella 1).
Per verificare se Spalato-BioID è attivato sull'interazione della coppia di proteine provate, abbiamo seguito lo schema raffigurato in Figura 1. I plasmidi sono stati trasfettati in una linea di tet-sistema compatibile delle cellule HeLa. L'espressione delle proteine di fusione è stata indotta con doxiciclina (dox) e biotinylation è stata stimolata con l'aggiunta di biotina in eccesso al medium di crescita. A seguito di un periodo di incubazione di 20 h con dox e biotina, cellule erano lisate e analizzate mediante Western blotting con streptavidina coniugata per rilevare proteine biotinilate. In cellule di mammifero, due importanti bande musicali vengono in genere rilevati dalla streptavidina coniugata nel campione untransfected (Figura 3, stelle) e corrispondono alle proteine di biotinylated (molto probabilmente mitocondriali carbossilasi) in modo endogeno. Queste due bande sono presenti in tutti i campioni e possono essere comodamente utilizzate come carico interno controlli, quindi, la rilevazione di una proteina di pulizia per controllare il caricamento degli importi uguali di proteina è superflua. Tipico per un esperimento di BioID/Spalato-BioID, principali bande supplementari che possono essere osservate sono le proteine di fusione che ha auto-biotinilato. Anche se non sono visto senza altre proteine biotinilate, rilevazione biotinilazione delle proteine di fusione in questa fase già indica che le due proteine testate interagito nelle cellule. Nell'esperimento raffigurato in Figura 3, è chiaro che, avendo un NBirA *-proteina di fusione Ago2 accoppiata con CBirA * fusioni a TNRC6C o Dicer è più efficiente rispetto le combinazioni opposte in cui CBirA *-Ago2 è abbinato al NBirA * fusioni degli altri due proteine (Figura 3, pannello superiore, confrontare le intensità delle corsie 2-3 a corsie 6-7). Inoltre, l'attivazione era specifico come nessuno delle fusioni CBirA * potrebbe attivare il NBirA *-proteina di fusione GFP controllo a livelli apprezzabili (Figura 3, confronta i vicoli 1, 4-5 alla corsia 8 che corrisponde alle cellule untransfected). Poiché nel nostro plasmidi, NBirA * ha un tag di myc e CBirA * ha un tag di bandiera (Figura 2), i livelli di espressione di ogni proteina di fusione possono essere analizzati con gli anticorpi contro questi due tag (Figura 3, pannello inferiore).
Quando indotta da interazione biotinylation è osservato, l'esperimento può essere scalato, e le proteine biotinilate isolato su perle di streptavidina-accoppiato come indicato al paragrafo 4 del protocollo (Figura 4). Quando si esegue l'isolamento la prima volta, tutti i passaggi della purificazione possono essere analizzati da Western blotting (Figura 5). In genere, associazione ai talloni deve essere quasi quantitativa e praticamente nessuna perdita attraverso dovrebbe essere osservata nei lavaggi. Previo trattamento dei campioni per la spettrometria di massa, si consiglia di eseguire un Western blot per garantire indotto-biotinylation ha funzionato come previsto e che le proteine di fusione sono stati espressi. La mancanza di espressione di proteine di fusione è dovuto efficienza di trasfezione scadente o difettoso dox induzione. Se le proteine di fusione sono stati espressi ma nessun biotinylation è osservato, controllare se la biotina in eccesso (50 μM) è stata effettivamente aggiunta al medium e che la biotina stock è ancora attiva. Quando il materiale viene analizzato su un gel di proteina Coomassie-macchiato (Figura 6), in genere, la band più forte deve essere osservato viene eseguito al kDa circa 17 e corrisponde alla streptavidina monomerico. Bande corrispondenti alle proteine biotinilate endogeno e le proteine di fusione possono anche essere osservati. Asportiamo in genere l'area della corsia campione sopra la banda di streptavidina fino al caricamento ben (Figura 6). La band asportata può essere memorizzata in una provetta da 1,5 mL e inviata a un centro di spettrometria di massa. In alternativa, proteine rilegate possono anche essere tripsina-digerito le perline streptavidina-accoppiato e digeriti peptidi eluiti formano la colonna. Utilizziamo abitualmente i MaxQuant software16 (utilizzando principalmente i parametri predefiniti e aggiunta di lisina biotinylation come una possibile modificazione post-traduzionale, vedere riferimento 9 per ulteriori dettagli e per i risultati tipici di MS) per analizzare i dati grezzi di MS e il Perseo suite17 per la successiva analisi statistica, entrambi sono software libero. I campioni vengono in genere eseguiti in tre replicati biologici. Utilizzando quantificazione privo di etichetta, in particolare arricchito di proteine possono essere identificati in condizioni di controllo. Per filtrare in modo endogeno biotinilati proteine e proteine che non specificamente indicate per l'enzima di BirA, consideriamo solo proteine che sono significativamente sopra Risultati da sei set di dati generato con sei proteine non correlate. Inoltre, consideriamo solo i successi che si sono arricchite nel corso di un dataset di Spalato-BioID in cui le proteine di fusione NBirA * sono state sostituite da NBirA *-GFP. Altre strategie di analisi dei dati sono state proposte in particolare mediante etichettatura isotopo stabile con gli amminoacidi nella coltura delle cellule (SILAC) per proteomica quantitativa18. Inoltre, sono state descritte diverse strategie per l'isolamento diretto di biotinylated peptidi usando una variante di streptavidina con affinità indebolito a biotina18, condizioni di eluizione speciale utilizzando solventi organici19 o biotina-specifiche gli anticorpi20,21. Mentre non necessariamente conduce alla scoperta di altre proteine, l'identificazione dei siti di biotinilazione aggiungere più fiducia per quanto riguarda la specificità dei successi e utile quando si sta occupando la topologia di un'interazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg"> Figura 1: Panoramica della procedura Spalato-BioID. Proteina 1 interagisce con la proteina 2 come parte del complesso A o con proteina 3 come parte del complesso B. Per sondare in particolare la composizione del complesso A, Spalato-BioID può essere applicato alle proteine 1 e 2. La fotografia di uno spettrometro di massa è sotto una licenza Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported ed è stata scaricata da https://commons.wikimedia.org con il nome del file di ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg"> Figura 2: cassette di espressione dei plasmidi Spalato-BioID. Mettiamo a disposizione quattro plasmidi per consentire la verifica di tutte le combinazioni di NBirA * e CBirA * proteine di fusione. I plasmidi e mappe complete sono disponibili presso addgene.org sotto i numeri indicati. I plasmidi hanno un elemento tet-sensible a reagire (7 x tetO) e devono essere utilizzati in una linea cellulare che è compatibile con il sistema di espressione di tet. Si noti inoltre che in tutti i plasmidi del ORFs di FKBP e FRB sono fuse alla NBirA * e CBirA * frammenti rispettivamente. Queste due proteine interagiscono solo in presenza di rapamicina e quindi i plasmidi possono essere utilizzati per testare rapidamente il sistema in presenza o in assenza di questa chimica9. I siti di restrizione indicata sono unici. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg"> Figura 3: tipico Western blot per un esperimento di Spalato-BioID. Pannello superiore: la rilevazione delle proteine biotinilate con streptavidina fluorescente contrassegnato. Pannello inferiore: rilevamento delle proteine di fusione con gli anticorpi anti--Myc e anti-FLAG. Due coppie di proteine sono state testate: Ago2/TNRC6C e Ago2/Dicer. Nelle corsie 2 & 3, Ago2 è stato aggiunto il frammento di CBirA. Nelle corsie 6 & 7, Ago2 è stato aggiunto il frammento di NBirA. Nessun segnale significativo è stato osservato quando uno qualsiasi dei tre proteine sono stato combinato con NBirA *-GFP (corsie 1, 4-5). Le stelle indicano le bande corrispondenti in modo endogeno proteine biotinilate che possono fungere da controlli di carico interno. Questa figura è adattata da figura 5B di Schopp et al. 9 sotto una licenza Creative Commons Attribuzione 4.0 internazionale. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg"> Figura 4: Panoramica della procedura di pulldown streptavidina. Passaggi principali per l'isolamento delle proteine biotinilate per analisi di spettrometria di massa sono raffigurati. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg"> Figura 5: tipico Western blot per un esperimento di pulldown streptavidina. Volumi di ogni campione indicato uguali sono stati caricati su un gel di SDS-poliacrilammide. A seguito di Western blotting, proteine biotinilate sono state rilevate con streptavidina HRP-accoppiato. Bande corrispondenti a NBirA *-TNRC6C e CBirA *-Ago2 sono indicati. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg"> Figura 6: gel macchiato di Coomassie tipico proteina per l'analisi di spettrometria di massa. Campione eluito dalla streptavidina-accoppiato perline era caricato su un gel di proteina prefabbricati ed eseguire fino a quando il campione migrare 2-3 cm. La band principale vista al kDa circa 17 è streptavidina. L'area direttamente sopra quella banda è asportato e inviato a un centro di spettrometria di massa. Bande corrispondenti a NBirA *-TNRC6C e CBirA *-Ago2 sono indicati. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Campione di transfezione</td>
			<td colspan="3">Stato testato</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GFP / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">Nessun transfezione</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Testato in genere condizioni applicando Spalato-BioID di due proteine.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer di sequenziamento</td>
			<td>sequenza</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer reverse cassetta 1 (CBirA * fusione)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer reverse cassetta 2 (NBirA * fusione)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Sequencing primers per i plasmidi di Spalato-BioID.

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Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Forniamo un protocollo dettagliato per Spalato-BioID, un'analisi di frammenti-complementazione della proteina basata sulla tecnica di prossimità-etichettatura BioID. Attivato sull'interazione di due proteine specificate, permette l'analisi proteomica dei complessi della proteina contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Il metodo è semplice, economica e richiede solo la normale attrezzatura da laboratorio.

Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

split-bioid-proteomic-analysis-context-specific-protein-complexes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

19.6K Views.  Heidelberg University. Forniamo un protocollo dettagliato per Spalato-BioID, un'analisi di frammenti-complementazione della proteina basata sulla tecnica di prossimità-etichettatura BioID. Attivato sull'interazione di due proteine specificate, permette l'analisi proteomica dei complessi della proteina contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Il metodo è semplice, economica e richiede solo la normale attrezzatura da laboratorio.

Video: Split-BioID — Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.

We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.

L&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

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Biochimica

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.

A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.

Sintesi di 1,2-Azaborines e la preparazione dei loro complessi proteici con T4 lisozima Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular choroid layer. Different regions of the retina are anatomically and molecularly distinct, facilitating unique functions and demonstrating differential susceptibility to disease. Proteomic analysis of each of these regions and layers can provide vital insights into the molecular process of many diseases, including Age-Related Macular Degeneration (AMD), diabetes mellitus, and glaucoma. However, separation of retinal regions and layers is essential before quantitative proteomic analysis can be accomplished. Here, we describe a method for dissection and collection of the foveal, macular, and peripheral retinal regions and underlying RPE-choroid complex, involving regional punch biopsies and manual removal of tissue layers from a human eye.One-dimensional SDS-PAGE as well as downstream proteomic analysis, such as liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), can be used to identify proteins in each dissected retinal layer, revealing molecular biomarkers for retinal disease.

The human retina is composed of functionally and molecularly distinct regions, including the fovea, macula, and peripheral retina. Here, we describe a method using punch biopsies and manual removal of tissue layers from a human eye to dissect and collect these distinct retinal regions for downstream proteomic analysis.

Dissezione della Retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...