우리는 친절 하 게 제공 하는 인코딩 3xFLAG LRRK2 WT 및 돌연변이 플라스 미드에 대 한 박사 타 케시 Iwatsubo (동경, 일본) 감사 합니다. 우리는 또한 친절 하 게 제공 MLi-2와 HA Rab10 인코딩 플라스 미드에 대 한 박사 다리오 Alessi (던 디 대학, 영국) 감사 합니다. 이 작품 과학 진흥 (JSP) KAKENHI 보조금 번호 JP17K08265 (병사는)에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다.

<ol>
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저자는 공개 없다.

여기, 우리 감지 LRRK2 P 태그 방법론에 따라 내 생 수준에 의해 인 산화 Rab10 손쉬운 강력한 방법을 설명 합니다. Phosphorylated Rab10에 대 한 현재 사용할 수 있는 항 체 overexpressed 단백질15만으로 작동을 하기 때문에 P 태그 SDS 페이지를 활용 하 여 현재 메서드 Rab10 인 산화의 내 생 수준을 평가 하는 유일한 방법입니다. 또한, 현재 메서드는 셀에 Rab10 인 산화의 산출할 추정 수 있습니다. P 태그 방법론 인 단백질에 일반적으로 적용할 수 있기 때문에, 현재 프로토콜 "프로토 타입" 다른 인 단백질 유사한 방법 수립에 대 한 수 있습니다.
프로토콜에 중요 한 단계는 주조 젤과 샘플의 준비. P 태그 아크릴 상대적으로 사진 정한 시 약 이며 phosphorylated 단백질 전기 이동 기동성을 지체 하는 능력은 4 ° c.에 장기 저장 후 손실 때로는 연구원 P 태그 아크릴 빛에 노출 되지 않도록 모든 주의 해야한다. 또한, P 태그 분자 복합 인산 염을 잡으려고 미네소타2 + 이온을 형성 해야 합니다. 따라서, 샘플에는 상용 SDS 페이지 샘플 버퍼의 일반적인 구성 요소를 같은 EDTA, chelating 에이전트 없어야 합니다. 클래식 Laemmli 샘플 버퍼를 사용 하 여 P 태그 SDS 페이지에 대 한 샘플을 준비 하는 것이 좋습니다.
또 다른 중요 한 포인트 아크릴 아 미드, P-태그 아크릴 및 분리 젤 혼합물 (그림 S2)에서 MnCl2 의 농도 철저 하 게 최적화 하는 것입니다. Phosphorylated 및 비 phosphorylated 밴드의 이동 거리는 시 약 사용 (많은, 순 결, 등)에 따라 달라 집니다 그리고 조합에서 여러 다른 농도 테스트 하 여 적절 한 농도의 최적화 필수 (예를 들어, P 태그 아크릴 (25, 50, 75 µ M), MnCl2 (1:2 또는 1:3 어 금 니 비율을 P 태그 아크릴), 그리고 아크릴 (7.5, 10, 12.5%)). Phosphorylated 및 비 phosphorylated 밴드는 젤의 중간에 나타나야 하 고 잘 서로에서 분리. 최적화 과정에 대 한 이동된 밴드는 쉽게 감지 하기 때문에 overexpressed Rab10를 사용 하는 것이 좋습니다. 저자는이 프로토콜에 대 한 제어 샘플을 제공할 수 있습니다.
이 프로토콜을 일으킬 수 있는 가장 큰 혼란 중 일반 및 P 태그 SDS 페이지 젤은 MWM의 마이그레이션 패턴의 차이 때문에 있을 것입니다. 일반 및 P 태그 SDS 페이지 젤 (모두 10%), MWM의 마이그레이션 패턴은 크게 다른 그림 s 3에서 같이, 그리고 하나의 P 태그 SDS 페이지 젤에 단백질의 분자량을 계산는 MWM를 사용할 수 없습니다. 그러나, P 태그 SDS 페이지 젤에는 MWM 중 서 젤 ( 그림 S3에 화살촉), 젤 (참조 그림 S4) 중 일관 되 게 관찰 되는 중간에 여. 항상이 MWM phosphorylated 및 비 phosphorylated Rab10의 밴드 사이 마이그레이션합니다. 따라서,이 마커는 P 태그 SDS 페이지 랜드마크 phosphorylated 및 비 phosphorylated Rab10의 밴드 볼 수의 거친 감각을가지고 서 뿐만 아니라 전송 되기 전에 작동을 위해 뿐만 아니라 유용 합니다.
Immunoblots 밴드의 검출, 우리는 냉각된 CCD 카메라를 장착 하는 영상 사용 ( 재료의 표참조) 또한 기존의 x 선으로 개발 시스템, 필름과 두 시스템 잘 작동을 발견. 경작된 한 세포에 Rab10 인 산화의 내 생 수준 감지, 그것은 내 생 LRRK2, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (중 기본 교양 또는 셀 라인 (불후의 명작 등의 높은 식 수치가 셀 라인을 사용 하는 데 필요한 3T3 스위스 알 비 노, 등))과 인간의 폐 암 파생 A549 세포. 마우스 조직 인 산화 Rab10의 생 레벨의 검출, 폐16을 사용 하는 것이 좋습니다.
Rab10 인 산화의 정량 보다 평소 immunoblotting 아니다. Rab10 인 산화의 산출할 ( 그림3에서 참조)로 매우 낮은 경우 비 phosphorylated 밴드 (폐쇄 원형으로 표시)의 강도 경향이 채도 수준의 위까지 산출할의 정확한 결정 불가능 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 질적 추정 아직도 가능 하다 어떤 경우에, 현재 메서드를 사용 하지 않고 얻을 하지 않습니다. 이후 생 Rab10의 인 산화의 검출에는 장기간된 노출 필요 합니다, 거기 경향이 P 태그에 몇 가지 일반적인 밴드 오도 불구 하 고이 프로토콜에 사용 되는 안티-Rab10 항 체는 정상적인 사용에 대 한 상당히 깨끗 한 immunoblots 제공 . 일반적인 밴드에 phosphorylated 단백질 구별, phosphorylated 밴드, 하지만 하지 일반 밴드, 사라지게 한다는 억제제 치료 컨트롤 사용 하 여 중요 하다. LRRK2 phosphorylates Rab8 Rab1015, 외 고 우리는 성공적으로 적용 현재 프로토콜 Rab8A에 뿐만 아니라 (데이터 표시 되지 않음). 현재 프로토콜 사용 될 검사 어떤 단백질의 인 산화 단백질이 큰 경우 기술적인 문제가 있을 수도 있지만 (&#62; 100 kDa) 또는 곱하기 phosphorylated. Rab10는 작은 단백질 (25 kDa) 때문에 홀로 LRRK2에 의해 Thr73에 phosphorylated, P 태그 SDS 페이지의 결과입니다 간단한 하나의 이동된 밴드 관찰.
가까운 미래에, 그것은 양적 평가로 뿐만 아니라 PD 환자에 LRRK2의 키 니 아 제 활동의 변화를 평가 하는 높은 처리량 방법에 환자에서 파생 된 샘플의 LRRK2의 키 니 아 제 활동을 감지 하는 방법은 설정에 중요 한 것 효과 약물의 LRRK2에 임상 시험. 이후 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 생 LRRK223, PBMCs의 상대적으로 높은 수준 또는 더 고립 된 혈액 세포 인 산화 Rab10 내 생에 대 한 테스트 가치가 있을 것입니다. 현재 메서드는 뿐만 아니라 신호 전달 경로는 LRRK2의 기본적인 생물학 조사에 도움이 될 하지만 또한 취득 한 기본-의 증거-개념 환자 파생 된 샘플에는 샘플 같은 대규모 연구에서 분석 하는 것입니다 결정에 도움이.

PD 주로 영향을 미치는 dopaminergic 신경은 midbrain에 노인1모터 시스템의 장애에서 발생 하는 가장 흔한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 대부분의 환자는 산발적으로 PD를 개발, 질병을 상속 하는 가족이 있습니다. FPD2연결 될 몇몇 유전자에 돌연변이 발견 되었습니다. FPD에 대 한 원인 유전자 중 하나입니다 LRRK2, 8 개의 missense 돌연변이 (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S, 및 I2020T) 라는 PARK8 지배적 상속된 FPD에 연결 보고3,,45를 지금까지 있다. 여러 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) 산발적 PD 환자 또한 식별 LRRK2 로커 스에서 게놈 변이 위험 요인으로 PD, 제안 LRRK2의 기능에 이상이 모두 산발적 neurodegeneration의 일반적인 원인에 대 한 그리고 PARK8 FPD6,,78.
LRRK2 신 부유한 반복 도메인, 복잡 한 단백질 (ROC) 도메인, ROC (오호) 도메인, 떠들고/트레오닌 단백질 키 니 아 제 도메인 및 WD40 반복 도메인9의 C-터미널의 GTP 바인딩 Ras 구성 된 큰 단백질 (2,527 아미노산) 이다. 8 FPD 돌연변이 찾을 이러한 기능 도메인; N1437H 그리고 R1441C/G/H/S ROC 도메인, 오호 도메인, G2019S 및 I2020T 키 도메인에서 Y1699C. 가정 했다 이후로 PD 환자10,,1112에 돌연변이 발견 가장 자주, G2019S 돌연변이 체 외에서2-3 배13LRRK2의 키 니 아 제 활동 증가, LRRK2 substrate(s)의 인 산화의 비정상적인 증가 신경에 독성입니다. 그러나, 그것은 되었습니다 하지 순수 관련 LRRK2 기판의 인 산화 환자 파생된 샘플에서 평가 하는 방법의 부족으로 인해 가족/산발적 PD 환자에서 변경 여부를 공부 하.
단백질 인 산화는 일반적으로 immunoblotting 또는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 특히 대량 spectrometric 분석 하거나 단백질의 phosphorylated 상태를 인식 하는 항 체를 사용 하 여 검색 됩니다. 그러나, 전 전략 때로는 적용할 수 없습니다 인 산화 특정 항 체를 만드는 어려움 때문에. 방사성 인산 염 세포의 신진 대사 라벨 인 산화 특정 항 체는 쉽게 사용할 수 때 인 산화의 생리 적 수준 검사 다른 옵션입니다. 그러나, 그것은 많은 양의 방사성 물질을 필요로 하 고 따라서 radioprotection14에 대 한 몇 가지 특수 장비를 포함 한다. 대량 spectrometric 분석은 더 민감한이 토론 방법에 비해 고 단백질 인 산화 분석에서 대중적 되었다. 그러나, 샘플 준비 시간 이다-소모, 그리고 비싼 악기는 분석을 위해 필요 합니다.
직접적인 생리 기판 LRRK2 대규모 phosphoproteomic 분석15의 결과에 따라 Rab10와 Rab8를 포함 하 여 랩 GTPase 가족의 부분 집합 최근에 알려졌다. 우리는 다음 Rab10 인 산화 FPD 돌연변이 마우스16를 쫓 고의 폐와 마우스 미 발달 섬유 아 세포에 의해 증가 되었다 설명 했다. 이 보고서에서 우리는 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)을 선택-P 태그 분자는 SDS 페이지 젤 (P 태그 SDS 페이지) 검색 Rab10 인 산화의 내 생 수준으로 공동 polymerized 메서드를 기반으로 때문에 phosphorylated Rab10에 대 한 특정 높게 과민 한 항 체는 여전히 부족 했다. 우리는 총 Rab8에 대 한 현재 사용할 수 있는 항 체의 가난한 선택으로 인해 생 Rab8의 인 산화를 감지 하지 못했습니다. 따라서, 우리는 Rab10 인 산화에 집중 하기로 결정 했다. LRRK2는 Thr73 높은 보존 "스위치" II 영역의 중간 위치에서 Rab10를 phosphorylates. Rab 단백질 중 인 산화 위치의 높은 보존 별개 Rab 단백질을 인식 하는 phosphospecific 항 체 확인 하기 어려운 이유 중 하나를 수 있습니다.
LRRK2에 의해 Rab8A의 인 산화 Rabin8, 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (GEF) GTP15바인딩된 GDP를 교환 하 여 Rab8A를 활성화의 바인딩을 억제. Rab10 및 Rab8A LRRK2에 의해의 인 산화는 또한 GDP 분리 억제제 (GDIs),이 Rab 단백질의 활성화에 필수적인 막15에서 GDP 바인딩된 Rab 단백질을 추출 하 여 바인딩을 억제. 그 랩으로 LRRK2 단백질의 인 산화에서에서 그들을 방지 활성화는 정확한 분자 메커니즘 및 생리 적인 결과 인 산화의 불분명 남아 있지만 가정은 했다.
P 태그 SDS 페이지 기노시타 외. 2006 년에 발명 했다:이 방법에서는, 아크릴은 covalently와 결합 하 여 P 태그, 캡처 SDS 페이지에 copolymerized 높은 선호도와 인산 염 분자 젤17. SDS 페이지 젤에서 P 태그 분자는 선택적으로 phosphorylated 단백질 전기 이동 기동성을 지체, 때문에 P 태그 SDS 페이지 phosphorylated 아닌 것 들 로부터 phosphorylated 단백질을 분리할 수 있습니다 (그림 1). 관심의 단백질은 여러 잔류물에 phosphorylated, 차동 phosphorylated 모양에 해당 하는 밴드의 사다리 관찰 됩니다. Rab10의 경우 우리는 Rab10 Thr73에만 phosphorylated는 나타내는 하나만 이동된 밴드를 관찰 합니다. 인 산화 특정 항 체와 immunoblotting P 태그 SDS 페이지의 주요 장점은 phosphorylated Rab10 immunoblotting 비 인 산화 특정 항 체 (즉, 인식 총 Rab10)와 의해 검출 될 수 있다 세포 막에 전송 되 고, 후는 일반적으로 더 민감한, 구체적이 고 사용할 수 있는 상업/학술 소스에서. P 태그 SDS 페이지를 사용 하 여의 또 다른 장점은 이다 그 하나 얻을 수 있다 인 산화를의 산출할의 대략적인 추정 인 산화 특정 항 체와 immunoblotting 또는 방사성을 가진 세포의 신진 대사 라벨는 불가능 인산 염입니다.
저렴 한 P 태그 아크릴 및 그것에 관련 된 몇 가지 사소한 수정 사용 떨어져 LRRK2 여 Rab10 인 산화의 검출에 대 한 현재 메서드 immunoblotting의 일반 프로토콜을 다음과 같습니다.따라서, 간단 하 고 쉽게 실행 immunoblotting은 평소 연습, 순화 된 단백질, 세포 lysates 조직 homogenates를 포함 하는 샘플의 어떤 종류와 어떤 실험실에서 이어야 한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31320-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-04245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4549</td>
			<td>Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium 
			(DMEM)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1560</td>
			<td>Heat-inactivated at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>342-01375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)</td>
			<td>PolySciences, Inc.</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>045-28335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RSP-THA500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-24751</td>
			<td>Equivalent to Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>346-01312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate(V)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-09752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>37174-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17103-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td>
			<td>Kokusan Chemical</td>
			<td>2113899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin-LR</td>
			<td>Wako</td>
			<td>136-12241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 &#176;C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31607-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>075-00616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>25099-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>056-06967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>136-01837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-binding tag acrylamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>AAL-107</td>
			<td>P-tag acrylamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% (w/v) acrylamide solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06119-45</td>
			<td>Acrylamide:Bis = 29:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>016-08021</td>
			<td>10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374, 1610373, 1610377</td>
			<td>Molecular weight marker used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III</td>
			<td>Wako</td>
			<td>230-02461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17109-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran NC 0.45</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600007</td>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Membrane Filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>GVHP00010</td>
			<td>PVDF membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Papers No.1</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>00013600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28322-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-00251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monolaurate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>345-01865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>232100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostar</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-55203</td>
			<td>ECL solution (Normal sensitivity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostar LD</td>
			<td>Wako</td>
			<td>290-69904</td>
			<td>ECL solution (High sensitivity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB staining solution</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB destaining solution</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11583816001</td>
			<td>Used at 0.2 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab10 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8127</td>
			<td>Used at 1:1000 for immunoblotting. 
			Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-pSer935 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133450</td>
			<td>Used at 1 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LRRK2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133518</td>
			<td>Used at 1 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used at 1 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Santa-Cruz</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>Used at 0.02 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>515-035-003</td>
			<td>Used at 0.16 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Used at 0.16 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK2578215A</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-13237</td>
			<td>Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLi-2</td>
			<td>Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee)</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA</td>
			<td>Provided by Dr Dario Alessi 
			(University of Dundee)</td>
			<td></td>
			<td>This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&#8211;1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&#8211;1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Forma Series II 3110 Water-Jacketed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Pipet-Aid PA-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P10</td>
			<td>Nichiryo</td>
			<td>00-NPX2-10</td>
			<td>0.5&#8211;10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P200</td>
			<td>Nichiryo</td>
			<td>00-NPX2-200</td>
			<td>20&#8211;200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P1000</td>
			<td>Nichiryo</td>
			<td>00-NPX2-1000</td>
			<td>100&#8211;1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for micropipette P10</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RST-481LCRST</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for micropipette P200</td>
			<td>FUKAEKASEI</td>
			<td>1201-705YS</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for micropipette P1000</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RST-4810BRST</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disporsable pipette</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>606180</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disporsable pipette</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607180</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL disporsable pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357535</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocytometer</td>
			<td>Sunlead Glass</td>
			<td>A126</td>
			<td>Improved Neubeuer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>For tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>3810-006</td>
			<td>For tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RSV-MTT1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>2323-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>2343-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuges</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655061</td>
			<td>Not for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M2e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#8211;PAGE tanks</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tanks</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel plates (notched)</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel plates (plain)</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon spacers</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-well combs</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder clips</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-05SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2138R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Station 1000 VC</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-8450</td>
			<td>Power supply for SDS&#8211;PAGE and transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large weighing boats</td>
			<td>Ina Optika</td>
			<td>AS-DL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic containers</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>PS CASE No.4</td>
			<td>10 x 80 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>Titech</td>
			<td>NR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene foam box</td>
			<td>generic</td>
			<td></td>
			<td>The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS-4000</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rab10 phosphorylation detection by lrrk2 activity using sds-page with a phosphate-binding tag

신 부유한 반복 키 2 (LRRK2)에 돌연변이 가족성 파 킨 슨 병 (FPD) 연결 될 표시 되었습니다. LRRK2의 키 니 아 제 활동의 비정상적인 활성화 PD의 병 인에 연루 되어, 이후 LRRK2의 키 니 아 제 활동의 생리 적인 수준을 평가 하는 방법을 확립 필수적입니다. 최근 연구는 LRRK2 랩 GTPase 가족, Rab10를 포함 하 여 생리 적 조건 하에서 phosphorylates 밝혔다. Immunoblotting에 대 한 현재 사용할 수 있는 인 산화 특정 항 체의 불 쌍 한 감도 때문에 의해 그것을 감지 하기 어려운 되었습니다 LRRK2 경작된 한 세포에 의해 내 생 Rab10의 인 산화는 질량 분석에 의해 검출 될 수, 있지만 Rab10입니다. 여기, 우리는 간단한 설명 LRRK2 여 Rab10 인 산화의 내 생 수준 감지 방식의 immunoblotting 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 인산 염-바인딩 태그 (태그 P)를 함께 활용 하 여 기반을 N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N',N'-트리 스 (pyridin-2-yl-메 틸)-1, 3-diaminopropan-2-올. 현재 프로토콜 P 태그를 활용 하는 방법의 예제를 제공 뿐만 아니라 또한 어떻게 돌연변이 억제 물 치료/관리 또는 어떤 다른 요인 든 지의 세포와 조직에 LRRK2 하류 신호을 변경의 평가 가능 하 게 .

Overexpression 시스템: 하-Rab10 3의 인 산화 × 플래그 LRRK2 HEK293에 셀:
HEK293 세포 0.266 µ g의 HA Rab10 야생-타입 및 1.066 µ g 3 × 플래그 LRRK2 (야생-타입, 니 비활성 돌연변이 (K1906M), 또는 FPD 돌연변이)와 페 했다. Rab10 인 산화는 P 태그 SDS 페이지 immunoblotting 안티를 사용 하 여 다음에 의해 시험 되었다-하 항 체 (그림 2). 10 µ g 단백질의 포함 된 50 µ M P 태그 아크릴 100 µ M MnCl210% 젤 (80 x 100 x 1 m m)에 실행 되었다. P-태그 젤 (맨 위 패널)에 대 한 노출 시간이 10 s 표준 ECL 솔루션을 사용 하 여. LRRK2 Rab10와의 공동 overexpression에 P 태그 젤 밴드 변화 발생 (상단 패널에 열린 원으로 표시, 차선 2와 4를 비교 하 여). 반면, 니 비활성 돌연변이와 공동 식 (K1906M) LRRK2 Rab10의 이동성을 변경 하려면 실패 (비교 레인 4와 5), 밴드 LRRK2 키 니 아 제 활동 때문입니다 나타냅니다. 밴드 shift는 모든 FPD 돌연변이 (레인 4와 6-13 비교) 이전 보고서15계약에 의해 증가 되었다.
LRRK2 경작된 한 세포에 의해 Rab10의 인 산화 내 생 시스템::
마우스 스위스 3T3 흰둥이 배아 섬유 아 세포 세포 또는 1 h (그림 3A)에 대 한 1 µ M의 최종 농도에 LRRK2 억제제 (GSK2578215A)20 없이 치료 했다. 인간의 폐 암 A549 세포 치료와 함께 또는 없이 10의 최종 농도에 다른 LRRK2 억제제 (MLi-2)21 1 h (그림 3B) nM. 내 생 LRRK2 여 생 Rab10 인 산화는 P 태그 SDS 페이지 뒤에 안티-Rab10 항 체와 immunoblotting에 의해 시험 되었다. 30 µ g 단백질의 10% 젤 (100 x 100 x 1 m m 알 비 노 스위스 3T3 세포)와 80 m m A549 세포 포함 50 µ M P 태그 아크릴 및 100 µ M MnCl2에서 실행 했다. 그림 3A 와 그림 3B 에서 P 태그 젤 (맨 위 패널)에 대 한 노출을 3 분 되었고 90 s, 각각. 해당 phosphorylated 생 Rab10 하 밴드 변화 관찰 되었다 GSK2578215A 또는 MLi-2 셀의 처리에 따라 사라진는 P 태그 젤 (상단 패널; 비교 레인 1-2 및 3-4에 열린 원으로 표시)에. LRRK2 억제제의 효능 immunoblotting 안티 pSer935 LRRK2 항 체 (아래에서 세 번째 패널), 셀22LRRK2 억제의 잘 설립 된 판독은을 사용 하 여 유효성을 검사 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig1.jpg"> 
그림 1입니다. P-태그 SDS-페이지의 도식 묘사. Phosphorylated (빨간색 원)와 비 phosphorylated (파란색 동그라미) 단백질 (예, Rab10)의 혼합물을 실행 하면 젤을 통해 P 태그 아크릴은 공동 polymerized 유일한 phosphorylated 단백질의 이동성 때문에 강한 억제 (화살표를 깨진) P 태그 분자와 phosphorylated 단백질의 상호 작용. Rab10 Rab10는 LRRK2 단일 잔류물 Thr73에에 phosphorylated 됩니다, 이후 두 밴드 실행: 최고 밴드 phosphorylated Rab10 나타내고 하단 밴드 phosphorylated 비 Rab10. 셀 LRRK2 억제제로 치료는, 상위 밴드를 사라지게 한다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig2.jpg"> 
그림 2입니다. P-태그 오의 대표적인 결과: overexpression 시스템. 상단 패널 표시 안티를 사용 하 여 P-태그 오-하 항 체, phosphorylated 및 비 phosphorylated Rab10으로 표시 됩니다 (○) 열고, 동그라미 (●)를 각각 폐쇄. P-태그 오 점 아래에 표시 된 패널은 안티를 사용 하 여 정상적인 SDS 페이지 젤에 immunoblots-하, 안티, 안티-α-tubulin, 깃발과 안티 GAPDH 항 체. 하 오와 플래그 오 하-Rab10 및 3xFLAG-LRRK2 overexpression를 각각 보장에 대 한 표시 됩니다. Α-tubulin 그리고 GAPDH도 말 동등한 로드를 보장에 대 한 표시 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig3.jpg"> 
그림 3입니다. P-태그 오의 대표적인 결과: 내 인 성 시스템. 두 셀 라인, 즉 (A) 알 비 노 스위스 3T3 세포 및 (B) A549 세포, 사용 되었다. 두 인물에서 가기 패널 P 태그 지우고 안티-Rab10 항 체, phosphorylated 및 비 phosphorylated 생 Rab10 오픈 (○)로 표시 되어 및 폐쇄 (●) 원형, 각각을 사용 하 여 보여줍니다. P-태그 오 점 아래 패널 안티 Rab10, 안티 pSer935 LRRK2, 안티-LRRK2, 및 안티-α-tubulin 항 체를 사용 하 여 정상적인 SDS 페이지 젤에 immunoblots 있습니다. Rab10와 LRRK2 샘플, 사이 생 Rab10 고 LRRK2 비슷한 표현을 각각 보장에 대 한 표시 됩니다. PSer935 LRRK2 오 점 보장에 대 한 표시는 그 GSK2578215A (A)와 MLi-2 (B) 예상 대로 작동. Α-tubulin 오 점 동등한 로드를 보장에 대 한 표시 됩니다. 고분자 중량 표시와 함께 겹쳐 P 태그도 말의 이미지는 그림 S4에 표시 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그림 S1입니다. 플라스 미드의 DNA 시퀀스. 하 하-Rab10/pcDNA5 FRT와 3 × 플래그-LRRK2/p3 × 플래그-CMV-10의 인코딩 플라스 미드의 DNA 시퀀스. 이 프로토콜에 사용 되는 모든 플라스 미드 요청 시 저자에서 사용할 수 있습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S1.pdf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그림의 S2 P-태그 SDS 페이지의 최적화의 예. 그림 3A 에서 사용 되는 샘플의 동일한 집합 P 태그 SDS 페이지를 최적화 하는 데 사용 되었다. 그림에서와 같이 4 개의 다른 조건은 테스트 되었습니다. Phosphorylated 및 비 phosphorylated Rab10에 해당 하는 밴드 견고 하 고 파선 선 사각형을 각각 강조 표시 됩니다.이 실험을 바탕으로, 10% 아크릴, 50 µ M P 태그 아크릴, 100 µ M MnCl2 와 조건 두 젤 중간 찾기 두 밴드의 최고의 분리를 했다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S2.tif">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그림의 S3 분자량 마커의 마이그레이션 패턴의 비교. 일반 SDS 페이지 젤 (왼쪽된 패널) 또는 P 태그 SDS 페이지 젤 (중간 패널), 분자량 마커 (MWM) 실행 하 고는 젤은 스테인드 Coomassie 얼룩에 의해. 오른쪽 패널에 phosphorylated 및 비 phosphorylated Rab10의 위치를 표시 하려면 가운데 패널으로 동일한 P 태그 SDS 페이지 젤 그림 2 (4, 5 레인)에서 사용 하는 샘플의 immunoblot을 보여줍니다. 화살촉은 immunoblot의 오른쪽에 P 태그 SDS 페이지 젤에 MWM 중 하나의 위치를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S3.tif">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그림 S4입니다. P-태그 SDS 페이지 젤에 분자량 마커의 위치. 그림 3A 와 그림 3B 에 사용 하는 세포 막의 디지털된 이미지 (A)로 표시 되 고(B), 각각. 그림 3 에 표시 된 immunoblots 분자량 마커 (MWM)의 상대 위치를 겹쳐 있다. MWM는 세포 막에 잘 전송 하지 않았다 하지만 그림 S3 에 마커 (화살촉) 희미하게 그러나 지속적으로 관찰 되었다. MWM의 위치는 점선으로 표시 됩니다. 참고는 MWM 및 관심의 차선 사이 숫자에 없는 차선 밖으로 교차. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S4.tif">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

현재 연구 신 부유한 반복 키 2 Rab10 인 산화의 내 생 레벨을 탐지 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

rab10-phosphorylation-detection-lrrk2-activity-using-sds-page-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.8K 조회수.  The University of Tokyo. 현재 연구 신 부유한 반복 키 2 Rab10 인 산화의 내 생 레벨을 탐지 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

비디오: Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

연구

생화학

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom body (MB) is a higher brain center proposed to be the neural substrate of complex honeybee behaviors. Although previous studies identified genes and proteins that are differentially expressed in the MBs and other brain regions, the activities of the proteins in each region are not yet fully understood. To reveal the functions of these proteins in the brain, pharmacologic analysis is a feasible approach, but it is first necessary to confirm that pharmacologic manipulations indeed alter the protein activity in these brain regions.
We previously identified a higher expression of genes encoding phospholipase C (PLC) in the MBs than in other brain regions, and pharmacologically assessed the involvement of PLC in honeybee behavior. In that study, we biochemically tested two pharmacologic agents and confirmed that they decreased PLC activity in the MBs and other brain regions. Here, we present a detailed description of how to detect PLC activity in honeybee brain homogenate. In this assay system, homogenates derived from different brain regions are reacted with a synthetic fluorogenic substrate, and fluorescence resulting from PLC activity is quantified and compared between brain regions. We also describe our evaluation of the inhibitory effects of certain drugs on PLC activity using the same system. Although this system is likely affected by other endogenous fluorescence compounds and/or the absorbance of the assay components and tissues, the measurement of PLC activity using this system is safer and easier than that using the traditional assay, which requires radiolabeled substrates. The simple procedure and manipulations allow us to examine PLC activity in the brains and other tissues of honeybees involved in different social tasks.

To test the inhibitory effects of pharmacologic agents on phospholipase C (PLC) in different regions of the honeybee brain, we present a biochemical assay to measure PLC activity in those regions. This assay could be useful for comparing PLC activity among tissues, as well as among bees exhibiting different behaviors.

꿀벌에서 두뇌 Homogenate에서 Phospholipase C 활동의 탐지

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

탭 태그를 사용 하 여 엽록체 Translocon 단백질 복합물의 친 화력 정화

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.