The authors have no acknowledgements.

필드 1. 면봉 샘플링 <ol><li> 장갑의 깨끗한 쌍을 착용 할 것. </li><li> 측정 테이프자를 사용하여 표면을 만지지 않고 샘플링 에리어의 크기를 측정한다. 가능한 한 정확하게 영역을 추정하고 보고서 양식 (보충 표 1)를 작성하려고합니다. </li><li> 가능한 누출 및 라벨 샘플 수송 가방과 면봉 키트에 대한 면봉 키트를 확인합니다. </li><li> 다음 샘플링 에리어 걸쳐 면봉 이동 : 수평 방향의 하나의 선, 세로 방향으로 하나의 스트로크와, 대각 방향에 하나의 획. 700cm 2보다 표면적이 큰 면봉하지 마십시오. </li><li> 튜브에 각각 면봉을 놓고 안전하게 뚜껑을 조입니다. </li></ol> 실험실에 면봉 2. 보관 및 운송 <ol><li> 최대 48 시간 동안 4 ° C에서 면봉을 유지합니다. 오랜 기간 동안 보관이 필요한 경우, -20 ° C에서 면봉을 저장 (또는 -70 ° C). </li><li> 0-4 ℃에서 튜브를 유지 (즉,. 컬렉션의 24 ~ 48 시간 이내에 실험실 및 선박에 운송 중 절연 된 용기에) 콜드 팩을 사용합니다. </li></ol> 3. 바이러스 농도 바이러스 RNA 추출 및 정제 주 : 달리 명시되지 않는 한 모든 원심 분리 단계는 실온에서 5 분 동안 5,000 XG에서 테이블 탑 원심 분리기를 사용한다. 보편적 인 핵산 추출 (UNEX) 버퍼로 작업 할 때 추가로주의해야합니다. 고글 또는 안면 보호대를 착용하십시오. <ol><li> 한 15 ML의 튜브와 각 샘플에 대해 하나의 RNA 미디 열 레이블. 각 실험에 부정적인 추출 컨트롤을 포함합니다. </li><li> 10 면봉 대한 분해 용액을 제조 PBST 25 mL로 UNEX 완충액 25 ㎖를 혼합하여 (0.02 %를 함유하는 PBS pH를 7.2 트윈 80). </li><li> 용해 액 50 ㎖에 coliphage의 MS2 서스펜션 (10 6 PFU / μL) 50 μL를 추가합니다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 면봉을 넣고 5 ml의 용해 액을 추가합니다. 혼합하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li>10 초 동안 각 튜브와 소용돌이에 5 ml의 100 % 에탄올을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 15 ML의 튜브에서 면봉을 제거 초과 액체를 제거하고 면봉을 폐기 튜브의 측면에 살짝 누르면 (이 UNEX 버퍼를 포함). 나머지 볼륨은 9 ~ 10 mL의 사이에 있어야한다. </li></ol> 4. 미디 열 바이러스 핵산 추출 <ol><li> 조심스럽게 미디 컬럼, 원심 분리기에 단계 3.6에서 4.5 mL의 UNEX / 에탄올 혼합물을 전송하고, 여과 액을 버린다. </li><li> 동일한 열, 원심 분리기에 같은 혼합물로부터 또 다른 4.5 mL로로드하고, 여과 액을 버린다. </li><li> 제 씻지 미디 칼럼, 원심 분리기에 70 % 에탄올 3.5 mL를 추가하고, 여과 액을 버린다. </li><li> 제 씻지 미디 컬럼에 70 % 에탄올의 또 다른 3.5 mL의 추가. 원심 분리기 여과 액을 버리고. </li><li> 건조 스핀를 들어, 에탄올의 모든 흔적을 (부정적인 바이러스 성 RNA 복구에 영향을 미칠 수있는)을 제거하기 위해 미디 열을 원심 분리기. </li><li>새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브의 미디 열을 놓습니다. 미디 칼럼에 250 μL 용출 버퍼를 추가; 가장 높은 바이러스 성 RNA 복구를 얻기 위해 원심 분리하기 전에 1 분 동안 기다립니다. </li><li> -70 ° C에서 추출 된 핵산을 저장하거나 5 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> RNA 깨끗하고 집중 키트를 사용하여 바이러스 핵산의 5 농도 <ol><li> RNA는 10 초 동안 위의 단계 4.7과 와동에 용출 된 RNA의 250 μL에 버퍼를 바인딩의 500 μL를 추가합니다. </li><li> 10 초 동안 750 μL 100 %를 에탄올과 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 각 샘플에 대한 스핀 열 레이블. 스핀 칼럼에 750 μL 샘플을로드합니다. </li><li> 1 분 동안 12,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 1 분 동안 12,000 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기 상에 남아있는 750 μL를로드합니다. </li><li> 프리 워시를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 각 스핀 컬럼 및 원심 분리기 400 μL RNA 준비 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 첫 번째 세척를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 각 스핀 컬럼 및 원심 분리기 800 μL RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 두 번째 세척를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 열 원심 분리기를 회전 400 μL RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 건조 스핀를 들어, 2 분 동안 12,000 XG에 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거하는 스핀 컬럼을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 스핀 컬럼을 전송합니다. </li><li> 스핀 컬럼 상에 25 μL의 용출 완충액을 첨가하고 실온에서 1 분 동안 배양한다. 이 컬럼으로부터 RNA 바이러스의 회수를 증가시킬 것이다. </li><li> 1 분 동안 10,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리하여 RNA를 수집합니다. </li><li> 어느 -70 ° C에서 RT-qPCR에 (6 단계) 또는 저장 RNA에 직접 진행합니다. </li></ol> 6. 유전자형 I의 Mutiplex RT-qPCR에 탐지 및 II Noroviruses 및 Coliphage MS 2 (보충 표 2) <ol><li> 청소 작업 표면 pipettES,의 RNase의 오염 제거 용액와 원심 분리기는 오염 가능성을 줄일 수 있습니다. </li><li> 얼음에 RT-qPCR에 시약을 녹여. (별도의 영역 / 방에) 얼음에 해동 RNA. </li><li> 반응의 수를 결정하고 적어도 10 % 이상을 추가 (열 반응이 필요한 경우, 예를 들면, 11의 마스터 믹스를 확인). </li><li> 5 초 동안 25 배 RT-qPCR에 효소를 제외 소용돌이 개별 마스터 믹스 구성 요소. 조심스럽게 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 효소를 혼합한다. </li><li> 5 초 동안 간단히 원심 분리기 마스터 믹스 구성 요소. </li><li> 키트 지침에 따라 노로 바이러스 GI과 GII의 실시간 RT-PCR 검출을위한 마스터 믹스를 준비하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관 (보충 표 3)에서 노로 바이러스 특이 적 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 추가합니다. </li><li> 위아래로 5 ~ 10 회 피펫 팅하여 마스터 믹스 믹스 (텍싱하지 않는 것이 좋습니다). 실시간 PCR을 96 웰 플레이트의 각 웰에서의 마스터 믹스를 22 μL 분취. </li><li> 소용돌이 샘플 RNA5 초 동안, 그리고 짧은 (5 초) 원심 분리하여 수집합니다. </li><li> RT-qPCR에 판 (표 2에서 템플릿을 따라)에 샘플 RNA와 GI과 GII 양성 대조군의 3 μL를 추가합니다. 노 템플릿 제어 (NTC) 우물에 클레아 제-freewater의 3 μL를 추가합니다. </li><li> 광학 접착제 필름 실시간 플레이트를 밀봉. </li><li> 1 분 웰에 존재할 수있는 임의의 기포 또는 액체 방울을 제거하기 위해주의 깊게 1300 XG에서 실시간 플레이트를 원심 분리. </li><li> 10 분 동안 1) RT 단계 : 실시간 PCR 장비 및 설정 다음 열 순환 조건을 설정합니다. Taq 중합 효소의 45 ° C (2) 활성화, 10 분에서. 95 ° C에서 및 (3) 95 ℃에서 15 초간 45 사이클, 그리고 60 ℃에서 60 초. </li></ol> 면봉 샘플에서 노로 바이러스의 7 정량화 <ol><li> RT-qPCR의 결과 (보충 표 3)의 유효성을 검사 양성 및 음성 대조군의 결과를 확인합니다. </li><li> 각각의 표준 곡선이 사항을 만족하는지 확인사용할 수있는 값은 보조 표 2에 주어진 수학 식 (1)를 사용하여 표준 곡선의 전체 표준 편차를 계산합니다. (식 1) %의 효율 = 100 × 10 (평균 코네티컷 값 절편) / 경사. </li><li> PCR을 열 순환기 소프트웨어는 각각의 표준 곡선에 대한 기울기를 계산하지 않으면 기울기 R 통계 소프트웨어를 이용하여 회귀 2 값 (예를 들어 엑셀, SPSS 또는 SAS)를 결정한다. 또한, 방정식 나는 다음과 같은 표준 곡선에 대한 %의 효율을 계산 </li><li> 보충 표 4에 명시된 기준에 맞는 표준 곡선에 기초하여 모든 테스트 샘플에 대한 열 순환기 소프트웨어에 의해 산출 된 RNA 카피 수를 기록한다. 기준을 충족하거나 거짓 양성 대조군이없는 표준 곡선 t 모자와 함께 어떤 샘플을 다시 실행하십시오. PCR 억제를 모니터링 할 수있는 내부 통제로 추가 된 coliphage MS2의 코네티컷 값을 확인합니다. </li><li> RNA 카피 (P)의 총 개수를 결정는 RT-qPCR의 반응에 사용 된 RNA (3 μL 5)의 것과 총 RNA의 용출 부피 (25 내지 50 μL)의 비율로 단계 7.2에서 계산 된 RNA 복사 개수를 곱하여 ER 샘플. 대안 적으로, 분석 대상물의 표면적 (cm 2)에 의해 총 RNA 복사 개수를 분할함으로써 RNA 농도를 계산한다. </li></ol> 헤미 중첩 된 기존의 PCR 증폭에 의해 실시간 RT-PCR 긍정적 인 샘플의 8 유전자형 <ol><li> RT-PCR 분석의 각 프라이머 세트에 대한 마스터 믹스의 첫 번째 라운드를 준비합니다 (보충 표 2, 5). </li><li> 마스터 믹스 20 μL에 노로 바이러스 양성 RNA의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 다음과 같은 조건에서 RT-PCR을 실행하여, (1) 실온에서 95 ° C에서 Taq 중합 효소의 42 ° C (2) 활성화, 15 분에서 30 분 동안 단계, 및 (3) 95 ℃에서 30 초, 40주기 50 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 60 초. 40 사이클 후, 72 ℃에서 추가로 10 분 동안 배양한다. </li><li>RT-PCR 분석 각각의 프라이머 세트 (보충 표 2와 5)에 대한 이잖아요 믹스의 두 번째 라운드를 준비합니다. </li><li> 23 μL 마스터 믹스를 추가하고 각 튜브 (이상적으로 1 차 제품의 RNase없는 물에 1/10 희석한다)에 (첫 라운드에서) 1 라운드 RT-PCR 제품의 2 μL를 추가합니다. </li><li> 단계를 반복 8.3. </li><li> (PH 8.3에서 40 mM 트리스, 20 mM의 아세트산 및 1 mM의 EDTA) 100 ㎖ 1X 트리스 - 아세테이트 EDTA 2 % 아가 로스 겔을 제조. 전자 레인지의 혼합물을 가열하여 아가로 용해한 후, 60 ~ 70 ℃로 냉각 한 후, 혼합물을 제조 된 겔을 100㎖ 당 핵산 얼룩 10 μL를 추가 겔 붓고 콤 삽입. 겔은 적어도 30 분 동안 정착하자. </li><li> 6X 로딩 염료 3 μL 각 RT-PCR 생성물의 15 μl를 섞는다. 로드 각 시료 15 μL 및 1 시간 동안 100 V의 아가로 오스 겔 electrophorese. </li><li> 겔에서 적절한 크기 (GI 330 BP와 GII 341 BP)의 소비세 대상 RT-PCR 단편상업적 겔 추출 키트를 사용하여 RNA를 정제 거라고. 정제 된 PCR 생성물은 이제 생거 시퀀싱에 사용될 수있다. </li></ol>

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Authors have no conflicting interest. The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the official position of the Centers for Disease Control and Prevention.

Noroviruses 18 10 3 바이러스 입자 20 ~ 50 %의 인간 감염 복용량을 가지고있다. 따라서, 표면도 낮은 수준의 오염은 공중 보건 위험을 초래할 수 있습니다. 내부 대조군으로서 추출 운송 중 1) 면봉 다른 재료, 2) 저장 조건 면봉 3) 바이러스 성 RNA 농도, 4) coliphage MS2 : 면봉 샘플링 프로토콜의 여러 측면을 포함하여 평가 하였다. 최근까지,면, 폴리 에스테르, 나일론 등) 닦아 대전에서 만든 면봉의 성능을 평가했다 및 필드 사용 13, 14, 15, 21, 22에 대해 제안했다. 이들 중, 면봉은 노로 바이러스 간염 음식 준비 표면과 fomites (23)로부터의 바이러스의 검출을위한 ISO 15216 프로토콜에 의해 권장되고있다. 방법지금까지 자주 noroviruses (24), (25)의 전송에 연루되어 같은 문 손잡이, 컴퓨터, 변기 큰 하이 터치 표면 필드 조건에서 면봉의 테스트 성능에 제한적인 데이터가있다. 또한 이러한 환경면의 크기는 섬유로 만들어진 면봉의 용량을 초과한다. 우리의 연구에서, 우리는 700cm 2까지 지역과 환경 표면을 샘플링 할 때 섬유 팁 면봉보다 더 큰 면봉 머리를 macrofoam 면봉은, 인간의 노로 바이러스에 대한 높은 회수율을 가지고 있음을 보여 주었다. 솔루션 Noroviruses은 주위 온도에서 상대적으로 불안정하고 적어도 냉각에 필요합니다. 따라서, 실험실에 배송비는 면봉의 수집 후 48 시간 이내에 0-4 ° C에서 발생한다. 일반적으로 PCR 반응에서 테스트 될 수있는 샘플의 부피의 양보다 훨씬 작다샘플 농도 않고, 크게 양성 속도를 감소, 면봉 (5 ~ 10 mL의 대 3-5 μL)에서 용출 후. 환경 바이러스학에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 환경 물 다량의 바이러스를 농축 성공적으로 사용되어왔다. 그러나, 최대 10 ㎖에 볼륨을 쉽게 추출하여 250 μL의 낮은 볼륨에 미디 스핀 열을 사용하여 농축하고, 더 높은 복구를 사용하여 스핀 열이 10 배 농축 될 수있다. RT-qPCR에 민감한 탐지 및 노로 바이러스의 정량화를위한 ​​골드 표준이기는하지만,이 분석의 민감도는 쉽게 면봉 샘플로부터 공동 추출 PCR 억제제의 존재에 의해 영향을받을 수있다. 따라서 MS2뿐만 아니라 둘 노로 바이러스를 검출하는 멀티 플렉스 PCR 형식 이러한 coliphage MS2 바이러스 입자로서 추출 제어의 포함은 PCR 억제의 존재를 모니터링하고 다른 실험 간의 변동을 평가하는 것을 돕는다. &lt;/ P&gt; 실험실 검증 방법의 시험 변수는 시험 방법의 차별적 전력을 결정하는 것이 중요하며, 상기 방법의 가능성 필드 샘플링 성능으로 변환된다. 실제 필드 상태를 가지고 (예를 들어, 최대 700cm (2)의 큰 표면적 지연 샘플링) 계정으로는, 노로 바이러스에 대한 검출 한계는 3.4 로그 (10) (스테인레스) 및 4- 로그 10 (변기) 면당 복사 노로 채취 6. 따라서, 부정적인 면봉 결과는 더 바이러스 오염이 발생하지 않습니다 것을 확정되지 않습니다. 노로 바이러스 질병의 임상 및 역학적 정보는 항상 6, 환경 조사 결과 2를 압도. 유람선에서 우리의 데이터는 전화기, 컴퓨터 키보드, 문 등의 하이 터치 표면이 통나무 집 어디 사람 노로 바이러스에 양성 반응을 처리하는 보여 주었다보고 된 바이러스 성 위장염이 머물렀다. 이들 표면은 화장실 수세 또는 구토 에피소드 6, 7, 8, 9, 10 중 제조 방울 통해 간접적으로 직접적인 접촉을 통하여 오염 된 또는 하나. 임상 샘플이 가능하고 세정 방법의 유효성을 모니터링하지 않을 때 결론적 발생시 환경 오염의 수준을 결정하는데 도움이 될 수 새롭게 개발 면봉 프로토콜을 사용하여 환경 표면 노로 바이러스의 검출은, 바이러스를 검출한다. 섬유 (예를 들면 로타 바이러스 및 아데노 바이러스) 27, 28, 29면 샘플링 방법이 널리 다른 장내 바이러스를 조사하기 위해 사용 된 기초 면봉 (면과 레이온)를 스쳐. 높은 고려그 섬유를 통해 macrofoam 면봉의 노로 바이러스에 대한 회수 효율은 우리가 macrofoam 면봉뿐만 아니라 다른 장내 바이러스를 감지 할 수있을 것으로 예상, 면봉 6을 냈습니다.

<html> 인간의 noroviruses는 전염병과 산발적 급성 위장염 전 세계적으로 1, 2, 3의 주요 원인이다. 이 바이러스는 매우 전염성이 전송은 사람의 상호 작용으로 또는 간접적으로 오염 된 음식, 물 또는 환경 표면과 접촉을 통해 직접 사람을 통해 발생합니다. Noroviruses는 장시간 흘리고 연장 환경면에서의 바이러스 생존 1, 2, 3에 설명 된 수있다. 피크 흘리는 동안 바이러스 입자 수십억 대변 그램 당 방출하고, 구토 같은 감염 4, 5, 6, 7, 8 일으키는 바이러스 입자의 충분한 개수를 포함EF &quot;&gt; 9,10. 또한 무생물 표면과 사람의 피부의 바이러스의 이동이 발생하기 쉬운 2, 11, 12. 따라서, 환경 오염의 모니터링이 발생 조사 돕기 및 정화의 효과를 평가할 수 있으며 소독 절차. 몇몇 환경 샘플링 프로토콜 로타 바이러스의 검출에 대해 설명되었지만, coliphage MS2, 고양이 calicivirus (FCV) 및 박테리오파지 P22 13, 14, 15, 16. 그러나, 고속 탈수 (&lt;1 시간) 작은 표면적을 포함하여이 연구에 기술 검증 조건 (25 X 100cm 2), 적절 필드 설정을 표현하지 않을 수 있습니다. 또한 ENVIRO 낮은 오염 수준을 예상nmental 표면은 거의 바이러스 입자를 감지 할 수있는 프로토콜을 필요로한다. 우리는 노로 바이러스의 검출 및 입력을위한 macrofoam 기반 표면 샘플링 방법을 개발했다. 이 방법은 여러 노로 바이러스 발생시 검증되었습니다. 프로토콜이 포함 1) (2) 최선의 방법 실험실에 수집 및 운송 중에 샘플의 무결성을 유지하고, 노로 바이러스 3) 실험실 테스트 및 타이핑 환경면에서 면봉 샘플을 수집하는 방법에 대해 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Generic name for kits</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macrofoam swab</td>
			<td>Premoistened EnviroMax Swab kit&#160;</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>2588060PFUW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;RNA Lysis buffer&#160;</td>
			<td>CDC UNEX buffer</td>
			<td>Microbiologics</td>
			<td>Cat No MR0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA extraction spin column</td>
			<td>Midi column</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>Cat No R6664-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">RNA purification spin column</td>
			<td>Zymol RNA Clean and Concentrator kit&#160;</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>Cat No R1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Real time RT-PCR kit</td>
			<td>AgPath kit One-Step RT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat No 4387391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conventional RT-PCR kit</td>
			<td>Qiagen one step RT-PCR kit</td>
			<td>Qiagen kit</td>
			<td>Cat No 210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen kit</td>
			<td>Cat No 28704 or 28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;"></td>
			<td>Coliphage MS2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Cat No 15597-B1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;"></td>
			<td>RNA run-off transcripts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:285px;">Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;"></td>
			<td>Realtime PCR platform</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model ABI 7500</td>
			<td style="width:285px;">GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 &#215; 106 copies/ &#956;l, and stored at &#8722;80&#176;C with 1.0 U /&#956;l RNasin (Promega, Madison, WI).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td>Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat No 4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp;showAddButton=true&amp;productID=4306311&amp;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx%0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D&amp;returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp Clear Adhesive Film&#160;</a></td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat No 4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swab sampling method for the detection of human norovirus on surfaces

인간의 noroviruses는 전염병이 전 세계적으로 산발적 위장염의 주요 원인입니다. 대부분의 감염이 어느 환경 표면 또는 음식을 통해 간접적으로 개인 대 개인 경로를 통해 직접 전파 또는 때문에, 오염 fomites과 무생물 표면은 노로 바이러스의 발생시 바이러스의 확산을위한 중요한 차량이다. 우리는 개발 검출 및 하드 표면에서 인간의 noroviruses의 입력에 대한 macrofoam 면봉을 사용하여 프로토콜을 평가 하였다. 섬유로 만들어진 면봉 또는 정전기 방지 물티슈에 비해 macrofoam 면봉는 최대 700cm 2의 변기 표면에서 바이러스 복구 (범위 1.2-33.6 %)을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 스핀 열을 사용하여 바이러스 성 RNA의 면봉에서 바이러스의 추출과 더 집중하는 단계를 포함한다. 노로 바이러스 위장염이 있었다 유람선 및 장기 요양 시설의 표면에서 수집 한 217 면봉 샘플의 총, 127 (58.5 %)RT-qPCR에 의한 GII의 노로 바이러스 양성 반응보고했다. 이 29 (22.8 %)의 성공적 유전자형을 할 수있다. 결론적으로, 우리는 임상 샘플을 사용할 수없는 경우 바이러스의 검출뿐만 아니라 발생시 환경 오염의 수준을 결정하는데 도움이 될 수 개발 된 프로토콜을 사용하여 환경 표면 노로 바이러스의 검출; 또한 치료 전략의 효과의 모니터링을 용이하게 할 수있다.

도 1은 면봉 샘플링 프로토콜의 흐름도를 나타낸다. 이 프로토콜은 네 가지 주요 단계로 구성; 1) 샘플 수집, 2) 시료의 저장 및 수송, 3) 바이러스 성 RNA의 정제 및 농도 4) RT-qPCR의 분석 및 유전자형. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> 그림 1 : 노로 바이러스의 환경 표면 샘플링에 대한 최종 프로토콜의 차트 흐름 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55205/55205fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 표 1은 항해 중 의심되는 노로 바이러스 위장염의 사례를보고했다 유람선에서 수집 된 34 면봉 샘플의 결과를 요약 한 것입니다. 면봉 표본 추출 하였다 TE멀티 플렉스 실시간 RT-qPCR에 의한 노로 바이러스에 대한 중복 STED. 세븐틴 (18.5 %) 샘플은 노로 바이러스의 증상이있는 승객이 배에 공용 공간에서 체재하고 9했다 통나무 집의 표면에서 8 샘플을 포함 양성. 샘플 당 게놈 사본의 수는 노로 바이러스 GII.7 RNA 전 사체의 표준 곡선을 사용하여 (16 31였다) 중부 표준시 값으로부터 계산 하였다. 공통 영역 (범위 : 1.2-2.1 로그 10 게놈 사본)의 게놈 복사본보다 유의하게 높았다 - (4.5 로그 (10) RNA로 복사 2.4 범위), (통나무 집에서 면봉 샘플에서 게놈 사본의 평균 수는 3.6 로그 10 살 P &lt;0.001). 17 긍정적 면봉 샘플 포 (23.5 %)의 유전자형을 할 수 있었고, 모든 샘플이 동일 GII.1 서열을 가졌다. <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 위치 환경 스왑 모은 </td><td><strong&gt; 샘플 포인트 설명 </td><td> 코네티컷 평균 값 (시험 샘플의 총 수의 양 #) </td><td> 유전자형 </td><td> 노로 바이러스 RNA는 샘플 영역 C에 따라 번호를 복사 </td></tr><tr><td> 아트리움 </td><td> 손잡이 </td><td> 34.3 (1/2) </td><td> GII </td><td> (16) </td></tr><tr><td> 캐빈 A를 </td><td> 변기 </td><td> 31.4 (2/2) </td><td> GII. 비 </td><td> 31217 </td></tr><tr><td> 캐빈 A를 </td><td> 수도꼭지 </td><td> 37.5 (1/2) </td><td> GII </td><td> 491 </td></tr><tr><td> 캐빈 A를 </td><td> 문 손잡이 </td><td> 35.0 (2/2) </td><td> GII </td><td> 2,675 </td></tr><tr><td> 캐빈 A를 </td><td> 리모콘 </td><td> 38.6 (2/2) </td><td> GII.1의 B </td><td> (233) </td></tr><tr><td> 캐빈 B </td><td> 변기 </td><td> 33.5 (2/2) </td><td> GII.1의 B </td><td> 986 </td></tr><tR&gt; <td> 리도 </td><td> 아이스크림 기계 </td><td> 34.2 (2/2) </td><td> GII </td><td> (16) </td></tr><tr><td> 리도 </td><td> 표 양념 </td><td> 35.2 (1/2) </td><td> GII </td><td> (15) </td></tr><tr><td> 리도 </td><td> 테이블 탑 </td><td> 35.3 (1/2) </td><td> GII </td><td> (14) </td></tr><tr><td> 피자 집 </td><td> 카운터 표면 </td><td> 35.7 (1/2) </td><td> GII </td><td> (14) </td></tr><tr><td> 메인 갤리 </td><td> 재미있는 시간 기계 </td><td> 37.1 (1/2) </td><td> GII </td><td> (64) </td></tr><tr><td> 자판기 </td><td> 만질 표면 </td><td> 38.8 (1/2) </td><td> GII </td><td> (18) </td></tr><tr><td> 승무원 라운지 </td><td> 키보드 표면 및 마우스 </td><td> 36.8 (1/2) </td><td> GII </td><td> (80) </td></tr><tr><td> 캐빈 C </td><td> 수도꼭지와 문 손잡이 </td><td> 31.6 (2/2) </td><td> GII.1의 B </td><td> 26458 </td></tr><tr><td> 캐빈 C </td><td> 전화 </td><td> 36.4 (2/2) </td><td> GII </td><td> 1,035 </td></tr><tr><td> 캐빈 C </td><td> 건반 </td><td> 33.0 (2/2) </td><td> GII </td><td> 1,317 </td></tr><tr><td> 의료 센터 </td><td> 클립 보드 </td><td> 36.0 (2/2) </td><td> GII </td><td> (113) </td></tr><tr><td> 오두막 A는, B와 C는 바이러스 gastoenteristis 증상과 임상 적으로 병이 있었다 개인에 의해 점령되었다. </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> B 17 GII 양성 면봉 샘플 중 4 유전자형을 할 수있다. </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> C RNA 복사본은 노로 바이러스의 GII.7의 RNA 전 사체의 표준 곡선에 따라 caluated했다. </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> 참고 : 날짜보다 약간 원래의 제 6 조에서 수정되었습니다. </td><td></td><td&gt; </td></tr></tbody></table> 표 1 : 항해 중 의심되는 노로 바이러스 위장염의 사례를보고했다 유람선에서 수집 된 34 면봉 샘플의 결과. 도 2는 RT-qPCR에 이들 샘플 시퀀스 능력에 의해 결정 코네티컷 값의 관계를 나타낸다. 총 127 (217) 중 면봉 샘플은 RT-qPCR에 의한 GII의 노로 바이러스 양성 반응. 샘플은 코네티컷 값의 넓은 범위 (12-40)을 디스플레이. 총, RT-qPCR에 긍정적 인 샘플의 29 (22.8 %)의 유전자형을 할 수있다. 코네티컷 값 27 이하 및 28 ~ 31 사이의 범위와 면봉 샘플은 각각 100 %와 72.2 %의 비율로 유전자형했다. 대조적으로, 단지 22.0 % 및 32-36 및 37-40의 코네티컷 값이 면봉 샘플의 1.6 %는, 각각 성공적으로 시퀀싱 될 수 헤미 중첩 증폭 물을 생산했다. 그림 2 : RT-qPCR에 검사 및 확인 노로 바이러스 발병 동안 수집했다 면봉 샘플 시퀀싱 결과. 흰색 막대는 RT-qPCR에 긍정적 면봉 샘플 바이러스의 개수를 나타낸다. 그 RT-qPCR에 긍정적 인 샘플에서 인간의 노로 바이러스 핵산 헤미 - 중첩 된 PCR 분석을 사용하여 증폭 한 다음 유전자형의 확인을 위해 서열했다. 블랙 바, 라인 수 및 유전자형의 비율이 각각 면봉 샘플을 확인 나타낸다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55205/55205fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> CT 값 범위 </td><td> RT-qPCR에 긍정적 인 샘플의 수 </td><td> 순서 확인 샘플의 수 (%)을 </td></tr><tr><td> 20-23</td><td> 4 </td><td> 3 (75) </td></tr><tr><td> 24-27 </td><td> 삼 </td><td> 3 (100) </td></tr><tr><td> 28-31 </td><td> (18) </td><td> 13 (72.2) </td></tr><tr><td> 32-36 </td><td> (41) </td><td> 9 (22.0) </td></tr><tr><td> 37-40 </td><td> (61) </td><td> 1 (1.6) </td></tr><tr><td colspan="3"> A) 헤미는 PCR 중첩 </td></tr></tbody></table> 표 2 : RT-qPCR에와 면봉 샘플의 유전자형 결과. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 샘플 수 </td><td> 위치 </td><td> 표면의 설명 </td><td> 표면 면적 (cm 2) </td><td> 시료 채취 날짜 / 시간 </td><td> 청소 (Y / N) </td><td> 정리하면, 어떤 소독제를 사용 하였다 &lt;?&gt; / 강해 </td><td> 표면 재질과 위치의 자세한 설명 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 룸 # 7-1302 </td><td> 변기 </td><td> 700cm 2 </td><td> 2016년 6월 26일; 오전 9시 </td><td> 아니 </td><td> 해당 사항 없음 </td><td> 변기 [상면) 및 하드 plastoc </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 룸 # 7-1330 </td><td> 전화 핸들 </td><td> 500cm 2 </td><td> 2016년 6월 26일; 오전 9시 25분 </td><td> 예 </td><td> 1,000 ppm의 표백제 </td><td> 하드 플라스틱, 고무 버튼 </td></tr></tbody></table> 보충 표 1 : 샘플 설명 양식의 예. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 유전자형 / 바이러스 </td><td> 이름 올리고 뉴클레오티드 프라이머 / 프로브 </td><td> 순서 5 → 3 &amp; #(900); </td><td> 참고 </td></tr><tr><td rowspan="5"> 미군 병사 </td><td> Cog1F </td><td> CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA </td><td> (17) </td></tr><tr><td> Cog1R </td><td> CTT AGA CGC 고양이 고양이 CAT TYA C </td><td> (17) </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA </td><td> (17) </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> CCA ACC의 CAR CCA TTR TAC </td><td> (17) </td></tr><tr><td> Ring1E 프로브 </td><td> FAM - TGG ACA GGR 게이 CGC - MGBNFQ a를 </td><td> 이 연구 </td></tr><tr><td rowspan="5"> GII </td><td> Cog2F </td><td> CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td><td> (17) </td></tr><tr><td> Cog2R </td><td> TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA </td><td> (17) </td></tr><tr><td> Ring2 프라이머 </td><td> TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT </td><td> (17) </td></tr><tr><td> G2SKR </td><td> CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT </td> &lt;TD&gt; (17) </td></tr><tr><td> Ring2 프로브 </td><td> CY5 또는 QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2의 B </td><td> (17) </td></tr><tr><td rowspan="3"> MS2 </td><td> MS2F </td><td> TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG </td><td> (18) </td></tr><tr><td> MS2R </td><td> GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C </td><td> (18) </td></tr><tr><td> MS2P 프로브 </td><td> HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1의 C </td><td> (18) </td></tr><tr><td colspan="4"> GI의 TaqMan 프로브는 6 카르복시 (FAM)와 3&#39;-표시 MGBNFQ (마이너 - 홈 결합 부위)와 함께-5&#39; 표지 </td></tr><tr><td colspan="4"> B GII의 TaqMan 프로브 Cy5에 또는 퀘이사 (670)과 함께 5 &#39;가 표지되어 3&#39;-라벨 블랙 홀 끄는와; 이용 가능 여부에 따라 사용되는 블랙 홀 소광 (BHQ)이 2, BHQ 3가 바람직하다. </td></tr><tr><td colspan="3"> C MS2의 TaqMan 프로브 5R입니다(17);로 표지 된 HEX 및 BHQ1와 5&#39;-표시 </td><td></td></tr></tbody></table> 보충 표 2 : 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 프로브 정보를 제공합니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 반응에 따라 볼륨 (μL) </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 배 RT-PCR 버퍼 * </td><td> 12.5 </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td> 클레아없는 물 * </td><td> 1.08 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 검출 증강 * </td><td> 1.67 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 코그 층 (10 μM) </td><td> 1 </td><td> 400 nm의 </td></tr><tr><td> 코그 1R (10 μM) </td><td> 1 </td><td> 400 nm의 </td></tr><tr><td> 링 1E-프로브 (10 μM) </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm의 </td></tr><tr&gt; <td> 코그 2 층 (10 μM) </td><td> 1 </td><td> 400 nm의 </td></tr><tr><td> 코그 2R (10 μM) </td><td> 1 </td><td> 400 nm의 </td></tr><tr><td> 링 2 프로브 (10 μM) </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm의 </td></tr><tr><td> MS2F (10 μM) </td><td> 0.25 </td><td> 100 nm의 </td></tr><tr><td> MS2R (10 μM) </td><td> 0.25 </td><td> 100 nm의 </td></tr><tr><td> MS2P 프로브 (10 μM) </td><td> 0.25 </td><td> 100 nm의 </td></tr><tr><td> 배 RT-PCR 효소 * </td><td> 1 </td><td> 1 배 </td></tr><tr><td> 마스터 믹스 볼륨 </td><td> (22) </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> * 실시간 RT-PCR 키트에 포함 </td></tr></tbody></table> 보충 표 3 : 다중 실시간 GI / GII / MS2 노로 바이러스 RT-PCR을위한 마스터 믹스 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 컨트롤의 종류 </td><td colspan="2"> 결과 해석 </td></tr><tr><td rowspan="6"> 견본 </td><td> 음성 대조군 </td><td colspan="2"> 부정적인해야한다 </td></tr><tr><td> 양성 대조군 </td><td colspan="2"> 긍정적이어야한다 </td></tr><tr><td> 부정적인 샘플 </td><td colspan="2"> 각 코네티컷 값이 GI / GII에 대한 발견 할 수없는 경우 샘플 음 </td></tr><tr><td> 긍정적 인 샘플 </td><td colspan="2"> 모두 복제의 CT 값 (GI / GII)은 &lt;38; 이것은 (임의로) 컷오프 각 실시간 PCR 플랫폼 및 키트 실험적으로 결정되어야 </td></tr><tr><td> 미정 양의 샘플 </td><td> 샘플은 하나의 복제의 코네티컷 값 (GI / GII) 인 경우 임시 긍정적이다 &lt;38 </td><td></td></tr><tr><td> 내부 프로세스 제어 (MS2) </td><td colspan="2"> ≥32 F의 임계 사이클 샘플 (CT) 값또는 MS2는 희석 재검사해야하며 1/10 희석. </td></tr><tr><td></td><td> 매개 변수 </td><td> 허용되는 값 </td><td></td></tr><tr><td> 표준 곡선 노로 바이러스의 RNA 전 사체를 사용하여 </td><td> R 2 </td><td> &gt; 0.97 </td><td></td></tr><tr><td> 능률 </td><td> 115 % 90 % </td><td></td></tr></tbody></table> 보충 표 4 : 환경 면봉 샘플에서 노로 바이러스의 검출을위한 각각의 RT-qPCR에 시험에 포함 제어합니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 최종 농도 </td><td> 권 / RXN (μL) </td></tr><tr><td> 배 RT-PCR 버퍼 </td><td> 1 배 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> 의 dNTP 믹스 (10 mM)을 </td&gt; <td> 0.4 밀리미터 </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> 효소 믹스 (RT와의 Taq) </td><td></td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> 앞으로 프라이머 </td><td> 0.5 μM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 역방향 프라이머 </td><td> 0.5 μM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 의 RNase 억제제 (20 U / μL) </td><td> 20 U </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> 의 RNase없는 물 </td><td></td><td> 11.00 </td></tr><tr><td> 총 양 </td><td></td><td> 20.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> 앞으로 및 GI과 GII 그룹에 대한 프라이머 세트를 역은 각각 Cog1F + G1SKR 및 Cog2F + G2SKR 있습니다. </td></tr><tr><td> 두 번째 라운드 RT-PCR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 최종 농도 </td><td> 권 / RXN (μL) </td></tr><tr><td> 배 RT-PCR 버퍼 &lt;<html> / TD&gt; <td> 1 배 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> 의 dNTP 믹스 (10 mM)을 </td><td> 0.4 밀리미터 </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> 효소 믹스 (RT와의 Taq) </td><td></td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> 앞으로 프라이머 나 </td><td> 0.5 μM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 역방향 프라이머 나 </td><td> 0.5 μM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> 의 RNase 억제제 (20 U / μL) </td><td> 20 U </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> 의 RNase없는 물 </td><td></td><td> 14.00 </td></tr><tr><td> 총 양 </td><td></td><td> 23.0 </td></tr><tr><td colspan="3"> B 앞으로 GI과 GII 그룹에 대한 프라이머 세트를 역은 각각 G1SKF + G1SKR 및 Ring2 프라이머 + G2SKR 있습니다. </td></tr><tr><td> 참고 : 안내 전화보다 약간 원래의 제 19에서 수정 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; 보충 도표 5 : 헤미 - 중첩 된 RT-PCR 마스터 믹스 :&quot;유지 - together.within 페이지를 = FO &quot;_content. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="4"> 위상 I </td><td rowspan="4"> 이 필드를 샘플링 </td><td> 1. macrofoam 면봉 키트 (예를 들어, 유효 기간, 튜브 누설 및 면봉 습기) </td></tr><tr><td> 2. 면봉 표면 (제한 표면적 ≤100 인치 2 (645cm 2)에) </td></tr><tr><td> 3.는 전송 튜브에 면봉 및 운송 중에 누출 방지 안전 캡을 조 </td></tr><tr><td> 애 가방에서 4. 면봉 키트 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 단계 II </td><td rowspan="2"> 샘플 운송 및 보관 </td><td> 1. 샘플링 면봉이 저장되는 -70 ° C ~ (또는 -20 ° C) </td></tr><tr><td> 2. 운반 면봉수집 면봉의 48 시간 내에 절연 컨테이너 선박에 0-4 ° C (콜드 팩)에서 실험실에 샘플 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 단계 III </td><td rowspan="2"> RNA의 etraction </td><td> 1. 용해 완충액 (예를 들면, 유효 데이터) </td></tr><tr><td> 2. 100 % 에탄올을 추가하기 전에 용해 버퍼에 내부 통제로 MS2 추가 </td></tr><tr><td rowspan="2"> RNA 정제 및 농축 </td><td> 3. 면도 실험실 벤치 RNA의 RNase 제거 용액을 이용하여 소형 장치 </td></tr><tr><td> RNA의 교차 오염을 방지하기 자주 단계 중 4. 변경 장갑 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 단계 IV </td><td rowspan="2"> RT-PCR 분석 (QA / QC) </td><td> 1. 각 PCR 실행을위한 코네티컷 값의 변화를 제어하기 위해 각각의 RT-qPCR에 분석을위한 정량 노로 바이러스의 전사 RNA를 (GI과 GII)를 포함 </td></tr><tr><td> 2.PCR 억제제의 존재를 모니터링하는 MS2 신호의 부재를 사용하여 </td></tr></tbody></table> 보충 도표 6 : CDC의 환경 샘플링 절차에 대한 점검.

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Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.5K 조회수.  Centers for Disease Control and Prevention. A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces. 

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

연구

면역학 및 감염병학

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

운동 유발성 Apoptosis 림프구의 결정을위한 손가락 - 스틱 혈액 샘플링 방법론

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

손쥐 노로 바이러스에 대한 상패 분석

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

의 검출을위한 자석 교반기 방법<em&gt; 선모충</em근육 샘플에서&gt; 애벌레

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...