Name: dna polymerase activity assay using near-infrared fluorescent labeled dna visualized by acrylamide gel electrophoresis
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
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이 작품은 과학 발전 (Cottrell 대학 학술 상 #22548)에 대 한 연구 corporation 및 TriLink 바이오 (ResearchReward 그랜트 #G139)에 의해 지원 되었다.

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	<li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+DNA+polymerase,+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide.">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li><li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+polymerase+evolution.">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li><li>Leconte, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus.">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li><li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+of+DNA+polymerase+I+(Klenow+fragment)+with+reduced+fidelity.">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li><li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics.">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235 (2016).</li><li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2'-5'+Linkages.">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 M-DNA의 DNA 중 합 효소 중재 합성 특성 분석 결과 설명 했습니다. 근처-적외선 레이블이 DNA 뇌관을 사용 하 여 다르게 크기 oligonucleotides 해결 하려면 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 합성의 정확한 측정을 사용 oligonucleotides, 단일 뉴클레오티드 해상도 얻을 수 있습니다 우리. 이러한 접근 하거나 효소 (섹션 2.1)의 전반적인 활동을 측정 하거나 개별 단계 (다음 단계 2.1 참고)의 Michaelis-Menten 매개 변수를 측정에 사용할 수 있습니다. 연구소는 최근 사용이 둘 다 이전 진화 효소9 특성으로 효소10를 합리적으로 설계.
여기에 설명 된 우리의 분석 비 방사성 DNA 라벨의 그들의 사용에서 이전 방법에서 차이가 있습니다. 역사적으로, 방사능 방사성 인 라벨11,18를 사용 하 여 얻을 수 있는 높은 감도 때문에 DNA 합성을 추적 하기 위해 사용 되었습니다. 불행 하 게도, 처리의 높은 비용 뿐만 아니라 방사성 라벨의 한정 된 수명 만들 수 있습니다 방사성 상표 사용 금지. 여기, 우리는 근처-적외선 fluorophore 이러한 단점에서 고통을 하지 않는 DNA 분류를 사용 하 여를 설명 합니다. 특히, 근 적외선 형광 염료와 우리 방사성 레이블이 DNA (게시 되지 않은 결과)에 비슷한 검색 제한 참조. 그러나, 눈에 보이는 범위에서 형광 염료, 우리 수 없었습니다 비슷한 검출 한계 (게시 되지 않은 결과)를 관찰 하. 우리의 그룹은 일반적으로 근처-적외선 fluorophores 베어링 상업적으로 준비 된 DNA를 사용, 이러한 염료 설립 후 종합 5' 수정 화학이이 라벨을 설치 하는 데 사용할 수의 숫자와 호환 됩니다.
근 적외선 형광 염료는 또한 유리한 단일 실험에서 두 개의 레이블된 oligonucleotides의 합성을 모니터링 하는 보다 복잡 한 실험을 설정할 수 있습니다 여러 상용 색깔이 있다. 방사성 레이블 multicomponent 실험의이 종류는 쉽게 실행 되지 않습니다. 이 가능성이 더 복잡 한 실험, 특히 직교 복제 실험에 대 한 수가 있게 된다.
이 분석 결과 및 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 분석 하는 모든 결과 전기 이동 법, 낮은 처리량 제한 크기 범위에서 관찰 되는 이러한 실험의 실행 기술적인도 전에 의해 주로 제한 됩니다. 단일 뉴클레오티드 해상도입니다. 이 상세한 프로토콜 이러한 분석 실험의 기술적 과제를 극복 하기 위해 그룹을 사용 하겠습니다. 특히, 분석 결과의 처리량을 제한 하는 동안 근 적외선 형광 라벨의 사용은 증가 시킨다 처리량는 autoradiograph를 개발 하는 사용자를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 젤은 여전히 약 4-6 h 설정 하 고 실행, 하루 실행 될 수 있는 실험의 수를 제한 걸립니다. 제한 된 범위는 polyacrylamide 전기 이동 기능에 의해 발생 합니다. 이러한 제한은 실질적으로 말하기,이 분석 실험은 단일 뉴클레오티드 해상도 요구 하는 집중된 연구 질문에 대 한 최고의 의미.
최근, 높은 처리량 DNA 시퀀싱19 DNA polymerases20,21을 특성화 하는 방법으로 점점 사용 되었습니다. 이 분석 실험은 시퀀스 편견과 오류 스펙트럼에 초점을 맞춘 광범위 한 질문을 가능 하 게 그들의 극적으로 증가 된 처리량에 대 한 주목할 만하다. 중요 한 것은, 높은 처리량 시퀀싱 많은 병렬 실험을 설정할 수 있습니다, 하는 동안 그것은 단일 뉴클레오티드 기준 해석 하 도전적 될 수 있다. 이이 문서에서 설명 하는 방법와 서 몇 년 동안 관련 되도록 높은 처리량 연속 격차에 채우기 위해 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 채용 하는 효소 분석 실험에 대 한 흥미로운 기회를 제공 한다.

DNA polymerases 정확 하 고 효율적인 DNA 합성을 수행 하 고 게놈 무결성을 유지 하기 위해 필수적입니다. 오류 없이 수백 초 당 뉴클레오티드를 합성 하는 능력 또한 분자 생물학 및 생명 공학에서 DNA polymerases 필수 도구를 만든다. 그러나, 이러한 속성은 또한 M-DNA 기판;에 대 한 응용 프로그램 제한 일반적으로 말하자면, 자연 DNA polymerases 수 없습니다 음성 합성 많은 잠재적으로 귀중 한 M-DNA 기판, 가능성이 인해 비표준 기판에 vivo에서를 사용 하 여에 대 한 높은 선택적 압력에. 많은 그룹 돌연변이 DNA polymerases M-DNA 합성1,2,3,,45;의 생성을 지시 진화 접근을 개발 했습니다. 이러한 노력은 DNA6,,78의 바이오 유틸리티를 확장 했습니다.
M-DNA 합성 돌연변이 DNA polymerases의 능력을 평가 하기 위해 우리9,10, 등11,,1213 일반적으로 사용 하는 DNA의 생체 외에서 측정 중 합 효소 활동이이 원고에 설명 되어 있습니다. 이 실험에서 DNA polymerases는 공동 incubated 레이블이 뇌관/템플릿을 이중와 nucleoside 3 인산 염 기판; 제품 젤 전기 이동 법에 의해 평가 됩니다. 특정 실험적인 질문, 돌연변이 DNA polymerases, 수정된 뇌관, 수정 된 서식 파일 또는 수정 된 nucleoside 된 사용할 수 있습니다, 활성화 돌연변이 효소 활동의 체계적인 생 화 확 적인 평가.
역사적으로, 이러한 분석 추적 DNA 합성; 5' 방사성 라벨에 의존 가장 일반적으로, P 32 33P 사용 되었습니다; 일반적으로, 라벨 이루어집니다 T4 polynucleotide 키 니 아 제11를 사용 하 여. 그러나, 유한 수명 및 방사성 레이블 및 그들의 안전한 처리의 상대적으로 높은 비용, 우리의 그룹은 합성 5' 근처-적외선 fluorophore DNA를 표시 대신 사용 합니다. 상대적으로 저렴 한 비용 근처-적외선 젤 영상을 사용 하 여, 우리는 비슷한 검출 한계가 방사성 레이블 (게시 되지 않은 결과)를 사용 하 여 이전 연구 관찰. 우리는 성공적으로 관측9, 과거 복제 하 고 우리가 하지 이전 측정된 속도 상수 (게시 되지 않은 결과)와 어떤 큰 양적 차이 관찰 했다.
DNA의 크기 및 따라서, DNA 종합의 정도 분석 하려면 우리는 생어 시퀀싱14 모 세관 전기 이동 법15의 도래 하기 전에 원래 개발 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 방법에 의존. 분리 또는 거리; 분자량의 측정으로 사용할 수 있습니다. 대형, 수직 polyacrylamide 젤 단일 뉴클레오티드 해상도, 다양 한 길이의 DNA oligonucleotides의 양적 관찰 가능 얻을 수 있습니다.
샨 다, 이러한 실험은 중 합 효소 특성에 대 한 강력한 방법입니다. 시간으로 인해 민감한 반응, 준비 및 관리의 재현성 결과 얻을 필요가 있다. 또한, 아크릴 아 미드 젤은 DNA 합성, 수많은 다른 DNA 수정 반응, 단일 뉴클레오티드 해상도 측정 하는 매우 효과적인 방법 그것은 기술적으로 도전 수 것 이다. 잘하면 여기 프로토콜 가장 일반적인 실수를 피하고 있는 동안이 실험을 수행 하려면 사용자가 하면 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetylated BSA</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (i.e. DTT)</td><td>Research Products International</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution)</td><td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (riboNTPs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (all other modified NTPs)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>assorted</td><td></td></tr><tr><td>primer 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Custom Syntheses</td><td>We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5&amp;rsquo;-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>template 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Custom Syntheses</td><td>We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5&amp;rsquo;-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Research Products International</td><td>A11405</td><td>38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide</td></tr><tr><td>Tris/Borate/EDTA (TBE) solid</td><td>Research Products International</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>Urea ultrapure</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>Gel tape</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>Large white spring clamp polypropylene</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm spacers</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 Notched Glass Plate Set</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>Wedge plate separator</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>Comb for gel electrophoresis</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis rig</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water</td><td></td><td></td><td>we use a Milli-Q system from Millipore</td></tr><tr><td>DNA polymerases</td><td></td><td></td><td>we prepare these in our laboratory using published protocols.</td></tr></tbody></table>

dna polymerase activity assay using near-infrared fluorescent labeled dna visualized by acrylamide gel electrophoresis

어떤 효소에 대 한 강력 하 고, 양적 메서드는 네이티브와 조작 효소의 특성에 대 한 필요. DNA polymerases에 대 한 DNA 합성 생체 외에서 DNA 종합 분석 결과 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 뒤를 사용 하 여 특징 수 있습니다. 이 분석 결과의 목표 자연 DNA와 수정된 DNA (M-DNA)의 합성을 계량 하는 것입니다. 이러한 접근은 oligonucleotides 단일 뉴클레오티드 분해능, 효소 oligonucleotide 종합 동안 관찰의 개별 단계 사용을 해결 하는 데 특히 유용 합니다. 이러한 메서드는 생화학 및 생물 DNA 종합의 개별 단계, DNA 종합 그리고 DNA 바인딩 선호도의 오류율의 정상 속도 상수 측정 등 속성의 평가에 적용 되었습니다. 사용 하 여 구성 (NTP), M-DNA, 또는 돌연변이 DNA polymerases, 쌍을 효과적으로 평가 수 있는 기판-DNA 중 합 효소의 상대적 유틸리티 포함 하 되이 제한 되지 않고, 수정된 nucleoside 된 수정. 여기, 우리가 분석 결과 자체, 전례 없던 뇌관 DNA 라벨 근처-적외선 붙일 DNA 라는 등 전략에 맞게 만들 수 있어야 합니다 변경 내용을 포함 하 여 선발. 또한, 우리 쏟아져 아크릴 아 미드 젤에 대 한 중요 한 기술 단계 상세는 하 고 실행 하 고, 종종 수 있는 기술적으로 도전.

안정-상태 활동 (섹션 2.1, 그림 2의 결론에서 참고에서 설명)와 (섹션 2.1, 그림 1에 설명 된) 전체 활동의 질적 특성의 성공적인 polyacrylamide 젤 분석 표시 됩니다. 실패 polyacrylamide 젤 분석 (그림 3) 표시 됩니다.
참고 아무 상업적으로 사용할 수 있는 사다리 또는 분자 마커 사용 됩니다. 때때로,를 사용 하 여 알려진된 중 합 효소-기질 조합을 만드는 분자 마커; 그러나, 다른 수정된 뉴클레오티드 매우 다른 전기 이동 mobilities, 부적절 한 길이가 동일 하지만 서로 다른 염기 구조 oligonucleotides의 비교를 만들기가 중요 하다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56228/56228fig1.jpg"> 
그림 1: 전체 활동의 질적 특성의 성공적인 polyacrylamide 젤 분석의 예. 참고 개별 밴드는 잘 정의 되 고 일반. 밴드 대표 oligonucleotides의 서로 다른 길이; 이 젤 쉬운 비교를 polymerases 수 있습니다. 없는 효소 제어 차선 표시 됩니다 있는 "-". 활동은 제품의 두 길이 및 더 큰 제품으로 변환 되는 레이블이 뇌관의 부분에 의해 재판 된다. 이 분석에서 E6 및 e 5는 가장 활발. E 3와 e 2는 약 활동에서 동일 하지만 E6 또는 E5, 보다 적게 고 E4 및 e 1은 최소한 활성 효소.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56228/56228fig2.jpg"> 
그림 2: 정상 상태 활동을 사용 하 여 정량 분석에 대 한 성공적인 젤의 예. 밴드는 잘 해결 하 고 잘 정의 된 note. Oligonucleotide 종합에서 개별 단계의 정상 속도 상수를 측정 하는 효소 (이 경우에 dCTP); nucleoside 3 인산 염의 다양 한 양으로 incubated 참고만 n (n + 1) 제품 사용 단 수 이벤트의 정량화 합성 됩니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56228/56228fig3.jpg"> 
그림 3: 전반적인 활동에 대 한 실패 한 젤의 예. 젤 밴드에 표시 간격의 결과로 처리 하는 동안 찢 어 졌다. 젤 밴드는 불규칙 모양, 정량화 그리고 분석을 어렵게 하는 참고.

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DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

dna-polymerase-activity-assay-using-near-infrared-fluorescent-labeled

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.1K 조회수.  W.M. Keck Science Department of Claremont Mckenna, Pitzer, and Scripps College. 이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

비디오: DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

연구

생화학

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the formation of a colored precipitate. It works by soaking the acrylamide or agarose DNA gel in a solution of 1x (equivalent to 2.0 &#181;M) SYBR Green I (SG I) and 0.20 mM nitro blue tetrazolium that produces a purple precipitate of formazan when exposed to sunlight or specifically blue light. Also, DNA recovery tests were performed using an ampicillin resistant plasmid in an agarose gel stained with our method. A larger number of colonies was obtained with our method than with traditional staining using SG I with ultraviolet illumination. The described method is fast, specific, and non-toxic for DNA detection, allowing visualization of biomolecules to the "naked eye" without a transilluminator, and is inexpensive and appropriate for field use. For these reasons, our new DNA staining method has potential benefits to both research and industry.

This method allows selective staining and quantification of DNA in gels by soaking the gel in a SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium solution and then exposing it to sunlight or a blue light source. This produces a visible precipitate and requires almost no equipment, making it ideal for field use.

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Nanoluciferase Reporter Assay를 사용한 DNA Double Strand Break Repair 정량화

Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

The repair of DNA double strand breaks (DSBs) is crucial for the maintenance of genome stability and cell viability. DSB repair (DSBR) in cells is mediated through several mechanisms: homologous recombination (HR), non-homologous end joining (NHEJ), microhomology-mediated end joining (MMEJ), and single strand annealing (SSA). Cellular assays are essential to measure the proficiency and modulation of these pathways in response to various stimuli.
Here, we present a suite of extrachromosomal reporter assays that each measure the reconstitution of a nanoluciferase reporter gene by one of the four major DSBR pathways in cells. Upon transient transfection into cells of interest, repair of pathway-specific reporter substrates can be measured in under 24 h by the detection of Nanoluciferase (NanoLuc) luminescence.
These robust assays are quantitative, sensitive, titratable, and amenable to a high-throughput screening format. These properties provide broad applications in DNA repair research and drug discovery, complementing the currently available toolkit of cellular DSBR assays.

저자 스포트라이트: DNA 손상 반응을 표적으로 하는 새로운 항암 치료제 개발

We present protocols for the assessment of double strand break repair pathway proficiency in cells using a suite of luminescence-based extrachromosomal reporter substrates.

고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가

The repair of DNA double strand breaks (DSBs) is crucial for the maintenance of genome stability and cell viability. DSB repair (DSBR) in cells is ...

암 연구학

<meta charset="utf8"></head><body>판별 RNA 및 DNA 분석을 위한 정밀 DNAzyme 나노머신

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: DNA 나노센서의 발전 – 분자 검출의 감도 및 선택성 문제 해결

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 DNA 효소 분석

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

저자 스포트라이트: DNA 복구 및 복제를 이해하기 위해 극한 생물 및 일반적인 병원체의 새로운 효소 특성화

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

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적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가

고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가

고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용