Agradecemos o Dr. Takeshi Iwatsubo (Universidade de Tóquio, Japão) por gentilmente fornecendo os plasmídeos codificação 3xFLAG-LRRK2 WT e mutantes. Agradecemos também o Dr. Dario Alessi (Universidade de Dundee, Reino Unido) para fornecer gentilmente MLi-2 e o plasmídeo codificação HA-Rab10. Este trabalho foi apoiado pela sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) KAKENHI Grant número JP17K08265 (G.I.).

<ol>
	<li>Sveinbjornsdottir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+symptoms+of+Parkinson's+disease.">The clinical symptoms of Parkinson's disease.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).</li><li>Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+in+Parkinson+disease:+Mendelian+versus+non-Mendelian+inheritance.">Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).</li><li>Pais&#225;n-Ru&#237;z, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li><li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li><li>Gilks, W. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+LRRK2+expression+points+to+a+functional+role+in+human+monocyte+maturation.">Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation.</a> PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um método robusto e fácil de detectar a fosforilação de Rab10 por LRRK2 níveis endógenos com base na metodologia do P-marca. Porque o anticorpo atualmente disponível contra fosforilada Rab10 só funciona com proteínas Blumental15, o presente método utilizando P-marca SDS-PAGE é a única maneira de avaliar os níveis endógenos de fosforilação Rab10. Além disso, o presente método permite a estimativa da estequiometria da fosforilação de Rab10 nas células. Porque a metodologia de P-marca é genericamente aplicável a fosfo-proteínas, o presente protocolo pode ser um "protótipo" para o estabelecimento de métodos semelhantes para outros phospho-proteins.
Passos críticos no protocolo são géis de fundição e preparação de amostras. P-marca acrilamida é um reagente relativamente foto-labile e a capacidade de retardar a mobilidade eletroforética de proteínas fosforiladas às vezes é perdida após o armazenamento a longo prazo a 4 ° C. Pesquisadores devem tomar todos os cuidados para evitar a exposição do acrilamido P-marca à luz. Além disso, a molécula de P-marca precisa formar um complexo com íons de Mn2 + para capturar fosfatos. Assim, as amostras não devem conter agentes quelantes como o EDTA, que são componentes usuais de buffers de amostra de SDS-PAGE comercialmente disponíveis. Nós recomendamos usar o amortecedor da amostra do Laemmli a clássica para preparar amostras para P-marca SDS-PAGE.
Outro ponto crítico é otimizar completamente a concentração de acrilamida, P-marca acrilamida e MnCl2 a mistura de gel de separação (Figura S2). As distâncias de migração das bandas fosforiladas e não-fosforilada variam de acordo com os reagentes utilizados (monte, pureza, etc.), e otimização das concentrações adequadas testando vários diferentes concentrações em combinação é obrigatório (por exemplo, P-marca de acrilamida (25, 50, 75 µM), MnCl2 (1:2 ou 1:3 razão molar de acrilamida P-marca) e do acrilamido (7,5, 10, 12,5%)). As bandas fosforiladas e não-fosforilada devem aparecer no meio do gel e bem separaram umas das outras. Para o processo de otimização, é recomendável usar Rab10 Blumental, porque a banda deslocada é facilmente detectável. Os autores podem fornecer amostras de controle para este protocolo.
Uma das maiores confusões que este protocolo pode causar será devido à diferença dos padrões de migração do MWM entre normal e geles de SDS-PAGE de P-marca. Como mostrado na Figura S3, os padrões de migração do MWM na regular e géis P-marca SDS-PAGE (ambos 10%) são muito diferentes e um não pode usar o MWM para estimar o peso molecular das proteínas em geles de SDS-PAGE de P-marca. No entanto, em geles de SDS-PAGE de P-marca, um do MWM destaca-se, migrando para o meio do gel (ponta de seta na Figura S3), que é consistentemente observado entre os géis (ver Figura S4). Este MWM sempre migra entre as bandas de Rab10 fosforilada e não-fosforilada. Portanto, este marcador é útil não só para garantir que o P-marca SDS-PAGE funciona antes da transferência, mas também como um marco por ter uma sensação áspera de onde as bandas de fosforilada e não-fosforilada Rab10 vão ser vistas.
Para detecção de bandas na immunoblots, nós usamos um Imageador equipado com uma câmera CCD refrigerada (ver Tabela de materiais), bem como um raio-x convencional filme sistema em desenvolvimento e encontraram que ambos os sistemas funcionam bem. Para detecção de níveis endógenos de fosforilação de Rab10 em culturas de células, é necessário utilizar linhas celulares que têm níveis de alta expressão de LRRK2 endógenos, tais como fibroblasto embrionário de rato (primária ou cultivadas ou imortalizado (linhas de célula 3T3-Swiss albino, etc.)) e células de A549 de derivado de carcinoma de pulmão humano. Para a detecção de níveis endógenos de fosforilação de Rab10 em tecidos de rato, é recomendável usar o pulmão16.
A quantificação da fosforilação de Rab10 não é além do habitual immunoblotting. Se a estequiometria da fosforilação de Rab10 é muito baixa (como mostrado na Figura 3), a intensidade da banda não-fosforilada (marcada com um círculo fechado) tende a ser muito acima do nível de saturação, fazendo com que a determinação precisa da estequiometria impossível. Não obstante, estimativa qualitativa ainda é possível em qualquer caso, o que não é alcançável sem usar o método presente. Uma vez que a detecção da fosforilação de Rab10 endógena exige exposição prolongada, tende a haver algumas bandas inespecíficas aparecendo na P-marca borre mesmo que o anticorpo anti-Rab10, usado no presente protocolo dá immunoblots razoavelmente limpa para utilização normal . Para distinguir proteínas fosforiladas de bandas inespecíficas, é fundamental usar um controle inibidor-tratamento, em que bandas fosforiladas, mas bandas não inespecíficas, devem desaparecer. LRRK2 fosforila Rab8 além de Rab1015, e nós bem sucedida do presente protocolo para Rab8A também (dados não mostrados). O presente protocolo potencialmente pode ser usado para examinar a fosforilação de qualquer proteínas, embora possa haver dificuldades técnicas se a proteína é grande (&#62; 100 kDa) ou multiplicar fosforilada. Porque Rab10 é uma pequena proteína (25 kDa) e isoladamente phosphorylated em Thr73 por LRRK2, o resultado de P-marca SDS-PAGE é simples, onde apenas uma banda deslocada é observada.
Num futuro próximo, será fundamental para estabelecer o método para detectar quantitativamente a atividade da quinase de LRRK2 em amostras de paciente-derivado de uma forma de alto rendimento para avaliar a alteração da atividade da quinase de LRRK2 em pacientes com DP, bem como na avaliação o efeito de drogas na LRRK2 em ensaios clínicos. Desde sangue periférico humano células mononucleares (PBMC) expressam níveis relativamente elevados de endógena LRRK223, PBMCs ou mais células isoladas de sangue será vale a pena testar para phosphorylation endógeno de Rab10. O presente método irá não só ser útil na investigação da biologia básica do LRRK2 via de sinalização, mas também ajuda na obtenção de um prova de conceito básico para decidir qual amostra em amostras de paciente-derivado deve ser analisado em tais estudos em grande escala.

PD é uma das mais comuns doenças neurodegenerativas, predominantemente, afetando os neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo, resultando em disfunção dos sistemas de motor em idosos1. Enquanto a maioria dos pacientes desenvolvem PD de forma esporádica, há famílias herdar a doença. Mutações em vários genes foram encontradas para ser ligado com FPD2. Um dos genes causadores de FPD é LRRK2, em que oito mutações missense (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S e I2020T), ligadas a um FPD predominantemente hereditária chamada PARK8 até agora têm sido relatados3,4,5. Vários estudos de associação de genoma-larga (GWAS) de pacientes com DP esporádicos também identificaram variações genômicas no locus LRRK2 como um fator de risco para a polícia, sugerindo que a anormalidade na função do LRRK2 é uma causa comum de neurodegeneração em ambos os casos esporádicos e PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 é uma proteína grande (2.527 aminoácidos), consistindo de um domínio de repetição rico em leucina, um Ras-GTP-vinculação do domínio de proteínas complexas (ROC), um C-terminal do domínio, um domínio da quinase serina/treonina proteína e um domínio de WD409ROC (CR). As oito mutações FPD localizar estes domínios funcionais; N1437H e R1441C/G/H/S no domínio do ROC, Y1699C no domínio do CR, G2019S e I2020T no domínio de cinase. Desde que a mutação G2019S, que é o mais frequentemente encontrada mutação em PD pacientes10,11,12, aumenta a atividade da quinase de LRRK2 por 2-3 vezes em vitro13, supor que o aumento anormal da fosforilação de LRRK2 substrate(s) é tóxico para os neurônios. No entanto, tem sido impossível estudar se a fosforilação de substratos LRRK2 fisiologicamente relevantes é alterada em pacientes com DP familiar/esporádicas devido à falta de métodos para avaliá-lo em amostras derivadas de pacientes.
Fosforilação de proteínas é geralmente detectada pelo immunoblotting ou ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando anticorpos especificamente, reconhecendo o estado fosforilado de proteínas ou por análise de espectrometria de massa. No entanto, a estratégia anterior às vezes não pode ser aplicada devido às dificuldades em criar anticorpos específicos de fosforilação. Etiquetando metabólica das células com fosfato radioativo é outra opção para examinar os níveis fisiológicos de fosforilação quando anticorpos específicos fosforilação não estão prontamente disponíveis. No entanto, ele requer uma grande quantidade de materiais radioativos e, portanto, envolve alguns equipamentos especializados para protecção contra as radiações14. Análise de espectrometria de massa é mais sensível em relação a esses métodos imunoquímicos e tornou-se popular na análise de fosforilação de proteínas. No entanto, a preparação da amostra é demorada e caros instrumentos são necessários para a análise.
Um subconjunto da família Rab GTPase, incluindo Rab10 e Rab8 foi relatado recentemente como substratos fisiológicos diretos para LRRK2 com base no resultado de uma análise de phosphoproteomic em grande escala15. Em seguida demonstramos que a fosforilação de Rab10 foi aumentada por mutações FPD em fibroblastos embrionários de rato e nos pulmões de ratos16de knockin. Neste relatório, nós escolhemos a empregar uma eletroforese em gel de poliacrilamida sódio Dodecil sulfato (SDS-PAGE)-método em que uma molécula de P-marca é co polimerizada em geles de SDS-PAGE (P-marca SDS-PAGE) para detectar os níveis endógenos de fosforilação de Rab10, baseado em Porque um altamente sensível anticorpos específicos Rab10 fosforilada ainda estava faltando. Nós não conseguiram detectar a fosforilação de endógena Rab8 devido a seletividade pobre de anticorpos disponíveis atualmente para Rab8 total. Por isso, decidimos focar a fosforilação de Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 em Thr73 localizar no meio da região altamente conservadas "alternar II". Alta conservação dos sítios entre proteínas Rab fosforilação pode ser uma das razões por que os anticorpos phosphospecific reconhecer proteínas Rab distintas são difíceis de fazer.
A fosforilação de Rab8A por LRRK2 inibe a ligação do Rabin8, um fator da troca do nucleotídeo guanina (GEF) que ativa Rab8A trocando o PIB ligado com GTP15. A fosforilação de Rab10 e Rab8A por LRRK2 também inibe a ligação dos inibidores de PIB-dissociação (GDIs), que são essenciais para a ativação de proteínas Rab extraindo as proteínas Rab ligados a PIB de membranas15. Coletivamente, supor que a fosforilação de proteínas Rab por LRRK2 impede que a ativação embora o mecanismo molecular preciso e consequências fisiológicas da fosforilação permanecem obscuros.
P-marca SDS-PAGE foi inventado por Kinoshita et al em 2006: neste método, acrilamida covalentemente foi acoplada com P-tag, uma molécula capturando fosfatos com alta afinidade, que copolymerized em SDS-PAGE geles17. Porque as moléculas de P-etiqueta em um gel de SDS-PAGE seletivamente retardam mobilidade eletroforética de proteínas fosforiladas, P-marca SDS-PAGE pode separar proteínas fosforiladas aqueles não-fosforilada (Figura 1). Se a proteína de interesse é fosforilado em múltiplos resíduos, uma escada de bandas correspondentes às formas diferencialmente fosforiladas será observada. No caso de Rab10, observamos apenas uma banda deslocada, indicando que o Rab10 é phosphorylated apenas em Thr73. A grande vantagem de P-marca SDS-PAGE sobre immunoblotting com anticorpos específicos fosforilação é que Rab10 fosforilada pode ser detectado pelo immunoblotting com anticorpos de fosforilação específico (ou seja, reconhecendo Rab10 total) após ser transferido nas membranas, que é geralmente mais específica, sensível e disponível de fontes comerciais/acadêmico. Outra vantagem de usar P-marca SDS-PAGE é que um pode obter a estimativa aproximada da estequiometria da fosforilação, que é impossível pelo immunoblotting com anticorpos específicos fosforilação ou através da marcação metabólica das células com radioativo fosfatos.
Aparte o uso de barato P-marca acrilamida e algumas pequenas modificações relacionadas a ela, o presente método de detecção de fosforilação de Rab10 por LRRK2 segue um protocolo geral de immunoblotting.Portanto, deve ser simples e facilmente executável em alguns laboratórios onde immunoblotting é uma prática usual, com todos os tipos de amostras, incluindo proteínas purified, lisados celulares e tecido homogenates.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31320-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-04245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsin (10X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4549</td>
			<td>Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium 
			(DMEM)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1560</td>
			<td>Heat-inactivated at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>342-01375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-13765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)</td>
			<td>PolySciences, Inc.</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>045-28335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RSP-THA500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-24751</td>
			<td>Equivalent to Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>346-01312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate(V)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>198-09752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>37174-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17103-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td>
			<td>Kokusan Chemical</td>
			<td>2113899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin-LR</td>
			<td>Wako</td>
			<td>136-12241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 &#176;C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31607-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>075-00616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Kanto Chemical</td>
			<td>25099-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>056-06967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>136-01837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-binding tag acrylamide</td>
			<td>Wako</td>
			<td>AAL-107</td>
			<td>P-tag acrylamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% (w/v) acrylamide solution</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06119-45</td>
			<td>Acrylamide:Bis = 29:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>016-08021</td>
			<td>10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374, 1610373, 1610377</td>
			<td>Molecular weight marker used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III</td>
			<td>Wako</td>
			<td>230-02461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>17109-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran NC 0.45</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600007</td>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Membrane Filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>GVHP00010</td>
			<td>PVDF membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Papers No.1</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>00013600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>28322-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-00251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monolaurate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>345-01865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>232100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostar</td>
			<td>Wako</td>
			<td>291-55203</td>
			<td>ECL solution (Normal sensitivity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostar LD</td>
			<td>Wako</td>
			<td>290-69904</td>
			<td>ECL solution (High sensitivity)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB staining solution</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB R-250</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-17922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB destaining solution</td>
			<td>homemade</td>
			<td></td>
			<td>12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11583816001</td>
			<td>Used at 0.2 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rab10 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8127</td>
			<td>Used at 1:1000 for immunoblotting. 
			Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-pSer935 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133450</td>
			<td>Used at 1 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LRRK2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133518</td>
			<td>Used at 1 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9026</td>
			<td>Used at 1 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Santa-Cruz</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>Used at 0.02 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>515-035-003</td>
			<td>Used at 0.16 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Used at 0.16 &#956;g/mL for immunoblotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK2578215A</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-13237</td>
			<td>Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLi-2</td>
			<td>Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee)</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA</td>
			<td>Provided by Dr Dario Alessi 
			(University of Dundee)</td>
			<td></td>
			<td>This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&#8211;1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&#8211;1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td>
			<td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td>
			<td></td>
			<td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&#8211;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Forma Series II 3110 Water-Jacketed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>Pipet-Aid PA-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P10</td>
			<td>Nichiryo</td>
			<td>00-NPX2-10</td>
			<td>0.5&#8211;10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P200</td>
			<td>Nichiryo</td>
			<td>00-NPX2-200</td>
			<td>20&#8211;200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette P1000</td>
			<td>Nichiryo</td>
			<td>00-NPX2-1000</td>
			<td>100&#8211;1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for micropipette P10</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RST-481LCRST</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for micropipette P200</td>
			<td>FUKAEKASEI</td>
			<td>1201-705YS</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips for micropipette P1000</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RST-4810BRST</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disporsable pipette</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>606180</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL disporsable pipette</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>607180</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL disporsable pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357535</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocytometer</td>
			<td>Sunlead Glass</td>
			<td>A126</td>
			<td>Improved Neubeuer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>For tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>3810-006</td>
			<td>For tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>STAR</td>
			<td>RSV-MTT1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>2323-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>2343-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuges</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655061</td>
			<td>Not for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M2e</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#8211;PAGE tanks</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer tanks</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1510B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel plates (notched)</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel plates (plain)</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon spacers</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-well combs</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder clips</td>
			<td>Nihon Eido</td>
			<td>NA-1000-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-05SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2138R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Station 1000 VC</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>AE-8450</td>
			<td>Power supply for SDS&#8211;PAGE and transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large weighing boats</td>
			<td>Ina Optika</td>
			<td>AS-DL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic containers</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>PS CASE No.4</td>
			<td>10 x 80 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking shaker</td>
			<td>Titech</td>
			<td>NR-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene foam box</td>
			<td>generic</td>
			<td></td>
			<td>The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant LAS-4000</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rab10 phosphorylation detection by lrrk2 activity using sds-page with a phosphate-binding tag

Mutações no rico em leucina repetição quinase 2 (LRRK2) foram mostradas para ser associada com a doença de Parkinson familiar (FPD). Como ativação anormal da atividade da quinase de LRRK2 tem sido implicada na patogênese da DP, é essencial estabelecer um método para avaliar os níveis fisiológicos da atividade da quinase de LRRK2. Estudos recentes revelaram que LRRK2 fosforila membros da família Rab GTPase, incluindo Rab10, sob condições fisiológicas. Embora a fosforilação de Rab10 endógeno por LRRK2 em pilhas cultivadas pode ser detectada por espectrometria de massa, tem sido difícil detectá-lo pelo immunoblotting devido à sensibilidade pobre de anticorpos de fosforilação específicos disponíveis atualmente para Rab10. Aqui, descrevemos um simples método de detectar os níveis endógenos de fosforilação de Rab10 por LRRK2 baseado na immunoblotting utilizando sódio Dodecil sulfato poliacrilamida electroforese do gel (SDS-PAGE) combinado com uma marca de ligação de fosfato (P-tag), que é N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N «,N «- tris (piridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. O presente protocolo não só fornece um exemplo da metodologia utilizando a tag-P, mas também permite a avaliação de como mutações, bem como inibidor de tratamento/administração ou quaisquer outros fatores alteram a sinalização a jusante de LRRK2 em células e tecidos .

Superexpressão sistema: Fosforilação de HA-Rab10 por 3 × bandeira-LRRK2 em HEK293 de células:
Células HEK293 foram transfectadas com 0.266 µ g de HA-Rab10 selvagem-tipo e 1.066 µ g de 3 × bandeira-LRRK2 (mutante tipo selvagem, quinase-inativo (K1906M), ou mutantes FPD). Fosforilação de Rab10 foi examinada por P-marca SDS-PAGE seguido immunoblotting usando um anti-HA anticorpo (Figura 2). 10 µ g de proteínas foram executados em um gel de 10% (80 x 100 x 1 mm), contendo 50 µM P-marca acrilamida e 100 µM MnCl2. O tempo de exposição para o gel P-marca (painel superior) foi de 10 s usando uma solução-padrão de ECL. Co-superexpressão de LRRK2 com Rab10 causou a mudança de banda no gel P-marca (marcado com um círculo aberto no painel superior; comparar pistas 2 e 4). Em contraste, expressão co com um mutante da quinase inactiva LRRK2 (K1906M) falha ao alterar a mobilidade dos Rab10 (compare faixas 4 e 5), indicando que a mudança de banda é devido a atividade da quinase LRRK2. O turno da banda aumentou em todas as mutações de FPD (compare faixas 4 e 6-13) de acordo com o relatório anterior15.
Sistema endógeno: Fosforilação de Rab10 por LRRK2 em pilhas cultivadas:
Células de fibroblastos embrionários rato 3T3-Swiss albino foram tratadas com ou sem inibidor (GSK2578215A) LRRK220 em uma concentração final de 1 µM de 1h (Figura 3A). Células de carcinoma A549 pulmão humano foram tratadas com ou sem outro LRRK2 inibidor (MLi-2)21 em uma concentração final de 10 nM de 1h (Figura 3B). Phosphorylation endógeno de Rab10 por LRRK2 endógena foi examinado por P-marca SDS-PAGE seguido immunoblotting com anticorpos anti-Rab10. 30 µ g de proteínas foram executados em um gel de 10% (100 x 100 x 1 mm para células 3T3-Swiss albino) e 80 mm para A549 células contendo 50 µM P-marca acrilamida e 100 µM MnCl2. A exposição para o gel P-marca (painel superior) na Figura 3A e Figura 3B foram 3 min e 90 s, respectivamente. Observou-se a mudança de banda correspondente a Rab10 endógeno fosforilada no gel P-marca (marcado com um círculo aberto no painel superior; comparar pistas 1-2 e 3-4) que desapareceram após o tratamento das células com GSK2578215A ou MLi-2. A eficácia de inibidores da LRRK2 foi validada pelo immunoblotting utilizando o anticorpo de LRRK2 anti-pSer935 (o terceiro painel do fundo), que é uma leitura bem estabelecida de inibição LRRK2 em células22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig1.jpg"> 
Figura 1. Representação esquemática da P-marca SDS-PAGE. Quando uma mistura de fosforilada (círculos vermelhos) e não-fosforilada (círculos azuis) proteínas (por exemplo, Rab10) é executado através de um gel de acrilamida P-marca Cadê co polimerizada, a mobilidade das proteínas fosforiladas apenas retarda devido a forte interação das proteínas fosforiladas com as moléculas de P-marca (quebrado setas). Desde que Rab10 é fosforilada pela LRRK2 em um único resíduo, Thr73, Rab10 é executado como duas bandas: a banda superior representa Rab10 fosforilada e a banda inferior representa não-fosforilada Rab10. Quando as células são tratadas com inibidores LRRK2, a banda superior deve desaparecer. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig2.jpg"> 
Figura 2. Resultado representativo do blot P-marca: sistema de superexpressão. O painel superior mostra o blot P-marca usando um antianticorpo, onde Rab10 fosforilada e não-fosforilada são marcados com HA abrir (○) e fechados círculos (●), respectivamente. Os painéis mostrados abaixo o blot P-marca são immunoblots em geles de SDS-PAGE normais usando um anti-HA, anti-FLAG, anti-α-tubulina e anticorpos anti-GAPDH. O Borrão HA e borrão de bandeira são mostradas para assegurar a superexpressão de HA-Rab10 e 3xFLAG-LRRK2, respectivamente. A α-tubulina e borrões GAPDH são mostrados para assegurar o carregamento igual. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig3.jpg"> 
Figura 3. Resultado representativo do blot P-marca: sistema endógeno. Duas células de linhas, ou seja, células 3T3-Swiss albino de (A) e (B) A549 células, foram usados. Em ambas as figuras, os painéis top mostram que o P-tag borrões usando um anticorpo anti-Rab10, onde Rab10 endógeno fosforilada e não-fosforilada são marcados com aberta (○) e fechados círculos (●), respectivamente. Os painéis mostrados abaixo os borrões de P-marca são immunoblots em geles de SDS-PAGE normais usando um anti-Rab10, anti-pSer935 LRRK2, anti-LRRK2 e anticorpos anti-α-tubulina. O Rab10 e LRRK2 são mostradas para garantir a expressão semelhante de endógena Rab10 e LRRK2 entre as amostras, respectivamente. PSer935 LRRK2 blot são mostrados para garantir que GSK2578215A (A) e MLi-2 (B) funcionou como esperado. O borrão de α-tubulina são mostradas para assegurar o carregamento igual. As imagens dos borrões de P-marca sobrepostas com o marcador de peso molecular são mostradas na Figura S4. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura S1. Sequências de DNA de plasmídeo o. As sequências de DNA do plasmídeo codificação FRT HA-Rab10/pcDNA5 para e o de 3 × × bandeira-LRRK2/p3 bandeira-CMV-10. Todos os plasmídeos utilizados neste protocolo estão disponíveis a partir dos autores mediante pedido. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S1.pdf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura S2. Um exemplo de otimização dos P-marca SDS-PAGE. O mesmo conjunto de amostras que o usado na Figura 3A foi usado para otimizar o P-marca SDS-PAGE. Quatro diferentes condições foram testadas como mostrado na figura. As bandas correspondentes a Rab10 fosforilada e não-fosforilada são realçadas com retângulos de linha tracejada e sólido, respectivamente.Baseado nesta experiência, a condição com acrilamida 10%, do acrilamido de P-marca 50 µM e 100 µM MnCl2 deu a melhor separação das duas bandas, ambos localizando no meio do gel. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S2.tif">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura S3. Comparação do padrão de migração de um marcador de peso molecular. O marcador de peso molecular (MWM) foi executado em um gel de SDS-PAGE regular (painel esquerdo) ou em um gel de SDS-PAGE de P-marca (painel central), e os géis foram corados pela coloração Coomassie. O painel direito mostra um immunoblot das amostras utilizadas na Figura 2 (pista 4 e 5) no mesmo gel P-marca SDS-PAGE como o painel médio para mostrar as posições de Rab10 fosforilada e não-fosforilada. A ponta da seta do lado direito do immunoblot indica a posição de um do MWM sobre o gel de SDS-PAGE de P-marca. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S3.tif">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura S4. A posição de um marcador de peso molecular em geles de SDS-PAGE de P-marca. Imagens digitalizadas das membranas utilizadas para Figura 3A e Figura 3B são mostradas como (A) e(B), respectivamente. Os immunoblots mostrados na Figura 3 são sobrepostos para mostrar a posição relativa do marcador de peso molecular (MWM). A MWM não se transferiu para as membranas, mas o marcador (seta) na Figura S3 foi observado fraca mas consistentemente. A posição da MWM está marcada com linhas pontilhadas. Observe que pistas irrelevantes para os números entre a MWM e as vias de interesse estão riscadas. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S4.tif">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

O presente estudo descreve um método simples de detectar níveis endógenos de fosforilação de Rab10 pela rica em leucina repetição quinase 2.

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

rab10-phosphorylation-detection-lrrk2-activity-using-sds-page-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.8K visualizações.  The University of Tokyo. O presente estudo descreve um método simples de detectar níveis endógenos de fosforilação de Rab10 pela rica em leucina repetição quinase 2.

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Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Bioquímica

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom body (MB) is a higher brain center proposed to be the neural substrate of complex honeybee behaviors. Although previous studies identified genes and proteins that are differentially expressed in the MBs and other brain regions, the activities of the proteins in each region are not yet fully understood. To reveal the functions of these proteins in the brain, pharmacologic analysis is a feasible approach, but it is first necessary to confirm that pharmacologic manipulations indeed alter the protein activity in these brain regions.
We previously identified a higher expression of genes encoding phospholipase C (PLC) in the MBs than in other brain regions, and pharmacologically assessed the involvement of PLC in honeybee behavior. In that study, we biochemically tested two pharmacologic agents and confirmed that they decreased PLC activity in the MBs and other brain regions. Here, we present a detailed description of how to detect PLC activity in honeybee brain homogenate. In this assay system, homogenates derived from different brain regions are reacted with a synthetic fluorogenic substrate, and fluorescence resulting from PLC activity is quantified and compared between brain regions. We also describe our evaluation of the inhibitory effects of certain drugs on PLC activity using the same system. Although this system is likely affected by other endogenous fluorescence compounds and/or the absorbance of the assay components and tissues, the measurement of PLC activity using this system is safer and easier than that using the traditional assay, which requires radiolabeled substrates. The simple procedure and manipulations allow us to examine PLC activity in the brains and other tissues of honeybees involved in different social tasks.

To test the inhibitory effects of pharmacologic agents on phospholipase C (PLC) in different regions of the honeybee brain, we present a biochemical assay to measure PLC activity in those regions. This assay could be useful for comparing PLC activity among tissues, as well as among bees exhibiting different behaviors.

Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.