ونحن نشكر الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو، اليابان) يرجى تقديم والبلازميدات ترميز WT 3xFLAG-LRRK2، وطفرات. كما نشكر الدكتور داريو اليسي (جامعة داندي، المملكة المتحدة) لتوفير يرجى MLi-2 وبلازميد ترميز Rab10 هكتار. وأيد هذا العمل "الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS) كاكينهي المنحة رقم JP17K08265 (غي).

<ol>
	<li>Sveinbjornsdottir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+symptoms+of+Parkinson's+disease.">The clinical symptoms of Parkinson's disease.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).</li><li>Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+in+Parkinson+disease:+Mendelian+versus+non-Mendelian+inheritance.">Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).</li><li>Pais&#225;n-Ru&#237;z, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li><li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li><li>Gilks, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+LRRK2+mutation+in+idiopathic+Parkinson's+disease.">A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease.</a> Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).</li><li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson's+disease.">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li><li>Sim&#243;n-S&#225;nchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson's+disease.">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li><li>Klein, C., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imputation+of+sequence+variants+for+identification+of+genetic+risks+for+Parkinson's+disease:+a+meta-analysis+of+genome-wide+association+studies.">Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies.</a> Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).</li><li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+(LRRK2)+in+Parkinson's+disease.">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).</li><li>Ozelius, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson’s+Disease+in+Ashkenazi+Jews.">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).</li><li>Lesage, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson’s+Disease+in+North+African+Arabs.">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).</li><li>Bouhouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+G2019S+Mutation:+Prevalence+and+Clinical+Features+in+Moroccans+with+Parkinson's+Disease.">LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease.</a> Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).</li><li>West, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity.">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).</li><li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+binding+is+essential+to+the+protein+kinase+activity+of+LRRK2,+a+causative+gene+product+for+familial+Parkinson's+disease.">GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease.</a> Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).</li><li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases.">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2:+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors.">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).</li><li>Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate-binding+tag,+a+new+tool+to+visualize+phosphorylated+proteins.">Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).</li><li>Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2017)</li><li>Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblotting+and+Immunodetection.">Immunoblotting and Immunodetection.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).</li><li>Reith, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK2578215A;+a+potent+and+highly+selective+2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide+LRRK2+kinase+inhibitor.">GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).</li><li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLi-2,+a+potent,+selective+and+centrally+active+compound+for+exploring+the+therapeutic+potential+and+safety+of+LRRK2+kinase+inhibition.">MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).</li><li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser(910)/Ser(935),+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization.">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).</li><li>Th&#233;venet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+LRRK2+expression+points+to+a+functional+role+in+human+monocyte+maturation.">Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation.</a> PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وهنا يصف لنا طريقة سهلة وقوية للكشف عن الفسفرة Rab10 من LRRK2 على المستويات المحلية استناداً إلى منهجية العلامة ف. لأن جسم المتوفرة حاليا ضد Rab10 فوسفوريلاتيد يعمل فقط مع البروتينات overexpressed15، هذا الأسلوب استخدام العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هو السبيل الوحيد لتقييم مستويات الفسفرة Rab10 الذاتية. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا الأسلوب تقدير stoichiometry الفسفرة Rab10 في الخلايا. نظراً لأن المنهجية فالعلامه التي تنطبق عموما على بروتينات والرمات، يمكن أن يكون هذا البروتوكول "نموذج" لإنشاء أساليب مماثلة لغيرها من البروتينات والرمات.
خطوات حاسمة في البروتوكول هي المواد الهلامية الصب، وإعداد عينات. اكريلاميد العلامة ف كاشف صور مجا نسبيا والقدرة على إعاقة تنقل الغرواني الكهربي للبروتينات فوسفوريلاتيد يضيع أحياناً بعد التخزين على المدى الطويل في 4 درجات مئوية. الباحثين ينبغي اتخاذ كل العناية لتجنب تعريض الاكريلاميد فالعلامه على ضوء. وعلاوة على ذلك، يحتاج الجزيء فالعلامه شكل معقد مع Mn2 + الأيونات لالتقاط الفوسفات. وهكذا، ينبغي أن لا تحتوي على عينات وكلاء شيلاتينغ مثل يدتا، وهي المكونات المعتادة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة متوفرة تجارياً عينة المخازن المؤقتة. نوصي باستخدام المخزن المؤقت عينة لايملي الكلاسيكي لإعداد العينات للعلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
آخر نقطة حرجة لتحسين دقة تركيزات الاكريلاميد، الاكريلاميد فالعلامه و الحركة2 في خليط جل الانفصال (S2 الشكل). المسافات الهجرة من عصابات فوسفوريلاتيد وغير فوسفوريلاتيد ستختلف والكواشف المستخدمة (الكثير، النقاء، إلخ)، والأمثل لتركيزات السليم عن طريق اختبار عدة تركيزات مختلفة في تركيبة إلزامية (مثلاً فالعلامه الاكريلاميد (25، 50، 75 ميكرون)، الحركة2 (1:2 أو 1:3 المولى نسبة إلى الاكريلاميد فالعلامه)، ومادة اكريلاميد (7.5، 10، 12.5 ٪)). يجب أن تظهر في منتصف المواد الهلامية العصابات فوسفوريلاتيد وغير فوسفوريلاتيد وكذلك فصلها عن بعضها البعض. لعملية التحسين، يوصي باستخدام Rab10 أوفيريكسبريسيد بسبب الفرقة تحول سهولة الاكتشاف. يمكن توفير الكتاب عينات مراقبة لهذا البروتوكول.
سوف تكون واحدة من أكبر الالتباس الذي يمكن أن يسبب هذا البروتوكول نظراً إلى اختلاف أنماط الهجرة MWM بين العادية والمواد الهلامية العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. كما هو موضح في الشكل S3، أنماط الهجرة MWM على العادية والمواد الهلامية العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (كل 10 ٪) تختلف إلى حد كبير وواحد لا يمكن استخدام MWM تقدير الوزن الجزيئي للبروتينات في العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية. بيد على المواد الهلامية العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، واحدة من MWM تبرز بالترحيل إلى منتصف الهلام (رأس السهم في الشكل S3)، الذي هو استمرار الالتزام بين المواد الهلامية (انظر الشكل S4). وترحيل هذا MWM دائماً بين عصابات Rab10 فوسفوريلاتيد وغير فوسفوريلاتيد. ولذلك، هذه العلامة مفيد ليس فقط لضمان أن يعمل الوسم ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة قبل نقل ولكن أيضا كعلامة بارزة لوجود شعور الخام من حيث سيتبين عصابات Rab10 فوسفوريلاتيد وغير فوسفوريلاتيد.
للكشف عن عصابات في إيمونوبلوتس، وقد استخدمنا تصوير مزودة بكاميرا CCD تبريد (انظر الجدول للمواد) كذلك كالأشعة سينية تقليدية نظام تطوير الفيلم، ووجدت أن كلا أنظمة تعمل بشكل جيد. للكشف عن مستويات الذاتية من الفسفرة Rab10 في الخلايا المستزرعة، من الضروري استخدام خطوط الخلايا التي لها مستويات عالية من التعبير LRRK2 الذاتية، مثل الماوس الليفية الجنينية (أما الابتدائية مثقف أو خلد (خطوط الخلية ألبينو 3T3-السويسرية، إلخ)) وخلايا A549 المستمدة من سرطان الرئة البشرية. للكشف عن مستويات الفسفرة Rab10 في أنسجة الماوس الذاتية، فإنه من المستحسن استخدام الرئة16.
كوانتيتيشن الفسفرة Rab10 لا يتجاوز إيمونوبلوتينج المعتادة. إذا ستويتشيوميتري الفسفرة Rab10 منخفض جداً (كما هو موضح في الشكل 3)، كثافة الفرقة غير فوسفوريلاتيد (ملحوظ مع دائرة مغلقة) تميل إلى أن تكون أعلى بكثير من مستوى التشبع، مما يجعل التحديد الدقيق ستويتشيوميتري من المستحيل. ومع ذلك، تقدير النوعية لا يزال ممكناً في أي حال، التي لا يمكن الحصول عليها دون استخدام الأسلوب الحالي. منذ الكشف عن الفسفرة Rab10 الذاتية يتطلب التعرض لفترة طويلة، هناك تميل إلى أن تكون بعض العصابات غير محدد التي تظهر على علامة ف لطخة على الرغم من أن الأجسام المضادة-Rab10 المستخدمة في هذا البروتوكول يعطي إيمونوبلوتس نظيفة إلى حد ما للاستخدام العادي . لتمييز البروتينات فوسفوريلاتيد من عصابات غير محدد، من المهم لاستخدام عنصر تحكم مثبط لعلاج، العصابات فوسفوريلاتيد، ولكن عصابات غير محدد، والتي يجب أن تختفي. LRRK2 فوسفوريلاتيس Rab8 بالإضافة إلى Rab1015، ونحن قد طبقت بنجاح في هذا البروتوكول إلى Rab8A كذلك (البيانات لا تظهر). احتمال أن تستخدم هذا البروتوكول لدراسة الفسفرة أي البروتينات، على الرغم من أنه قد تكون هناك صعوبات تقنية إذا كان البروتين الكبيرة (&#62; كاتشين 100) أو ضرب فوسفوريلاتيد. لأن Rab10 بروتين صغير (25 كاتشين) ومنفردة فوسفوريلاتيد في Thr73 التي LRRK2، نتيجة للعلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة بسيطة حيث لوحظ الفرقة تحول واحد فقط.
في المستقبل القريب، سيكون حاسما لوضع طريقة للكشف عن نشاط كيناز LRRK2 كمياً في العينات المستمدة من المريض بطريقة الفائق لتقييم تغيير نشاط كيناز LRRK2 في مرضى PD، فضلا عن تقييم أثر المخدرات على LRRK2 في التجارب السريرية. منذ الدم المحيطي البشري إكسبريس الخلايا وحيدات النوى (ببمكس) مستويات عالية نسبيا من الذاتية LRRK223، ببمكس أو زيادة عزل خلايا الدم سوف يكون من المفيد اختبار الفسفرة Rab10 الذاتية. الأسلوب الحالي سوف تكون مفيدة في الأحياء الأساسية من LRRK2 مما يشير إلى مسار التحقيق، بل تساعد أيضا في الحصول على دليل-من-مفهوم أساسي لاتخاذ قرار هو الذي عينة في العينات المستمدة من المريض يتم تحليلها في هذه الدراسات على نطاق واسع.

PD واحدة من الأمراض الأكثر شيوعاً التي الأعصاب، يغلب التي تؤثر على الخلايا العصبية تتميز في midbrain، أسفر عن الخلل في أنظمة المحركات في كبار السن1. بينما يطور معظم المرضى PD بطريقة متقطعة، وهناك أسر وراثة المرض. الطفرات في الجينات عدة وجدت لتكون مرتبطة مع FPD2. من الجينات المسببة ل FPD، LRRK2، التي كانت ثمانية مغلطه الطفرات (N1437H و R1441C/G/H/S، Y1699C، G2019S و I2020T) ترتبط FPD المهيمن موروثة التي تسمى PARK8 حتى الآن عن3،،من45. أيضا حددت العديد من الدراسات على نطاق الجينوم جمعية (جواس) متفرقة PD المرضى الاختلافات الجينية في محور LRRK2 كعامل خطر لشعبة المشتريات، مما يوحي بأن الشذوذ في وظيفة LRRK2 سبب شائع نيوروديجينيريشن في كل متفرقة و PARK8 FPD6،،من78.
LRRK2 بروتين كبير (الأحماض الأمينية 2,527) تتكون من مجال تكرار الغنية leucine، Ras غتب-ملزم للبروتينات المعقدة (ROC) المجال، ج-محطة ROC (COR) المجال والمجال كيناز البروتين سيرين/ثريونين، و مجال تكرار WD409. قم بتحديد موقع الطفرات FPD الثمانية في هذه المجالات الوظيفية؛ N1437H و R1441C/G/H/S في المجال ROC، Y1699C في المجال COR، G2019S و I2020T في مجال كيناز. منذ الطفرة G2019S، الذي يوجد أغلب الأحيان طفرة في PD المرضى10،،من1112، يزيد من نشاط كيناز LRRK2 من 2-3 إضعاف في المختبر13، هو الافتراض بأنه أن الزيادة غير طبيعية في الفسفرة LRRK2 substrate(s) سامة للخلايا العصبية. ومع ذلك، كان من المستحيل لدراسة ما إذا كان يتم تبديل الفسفرة من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة LRRK2 ركائز في الأسرية/متفرقة PD المرضى بسبب عدم وجود أساليب تقييم ذلك في عينات المرضى المشتقة.
عموما الكشف عن الفسفرة البروتين بواسطة immunoblotting أو المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا) استخدام الأجسام المضادة على وجه الخصوص الاعتراف بدولة فوسفوريلاتيد للبروتينات أو بواسطة التحليل الشامل والمطيافيه. ومع ذلك، الاستراتيجية السابقة في بعض الأحيان لا يمكن تطبيق بسبب الصعوبات في إيجاد الأجسام المضادة الفسفرة محددة. وسم الأيضية للخلايا مع الفوسفات المشعة خيار آخر فحص مستويات الفيزيولوجية من الفسفرة عندما لا تكون الأجسام المضادة الفسفرة محددة متاحة بسهولة. بيد أنه يتطلب كمية كبيرة من المواد المشعة، وذلك ينطوي على بعض المعدات المتخصصة للإشعاع14. التحليل الشامل والمطيافيه هي أكثر حساسية بالمقارنة مع هذه الأساليب عن وأصبحت شعبية في تحليل البروتين الفسفرة. بيد أن إعداد عينة مضيعة للوقت ومكلفة الصكوك مطلوبة من أجل التحليل.
مجموعة فرعية من جتباسي رب الأسرة بما في ذلك Rab10 و Rab8 أفيد مؤخرا كركائز الفسيولوجية المباشرة ل LRRK2 استناداً إلى نتيجة ل تحليل واسع النطاق فوسفوبروتيوميك15. ثم أثبتنا أن الفسفرة Rab10 زيد ب FPD الطفرات في الخلايا الليفية الجنينية الماوس وفي رئات الفئران16knockin. وفي هذا التقرير، اخترنا أن توظف صوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)-على أساس الأسلوب الذي جزيء فعلامه مبلمرة اشتركت في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية (فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) للكشف عن مستويات الذاتية الفسفرة Rab10، لأنه كان لا يزال يفتقر إلى جسم حساسة للغاية محددة ل Rab10 فوسفوريلاتيد. ونحن قد أخفقت في الكشف عن الفسفرة Rab8 الذاتية بسبب الانتقائية الفقراء من الأجسام المضادة المتاحة حاليا لمجموع Rab8. ولذلك، قررنا أن نركز على الفسفرة Rab10. LRRK2 فوسفوريلاتيس Rab10 في Thr73 مكان في منتصف المنطقة المصانة عاليا "التبديل الثاني". الحفظ عالية من مواقع الفسفرة بين البروتينات Rab قد يكون واحداً من الأسباب التي تجعل الأجسام المضادة فوسفوسبيسيفيك الاعتراف بالبروتينات Rab متميزة صعبة لجعل.
الفسفرة Rab8A حسب LRRK2 يحول دون ربط Rabin8، عامل تبادل النوكليوتيدات جوانين (مرفق البيئة العالمية) الذي ينشط Rab8A عن طريق تبادل منضم الناتج المحلي الإجمالي مع أنشئ15. كما يمنع الفسفرة Rab10 و Rab8A ب LRRK2 ربط مثبطات الانفصال من الناتج المحلي الإجمالي (جديس)، التي تعتبر أساسية لتفعيل Rab البروتينات عن طريق استخراج البروتينات Rab الناتج المحلي الإجمالي زمنياً من الأغشية15. مجتمعة، هو الافتراض بأن الفسفرة Rab البروتينات التي LRRK2 يمنعهم من التنشيط على الرغم من أن الآلية الجزيئية الدقيقة والآثار الفسيولوجية الفسفرة ما زالت غير واضحة.
فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة اخترعها كينوشيتا et al. في عام 2006: في هذا الأسلوب، اقترن الاكريلاميد تساهمي مع فالعلامه، والهلام جزيء التقاط الفوسفات مع تقارب عالية، الذي كوبوليميريزيد في صحيفة بيانات السلامة-الصفحة17. لأن الجزيئات فالعلامه في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تؤخر بشكل انتقائي التنقل الغرواني الكهربي للبروتينات فوسفوريلاتيد، فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يمكن فصل البروتينات فوسفوريلاتيد من غير فوسفوريلاتيد منها (الشكل 1). إذا كان هو فوسفوريلاتيد البروتين من الفائدة على بقايا متعددة، سيجري الاحتفال بسلم للفرق المقابلة لأشكال خلطات فوسفوريلاتيد. وفي حالة Rab10، نلاحظ الفرقة تحول واحد فقط، مما يشير إلى أن Rab10 هو فوسفوريلاتيد فقط في Thr73. الميزة الرئيسية للعلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة على مدى إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة الفسفرة محددة أن Rab10 فوسفوريلاتيد ويمكن الكشف عنها بواسطة إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة غير الفسفرة محددة (أيالاعتراف مجموع Rab10) بعد نقله في الأغشية، وهو عموما أكثر تحديداً، وحساسة، والمتاحة من المصادر التجارية/الأكاديمية. وهناك ميزة أخرى لاستخدام العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أنه يمكنك الحصول على تقدير تقريبي ستويتشيوميتري الفسفرة، التي من المستحيل إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة الفسفرة محددة أو بوصفها الأيضية للخلايا مع المشعة الفوسفات.
وبصرف النظر عن الاستخدام غير مكلفة فالعلامه الاكريلاميد وبعض التعديلات الطفيفة المتعلقة به، يتبع الأسلوب الحالي للكشف عن الفسفرة Rab10 من LRRK2 عامة بروتوكول إيمونوبلوتينج.ولذلك، ينبغي واضحة وقابلة للتنفيذ بسهولة في أي المختبرات حيث إيمونوبلوتينج ممارسة معتادة، مع أي من أنواع العينات بما في ذلك البروتينات المنقاة، ليساتيس الخلية والأنسجة هوموجيناتيس.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td><td>homemade</td><td></td><td>150 mM NaCl, 8 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;in MilliQ water and sterilized by autoclaving</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Dihydrogen Phosphate</td><td>Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin (10X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified Eagle medium&lt;br/&gt; (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>Heat-inactivated at 56 &amp;deg;C for 30 min</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)</td><td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td><td>Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Wako</td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>Equivalent to Triton X-100</td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate(V)</td><td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>Kanto Chemical</td><td>37174-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 &amp;deg;C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-binding tag acrylamide</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>P-tag acrylamide</td></tr><tr><td>40% (w/v) acrylamide solution</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>Acrylamide:Bis = 29:1</td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td><td>10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>Molecular weight marker used in the protocol</td></tr><tr><td>WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III</td><td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran NC 0.45</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>Nitrocellulose membrane</td></tr><tr><td>Durapore Membrane Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>GVHP00010</td><td>PVDF membrane</td></tr><tr><td>Filter Papers No.1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>polyoxyethylenesorbitan monolaurate</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder</td><td>Difco Laboratories</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>ECL solution (Normal sensitivity)</td></tr><tr><td>Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>ECL solution (High sensitivity)</td></tr><tr><td>CBB staining solution</td><td>homemade</td><td></td><td>1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>CBB destaining solution</td><td>homemade</td><td></td><td>12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11583816001</td><td>Used at 0.2 &amp;mu;g/mL for immunoblotting.</td></tr><tr><td>anti-Rab10 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8127</td><td>Used at 1:1000 for immunoblotting.&lt;br/&gt; Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.</td></tr><tr><td>anti-pSer935 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>Used at 1 &amp;mu;g/mL for immunoblotting.</td></tr><tr><td>anti-LRRK2 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>Used at 1 &amp;mu;g/mL for immunoblotting.</td></tr><tr><td>anti-&amp;alpha;-tubulin antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>Used at 1 &amp;mu;g/mL for immunoblotting.</td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>Used at 0.02 &amp;mu;g/mL for immunoblotting.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>Used at 0.16 &amp;mu;g/mL for immunoblotting.</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>Used at 0.16 &amp;mu;g/mL for immunoblotting.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Inhibitors&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSK2578215A</td><td>MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee)</td><td></td><td>Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA</td><td>Provided by Dr Dario Alessi&lt;br/&gt; (University of Dundee)</td><td></td><td>This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10.</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td><td></td><td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&amp;ndash;1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td><td></td><td>Ito et al., Biochemistry, 46: 1380&amp;ndash;1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&amp;ndash;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&amp;ndash;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&amp;ndash;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&amp;ndash;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&amp;ndash;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&amp;ndash;10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Forma Series II 3110 Water-Jacketed</td><td></td></tr><tr><td>Auto Pipette</td><td>Drummond</td><td>Pipet-Aid PA-400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette P10</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-10</td><td>0.5&amp;ndash;10 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Micropipette P200</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&amp;ndash;200 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Micropipette P1000</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100&amp;ndash;1000 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Tips for micropipette P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Tips for micropipette P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Tips for micropipette P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>5 mL disporsable pipette</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>10 mL disporsable pipette</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>25 mL disporsable pipette</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Hematocytometer</td><td>Sunlead Glass</td><td>A126</td><td>Improved Neubeuer</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>10 cm dishes</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>For tissue culture</td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3810-006</td><td>For tissue culture</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapers</td><td>Sumitomo Bakelite</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>STAR</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuges</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner</td><td>655061</td><td>Not for tissue culture</td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&amp;ndash;PAGE tanks</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>Transfer tanks</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>Gel plates (notched)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Gel plates (plain)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>Silicon spacers</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>17-well combs</td><td>Nihon Eido</td><td>Custom made</td><td></td></tr><tr><td>Binder clips</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>Terumo</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>Power Station 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450</td><td>Power supply for SDS&amp;ndash;PAGE and transfer</td></tr><tr><td>Large weighing boats</td><td>Ina Optika</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>Plastic containers</td><td>AS ONE</td><td>PS CASE No.4</td><td>10 x 80 x 50 mm</td></tr><tr><td>Rocking shaker</td><td>Titech</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>Styrene foam box</td><td>generic</td><td></td><td>The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm).</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL</td></tr></tbody></table>

rab10 phosphorylation detection by lrrk2 activity using sds-page with a phosphate-binding tag

الطفرات في الغنية لوسين تكرار كيناز 2 (LRRK2) تبين أن تكون مرتبطة بمرض باركنسون الأسرية (FPD). منذ التنشيط غير طبيعي لنشاط كيناز LRRK2 قد تورط في الآلية المرضية لشعبة المشتريات، من الضروري وضع طريقة تقييم مستويات الفسيولوجية للنشاط كيناز من LRRK2. وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن LRRK2 فوسفوريلاتيس أفراد الأسرة Rab جتباسي، بما في ذلك Rab10، في ظل الظروف الفسيولوجية. على الرغم من الفسفرة Rab10 الذاتية التي LRRK2 في الخلايا المستزرعة يمكن الكشف عنها بواسطة الكتلي، كان من الصعب أن الكشف عن ذلك إيمونوبلوتينج وبسبب حساسية أجسام محددة الفسفرة المتاحة حاليا للفقراء Rab10. وهنا، يمكننا وصف بسيط الأسلوب للكشف عن مستويات الفسفرة Rab10 من LRRK2 الذاتية استناداً إلى إيمونوبلوتينج استخدام الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) جنبا إلى جنب مع علامة ربط الفوسفات (P--علامة)، التي ن-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N،ن '،ن'-تريس (بيريدين-2-يل-الميثيل) ديامينوبروبان-1، 3--2-الرتب الأخرى. هذا البروتوكول لا يشكل مثالاً للمنهجية التي تستخدم علامة ف فحسب بل يمكن أيضا تقييم كيف يغير الطفرات، فضلا عن العلاج المانع والإدارة أو أي عوامل أخرى مما يشير إلى المصب من LRRK2 في الخلايا والأنسجة .

نظام أوفيريكسبريشن: الفسفرة من ها Rab10 3 × العلم-LRRK2 في HEK293 الخلايا:
تم transfected الخلايا HEK293 مع 0.266 ميكروغرام من Rab10 هكتار البرية من نوع و 1.066 ميكروغرام من 3 × العلم-LRRK2 (المسخ كيناز نشط، والبرية من نوع (K1906M)، أو طفرات FPD). بحثت الفسفرة Rab10 فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تليها immunoblotting استخدام مضاد-ها جسم (الشكل 2). تم تشغيل 10 ميكروغرام من البروتينات على 10% هلام (80 × 100 × 1 مم) التي تحتوي على 50 ميكرومتر فالعلامه الاكريلاميد و 100 ميكرومتر الحركة2. وكان وقت التعرض لجل فالعلامه (اللوحة العلوية) 10 s استخدام حل مسافنة قياسية. Co-أوفيريكسبريسيون LRRK2 مع Rab10 تسبب تحول الفرقة في جل فالوسم (وضع علامة مع دائرة مفتوحة في أعلى اللوحة؛ قارن الممرات 2 و 4). وفي المقابل، التعبير المشترك مع متحولة كيناز نشط LRRK2 (K1906M) فشل في تغيير حركة Rab10 (قارن حارات 4 و 5)، مما يدل على أن هذا التحول الفرقة سبب النشاط كيناز LRRK2. تم زيادة التحول الفرقة بجميع الطفرات FPD (قارن حارات 4 و 6-13) باﻻتفاق مع التقرير السابق15.
نظام الذاتية: الفسفرة Rab10 التي LRRK2 في الخلايا المستزرعة:
كانت تعامل الخلايا الجنينية تنتجها الخلايا الليفية ألبينو 3T3-السويسرية الماوس مع أو بدون المانع (GSK2578215A) LRRK220 بتركيز نهائي من 1 ميكرومتر ح 1 (الشكل 3A). خلايا A549 سرطان الرئة البشرية تعامل مع أو بدون LRRK2 آخر مثبط (MLi-2)21 بتركيز نهائي 10 نانومتر ح 1 (الشكل 3B). بحثت فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تليها immunoblotting مع جسم Rab10 مكافحة الفسفرة Rab10 الذاتية التي LRRK2 الذاتية. تم تشغيل 30 ميكروغرام من البروتينات على جل 10% (100 × 100 × 1 مم للخلايا ألبينو 3T3-السويسرية) و 80 ملم لخلايا A549 تحتوي على 50 ميكرومتر فالعلامه الاكريلاميد و الحركة 100 ميكرومتر2. تم التعرض لجل فالعلامه (اللوحة العلوية) في الشكل 3 ألف ، و الرقم 3 3 دقيقة و 90 ثانية، على التوالي. لوحظ تحول الفرقة المقابلة فوسفوريلاتيد Rab10 الذاتية على جل فالعلامه (علامة مع دائرة مفتوحة في أعلى اللوحة؛ ومقارنة الممرات 1-2 و 3-4) التي اختفت عند معاملة الخلايا التي تحتوي على GSK2578215A أو معهد الطب العدلي-2. تم التحقق من صحة فعالية مثبطات LRRK2 من إيمونوبلوتينج استخدام جسم LRRK2 مكافحة pSer935 (الفريق الثالث من الأسفل)، الذي قراءات راسخة لتثبيط LRRK2 في الخلايا22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig1.jpg"> 
رقم 1. تصوير تخطيطي لمخزونات النشر الاستراتيجي – صفحة فعلامه- عند تشغيل خليط من فوسفوريلاتيد (دوائر حمراء) والبروتينات غير فوسفوريلاتيد (الدوائر الزرقاء) (مثلاً، Rab10) من خلال جل مبلمرة شارك فيها الاكريلاميد فالعلامه، تنقل البروتينات فوسفوريلاتيد فقط يؤخر بسبب القوى تفاعل البروتينات فوسفوريلاتيد مع جزيئات فالعلامه (تقسيم الأسهم). ما هو فوسفوريلاتيد Rab10 من LRRK2 في رواسب واحد Thr73، Rab10 يعمل شريطين: الفرقة الأعلى يمثل Rab10 فوسفوريلاتيد والفرقة أسفل Rab10 غير فوسفوريلاتيد. عندما تعامل الخلايا مع مثبطات LRRK2، ينبغي أن تختفي الفرقة الأعلى. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig2.jpg"> 
رقم 2. الممثل نتيجة وصمة عار فالعلامه: نظام أوفيريكسبريسيون- يظهر أعلى اللوحة وصمة عار فالوسم باستخدام مضاد-ها جسم، حيث يتم وضع علامة Rab10 فوسفوريلاتيد وغير فوسفوريلاتيد مع فتح (○) وأغلقت الدوائر (●)، على التوالي. اللوحات المبينة أدناه وصمة عار فالعلامه إيمونوبلوتس في الهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عادية استخدام مضاد-ها، المضادة العلم ومكافحة-α-tubulin والأجسام المضادة-جابده. وترد ها وصمة عار ووصمة عار العلم لضمان أوفيريكسبريشن ها-Rab10 و 3xFLAG-LRRK2، على التوالي. يتم إظهار α-tubulin والبقع جابده لضمان تحميل متساوية. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56688/56688fig3.jpg"> 
الشكل 3. الممثل نتيجة وصمة عار فالعلامه: نظام الذاتية- الخلية اثنان خطوط، هي: (أ) ألبينو 3T3-السويسرية الخلايا وخلايا A549 (ب)، واستخدمت. في كلا الرقمين، تظهر اللوحات أعلى علامة ف اسطوانات يقوم باستخدام جسم المضادة Rab10، حيث يتم وضع علامة مع فتح (○) فوسفوريلاتيد وغير فوسفوريلاتيد Rab10 الذاتية وأغلقت الدوائر (●)، على التوالي. لوحات المبينة أدناه البقع فالعلامه إيمونوبلوتس في الهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عادية تستخدم مكافحة--Rab10، LRRK2 pSer935 المضادة ومكافحة LRRK2 والأجسام المضادة-α-tubulin. وترد Rab10 و LRRK2 لضمان تعبير مماثل الذاتية Rab10 و LRRK2 بين العينات، على التوالي. وترد pSer935 LRRK2 وصمة عار لضمان أن GSK2578215A (A) ومعهد الطب العدلي-2 (ب) يعمل كما هو متوقع. يتم إظهار وصمة عار α-tubulin لضمان تحميل متساوية. صور البقع فالعلامه فرضه مع علامة الوزن الجزيئي مبينة في الشكل S4. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/56688fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
الشكل S1. تسلسل الحمض النووي والبلازميدات. تسلسل الحمض النووي بلازميد ترميز إلى FRT هكتار--Rab10/pcDNA5 ومن 3 × × العلم-LRRK2/p3 العلم-CMV-10. تتوفر جميع والبلازميدات المستخدمة في هذا البروتوكول من المؤلفين عند الطلب. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S1.pdf">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الشكل S2. مثال على الاستفادة المثلى من العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. واستخدمت نفس مجموعة من العينات التي استخدمت في الشكل 3 ألف للاستفادة المثلى من الحزب الديمقراطي الصربي فالعلامه-الصفحة. تم اختبار أربعة شروط مختلفة كما هو موضح في الشكل. يتم تمييز العصابات تناظر Rab10 فوسفوريلاتيد وغير فوسفوريلاتيد مع المستطيلات خط الصلبة ومتقطع، على التوالي.استناداً إلى هذه التجربة، أعطى الشرط مع الاكريلاميد 10 ٪، 50 ميكرومتر فالعلامه الاكريلاميد و 100 ميكرومتر الحركة2 فصل أفضل شريطين، كل موقع في وسط الهلام. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S2.tif">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الشكل S3. مقارنة بين نمط الهجرة علامة الوزن الجزيئي. تم تشغيل علامة الوزن الجزيئي (MWM) على جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عادية (اللوحة اليمنى) أو هلام علامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الفريق الأوسط)، والمواد الهلامية كانت ملطخة بأخذ تلطيخ. اللوحة اليسرى يظهر إيمونوبلوت من العينات المستخدمة في الشكل 2 (لين 4 و 5) على جل فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة نفسه كلوحة الأوسط لإظهار مواقف Rab10 فوسفوريلاتيد وغير فوسفوريلاتيد. رأس السهم في الجانب الأيسر من إيمونوبلوت يشير إلى موضع واحد من MWM على جل فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S3.tif">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الشكل S4. موضع علامة الوزن الجزيئي في العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية. تظهر الصور الرقمية في الأغشية المستخدمة في الشكل 3 ألف و الشكل 3B (A) و(ب)، على التوالي. يتم فرضه إيمونوبلوتس هو موضح في الشكل 3 لإظهار الوضع النسبي لعلامة الوزن الجزيئي (MWM). لم ينقل MWM جيدا للأغشية ولكن العلامة (رأس السهم) في الشكل S3 لوحظ ضعيف لكن دائماً. ويتسم موقف MWM مع الخطوط المنقطة. علما بأن عبرت الممرات غير ذات صلة بالأرقام بين MWM والممرات للاهتمام بها. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56688/Figure_S4.tif">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag at JoVE.com

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

هذه الدراسة توضح طريقة بسيطة للكشف عن مستويات الذاتية من الفسفرة Rab10 بالغنية لوسين تكرار كيناز 2.

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

rab10-phosphorylation-detection-lrrk2-activity-using-sds-page-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.8K Views.  The University of Tokyo. هذه الدراسة توضح طريقة بسيطة للكشف عن مستويات الذاتية من الفسفرة Rab10 بالغنية لوسين تكرار كيناز 2.

Video: Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

حساسة للغاية وسريع كشف الإسفار مع محلل الحنق المحمولة

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.

الإنسان المحيطية عزل العدلات الدم لاستجواب باركنسون المرتبطة LRRK2 مسار كيناز من خلال تقييم Rab10 الفوسفور

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biology

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

الأيضية وصفها من لوسين ريتش كرر تحركات 1 و 2 مع المشعة الفوسفات

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

A عالية الدقة الطريقة لرصد تفعيل الفسفرة التي تعتمد من IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

Single-Molecule Pull-Down Assay for Protein Phosphorylation Analysis: A High Throughput Technique to Quantify Protein Phosphorylation in Cell Lysate

Source: Bailey, E. M. et al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/63665">An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a sensitive quantification technique of protein phosphorylation using a single-molecule pull-down assay. The functionalization of polyethylene glycol-biotin and the use of labeled antibodies increases the detection of phosphorylated tyrosine with specificity.

مقايسة سحب الجزيء الواحد لتحليل فسفرة البروتين: تقنية إنتاجية عالية لتحديد فسفرة البروتين في محللة الخلية

Source: Bailey, E. M. et al., An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation. J. Vis. Exp. (2022)
This video ...

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video