The authors have no acknowledgements.

フィールド1.スワブサンプリング<ol><li>手袋のきれいなペアを着用してください。 </li><li>測定テープや定規を用いて表面に触れることなくサンプリング領域のサイズを測定します。できるだけ正確に面積を推定し、報告書（補足表1）を記入してみてください。 </li><li>可能な漏れやラベルサンプル輸送バッグや綿棒キット用綿棒キットを確認してください。 </li><li>水平方向に1ストローク、垂直方向に1ストローク、および斜め方向の1ストロークを次のようにサンプリングエリア全体に綿棒を移動します。 700センチメートル2よりも大きな表面積を綿棒ないでください。 </li><li>チューブに各綿棒を置き、しっかりとキャップを締めます。 </li></ol>研究室への綿棒の2貯蔵および輸送<ol><li>最大48時間、4℃で綿棒を保管してください。長期間保管が必要な場合は、-20℃でスワブを格納する（または-70°C）。 </li><li> すなわち、（0-4℃でチューブを保ちます。 、コレクションの24〜48時間以内に研究室や船への輸送の間に断熱容器に）コールドパックを使用します。 </li></ol> 3.ウイルス濃度、ウイルスRNA抽出および精製注：特に明記しない限り、すべての遠心分離工程は、室温で5分間、5000×gでテーブルトップ遠心機を使用しています。ユニバーサル核酸抽出（UNEX）緩衝液を用いて作業する場合、余分な注意が必要です。ゴーグルまたはフェイスシールドを着用してください。 <ol><li> 1 15 mLチューブと各サンプルに対して1つのRNA Midiカラムにラベルを付けます。各実験における負の抽出制御が含まれます。 </li><li> 10スワブのための溶解液を調製し、PBSTの25ミリリットル（PBS pH7.2の0.02％のTween-80を含む）でUNEXバッファの25ミリリットルを混ぜます。 </li><li>溶解液の50 mLに大腸菌ファージMS2懸濁液（10 6 PFU /μL）の50μLを追加します。 </li><li> 15 mLチューブに綿棒を置き、5ミリリットル溶解液を追加します。混合し、室温で10分間インキュベートします。 </li><li>10秒のための各チューブ、ボルテックスに5ミリリットルの100％エタノールを追加します。 </li><li>慎重に余分な液体を除去した後、綿棒を破棄するために、チューブの側面に軽く押す（これはUNEXのバッファが含まれている）15 mLチューブから綿棒を削除します。残りのボリュームは9-10 mLの間であるべきです。 </li></ol> 4. Midiカラムウイルス核酸の抽出<ol><li>慎重ミディカラム、遠心分離器の上にステップ3.6から4.5 mLのUNEX /エタノール混合物を転送し、ろ液を捨てます。 </li><li>同じ混合物から別の4.5 mLを同じ列、遠心分離機にロードし、ろ液を捨てます。 </li><li>最初の洗浄のための、ミディカラムに70％エタノールの3.5ミリリットルを追加し、遠心分離し、ろ液を捨てます。 </li><li>第二の洗浄のために、ミディカラムに70％エタノールの別の3.5ミリリットルを追加します。ろ液を遠心分離し、廃棄します。 </li><li>ドライスピンのために、（マイナスのウイルスRNAの回収率に影響を与える可能性がある）エタノールのすべての痕跡を除去するために、ミディカラムを遠心してください。 </li><li>新しい15ミリリットルの遠心分離管にMidiカラムを配置します。 Midiカラムに250μlの溶出バッファーを追加します。最高のウイルスRNAの回収率を得るために、遠心分離前に1分間待ちます。 </li><li> -70℃で抽出された核酸を保存するか、手順5に即座に進みます。 </li></ol> RNAクリーンとコンセントレータキットを使用したウイルス核酸の5濃度<ol><li>上記のステップ4.7で溶出したRNAと10秒間渦の250μLに結合バッファーRNAの500μLを追加します。 </li><li> 750μLを10秒間100％エタノールと渦を追加します。 </li><li>各サンプルのスピンカラムにラベルを付けます。スピンカラムに750μLのサンプルをロードします。 </li><li> 1分間12,000×gでスピンカラムを遠心します。フロースルーを捨てます。 </li><li> 1分間12,000×gでスピンカラムと遠心上に残りの750μLをロードします。 </li><li>予備洗浄のために、1分間12,000×gで各スピンカラムや遠心に400μLRNAプレップバッファを追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li>最初の洗浄のために、1分間12,000×gで各スピンカラムや遠心に800μLのRNA洗浄バッファーを追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li>第二の洗浄のために、1分間12,000×gで列や遠心分離機を回転するように400μLRNA洗浄バッファーを追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li>ドライスピンのために、2分間12,000×gで、洗浄緩衝液のすべての痕跡を除去するために、スピンカラムを遠心してください。 </li><li>注意深く新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムを移します。 </li><li>スピンカラムに25μlの溶出緩衝液を加え、室温で1分間インキュベートします。これは、カラムからのウイルスRNAの回収率を増加させます。 </li><li> 1分間万×gでスピンカラムを遠心分離することにより、RNAを収集します。 </li><li>どちらか-70℃でRT-qPCRを（ステップ6）、またはストアRNAに直接進みます。 </li></ol> 6. Genogroup IのMutiplex RT-qPCRの検出、およびIIノロウイルス、およびコリファージMS 2（補足表2） <ol><li>クリーンな作業面、pipettES、および汚染の可能性を低減するためのRNase汚染除去溶液で遠心分離機。 </li><li>氷の上でRT-qPCRの試薬を解凍します。 （別の領域/客室内に）氷上で解凍RNA。 </li><li>反応の数を決定し、それらの少なくとも10％以上を追加（10の反応が必要な場合など 、11のためのマスターミックスを作ります）。 </li><li> 5秒間の25倍RT-qPCRの酵素を除き、渦個々のマスターミックスコンポーネント、。慎重に指でチューブをフリックすることにより酵素を混ぜます。 </li><li> 5秒間簡単に言えば遠心マスターミックスコンポーネント。 </li><li>キットの説明書に従って、ノロウイルスGIとGIIのリアルタイムRT-PCR検出のためのマスターミックスを調製し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブ（補足表3）でノロウイルス特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを追加します。 </li><li>上下に5〜10回ピペッティングすることによりマスターミックスをミックス（ボルテックスは推奨されません）。リアルタイムPCR 96ウェルプレートの各ウェル内のマスターミックスのアリコートを22μL。 </li><li>渦サンプルRNA5秒間、および簡単な（5秒）遠心分離によって収集します。 </li><li> RT-qPCRのプレート（ 表2からテンプレートに従ってください）に試料RNAとGIとGII陽性対照の3μLを追加します。無テンプレート対照（NTC）をウェルにヌクレアーゼ-Freewaterのの3μLを追加します。 </li><li>光学接着フィルム付きリアルタイムプレートをシール。 </li><li>注意深くウェル中に存在し得る気泡又は液滴を除去するために1分間、1300×gでリアルタイムプレートを遠心。 </li><li> 10分間1）RTステップ：リアルタイムPCR装置とセットアップ以下の熱サイクル条件を設定します。 Taqポリメラーゼの45℃（2）活性化、10分間。 95℃、（3）95℃で15秒の45サイクル、および60℃で60秒で。 </li></ol>スワブ試料中のノロウイルスの7.定量<ol><li> RT-qPCRの結果（ 補足表3）を検証するために、正と負の対照の結果を確認します。 </li><li>各標準曲線は満たしているかどうかを判断許容可能な値は、補足表2に与えられ、式1を使用して標準曲線の全体的な標準偏差を計算します。 （式1）％効率= 100×10（平均CT値-切片）/傾き 。 </li><li> PCRサーマルサイクラーソフトウェアは各標準曲線の傾きを計算していない場合は、（Excel など 、SPSS、またはSAS）統計ソフトウェアを使用して回帰により傾きとR 2の値を決定します。また、私は次式の標準曲線について％の効率を計算します</li><li> 補足表4で指定された基準を満たす標準曲線に基づいて、すべてのテストサンプル用のサーマルサイクラーソフトウェアによって計算されたRNAコピー数を記録します。基準を満たすか、偽陽性コントロールを持っていない標準曲線tの帽子を持つ任意のサンプルを再実行します。大腸菌ファージMS2のCt値をチェックし、PCR阻害を監視するための内部対照として加えました。 </li><li> RNAコピーpの合計数を決定RT-qPCRの反応に使用されるRNA（3μL5）の総RNA溶出液の量（25〜50μL）の比で段階7.2で計算されたRNAコピー数を乗算することにより、ERのサンプル。代替的に、分析対象物の表面積（cm 2）を、総RNAのコピー数を割ることによってRNA濃度を算出します。 </li></ol>ヘミネストされた従来のPCR増幅によるリアルタイムRT-PCR陽性サンプルの8ジェノタイピング<ol><li> RT-PCRアッセイの各プライマーセットのためにマスターミックスの最初のラウンドを準備します（ 補足表2、および5）。 </li><li>マスターミックスの20μLにノロウイルス陽性のRNAの5μLを追加します。 </li><li>以下の条件でRT-PCRを実行する：（1）RTが95℃で、Taqポリメラーゼの42℃（2）活性化、15分で30分間工程、及び（3）95℃で30秒の40サイクル、50℃で30秒、および72℃で60秒。 40サイクル後、72℃でさらに10分間インキュベートします。 </li><li>RT-PCRアッセイの各プライマーセット（ 補足表2および5）のための母校ミックスの第二ラウンドを準備します。 </li><li> 23μLマスターミックスを追加し、（理想的には、第一ラウンドの製品は、RNaseフリー水で1/10に希釈してください）を各チューブに（最初のラウンドから）2μL第一ラウンドのRT-PCRの製品を追加。 </li><li>繰り返し手順8.3。 </li><li> 100ミリリットル1×トリス - 酢酸EDTA（40 mMトリス、20mMの酢酸、およびpH 8.3で1 mMのEDTA）中の2％アガロースゲルを準備します。 60〜70℃に冷却した後、混合物を調製したゲルの100ミリリットルあたりの核酸染色の10μLを追加し、電子レンジで混合物を加熱することにより、アガロース溶解した後、ゲルを注ぎ、コームを挿入します。ゲルは、少なくとも30分間沈降してみましょう。 </li><li> 6×ローディング色素の3μLで各RT-PCR産物の15μlのを混ぜます。負荷の各サンプル15μL、1時間、100Vでアガロースゲルを電気泳動します。 </li><li>ゲルANから適切なサイズの物品税の対象RT-PCR断片（GIとGIIのための341 bpのための330 bp）の商業ゲル抽出キットを用いてRNAを精製dは。精製したPCR産物は、現在サンガー配列決定のために使用することができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Isakbaeva, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+transmission+on+cruise+ship.">Norovirus transmission on cruise ship.</a> Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).</li><li>Lopman, B. A., Gasta&#241;aduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinj&#233;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+transmission+of+norovirus+gastroenteritis.">Environmental transmission of norovirus gastroenteritis.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).</li><li>Malek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+norovirus+infection+among+river+rafters+associated+with+packaged+delicatessen+meat,+Grand+Canyon,+2005.">Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005.</a> Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).</li><li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+shedding+after+experimental+human+infection.">Norwalk virus shedding after experimental human infection.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).</li><li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+gastroenteritis.">Norovirus gastroenteritis.</a> N. Engl. J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li><li>Park, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+New+Environmental+Sampling+Protocol+for+Detection+of+Human+Norovirus+on+Inanimate+Surfaces.">Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).</li><li>Barker, J., Jones, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+spread+of+infection+caused+by+aerosol+contamination+of+surfaces+after+flushing+a+domestic+toilet.">The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet.</a> J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).</li><li>Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosolization+of+a+Human+Norovirus+Surrogate,+Bacteriophage+MS2,+during+Simulated+Vomiting.">Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting.</a> PloS one. 10, 0134277 (2015).</li><li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+50%+human+infectious+dose+for+Norwalk+virus.">Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus.</a> J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).</li><li>Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+introduction+routes+into+nursing+homes+and+risk+factors+for+spread:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies.">Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centers+for+Disease+Control+Prevention.+Norovirus+outbreak+in+an+elementary+school--District+of+Columbia,+February+2007.">Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).</li><li>Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+prolonged+environmental+survival+of+small+round+structured+viruses.">Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses.</a> J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).</li><li>Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+surface+sampling+methods+for+virus+recovery+from+fomites.">Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).</li><li>Taku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+detection+of+caliciviruses+from+food+contact+surfaces.">Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces.</a> J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).</li><li>Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+swab+sampling+method+for+the+detection+of+norovirus+and+rotavirus+on+artifically+contaminated+food+and+environmental+surfaces.">Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces.</a> Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).</li><li>Herzog, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+recovery+efficiency+for+bacteriophage+P22+on+fomites.">Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).</li><li>Vega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaliciNet:+A+Novel+Surveillance+Network+for+Norovirus+Gastroenteritis+Outbreaks+in+the+United+States.">CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).</li><li>Rolfe, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internally+controlled,+one-step,+real-time+RT-PCR+assay+for+norovirus+detection+and+genogrouping.">An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping.</a> J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).</li><li>Kittigul, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+GII-4+2006b+variant+circulating+in+patients+with+acute+Thailand+during+a+2006-2007+study.">Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study.</a> J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).</li><li>Teunis, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus:+how+infectious+is+it.">Norwalk virus: how infectious is it.</a> J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).</li><li>Wollants, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+norovirus+sampling+method+using+sodium+dodecyl+sulfate/EDTA-pretreated+chromatography+paper+strips.">Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips.</a> J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).</li><li>Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Surface+Sampling+and+Recovery+of+Viruses+and+Non-Spore+Forming+Bacteria+on+a+QMRA+Model+for+Fomites.">The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiology+of+food+and+animal+feed-Horizontal+method+for+determination+of+hepatitis+A+virus+and+norovirus+in+food+using+real-time+RT-PCR.">Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR.</a> International Organization for Standardization (ISO). , (2013).</li><li>Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+to+defining+"high-touch"+surfaces+in+hospitals.">A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).</li><li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+norovirus+outbreak+at+a+long-term-care+facility:+the+role+of+environmental+surface+contamination.">A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).</li><li>Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+recovery+of+viruses+from+water:+a+comprehensive+review.">Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review.</a> Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).</li><li>Gallimore, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+monitoring+for+gastroenteric+viruses+in+a+pediatric+primary+immunodeficiency+unit.">Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).</li><li>Ganime, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+human+adenoviruses+and+rotavirus+species+A+on+fomites+of+hospital+pediatric+units.">Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units.</a> Am J Infect Control. , (2016).</li><li>Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+contamination+of+aerosol+and+surfaces+through+toilet+use+in+health+care+and+other+settings.">Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings.</a> Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).</li></ol>

Authors have no conflicting interest. The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the official position of the Centers for Disease Control and Prevention.

ノロウイルスは18と10 3ウイルス粒子20との間に50％のヒト感染用量を持っています。したがって、表面のも低レベルの汚染は、公衆衛生上のリスクをもたらすことができます。 1）異なるスワブ材料、2）貯蔵条件スワブ輸送の間、3）ウイルスRNAの濃度、及び4）大腸菌ファージMS2内部抽出コントロールとして：スワブサンプリングプロトコルのいくつかの側面を含めて評価しました。 最近まで、綿、ポリエステル、ナイロンなど）ワイプ帯電防止から作られたスワブの唯一の性能が評価されたフィールドの使用13、14、15、21、22のために提案されています。これらのうち、綿棒は、ノロウイルスおよび肝炎食品調理面と媒介物23からのウイルスを検出するためのISO 15216プロトコルによって推奨されています。どうやってこれまで、頻繁にノロウイルス24、25の伝達に関与しているようなドアノブ、コンピュータ、およびトイレの便座などの大ハイタッチ表面とフィールド条件の下で綿棒のテストのパフォーマンス上の限られたデータがあります。さらに、これらの環境表面の大きさは、ファイバ先端に付いた綿棒の容量を超えています。私たちの研究では、700センチメートル2までの領域で環境表面をサンプリングする際、繊維先端綿棒よりも大きな綿棒ヘッドを持つマクロフォームスワブは、人間のノロウイルスのためのより高い回収率を有することが実証されました。 溶液中のノロウイルスは、周囲温度では比較的不安定であり、少なくとも冷蔵を必要とします。そのため、研究室への出荷は、スワブの採取後48時間以内に0-4°Cで発生します。典型的には、PCR反応において試験することができるサンプルの量は、量よりもはるかに小さいです集中することなく、大幅に陽性率を減少させ、綿棒（5-10 mLの対3-5μL）からの溶出後のサンプル。環境ウイルス学では、ポリエチレングリコール（PEG）は、環境水の大量のウイルスを濃縮するために首尾よく使用されています。しかし、ボリューム最大10 mLを容易に抽出しμL250という低いボリュームにミディスピンカラムを用いて濃縮し、さらにスピンカラムを用いて、高回収率で10倍に濃縮することができます。 RT-qPCRの感受性検出およびノロウイルスの定量化のためのゴールドスタンダードであるが、これらのアッセイの感度を容易にスワブサンプルから共抽出されたPCR阻害剤の存在によって影響され得ます。したがって、このような大腸菌ファージMS2ウイルス粒子として抽出制御の包含は、ノロウイルスと同様にMS2の両方を検出するマルチプレックスPCRフォーマットで、PCR阻害の有無を監視し、異なる実験間のばらつきを評価するのに役立ちます。&lt;/ P&gt; 実験室の検証メソッドのテスト変数は、試験方法の識別力を決定するために重要であり、さらに方法の可能性が高いフィールドサンプリング性能に変換されます。アカウントに（ 例えば 、遅延サンプリング、最大700 cm 2のより大きな表面積）現実世界のフィールド条件をとると、ノロウイルスの検出限界は3.4ログ10（ステンレス鋼）であったと面当り4ログ10（便座）コピーノロウイルスは、サンプリングされました6。その結果、負の綿棒結果にはウイルス汚染が発生していないことを決定的なものではありません。ノロウイルス疾患の臨床的および疫学的情報は常に環境調査結果2、6切り札 。 クルーズ船からの我々のデータは、電話、コンピュータのキーボード、およびドアハンドルなどのハイタッチ面はキャビン人にノロウイルス検査で陽性ことが示されましたで報告されたウイルス性胃腸炎が滞在していました。これらの表面は、便器洗浄または嘔吐エピソード6、7、8、9、10の間に生成される液滴を介して間接的に直接接触を介して汚染されたかのいずれかとなりました。 結論として、この新たに開発されたスワブプロトコルを使用して環境面でノロウイルスの検出は、臨床サンプルが利用可能であり、洗浄の実践の有効性を監視していないとき、ウイルスを検出し、流行時に環境汚染のレベルを決定するのを助けることができます。繊維は、綿棒（綿及びレーヨン）ベースの表面サンプリング方法が広く、他の腸内ウイルス（ 例えばロタウイルス、およびアデノウイルス）を調査するために使用されている27、28、29をひっくり返し。以上を考慮すると綿棒6傾け、それらの繊維の上にマクロフォームスワブのノロウイルスのための回収効率、我々は、マクロフォームスワブは、他の腸内のウイルスを検出することができますことを期待。

<html>人間のノロウイルスは、世界的流行と散発的な急性胃腸炎の主要な原因1、2、3です。ウイルスは非常に伝染性であり、送信は、人との対話にまたは間接的に汚染された食物、水や環境表面との接触を介して直接人を介して行われます。ノロウイルスは、長時間流すことができ、環境表面上のウイルスの生存期間の延長は1、2、3に記載されています。ピークの排出時には、ウイルス粒子の数十億は糞便1g当たり放出される、および嘔吐はまた、感染4を引き起こすウイルス粒子の十分な数が含まれている5、6、7、8、EF &quot;&gt; 9、10。また、無生物表面と人間の皮膚との間のウイルスの移動が容易に発生する可能性があります2、11、12。したがって、環境汚染のモニタリングがアウトブレイク調査を支援し、クリーンアップの有効性を評価する際にすることができ、消毒手順。 いくつかの環境サンプリングプロトコルは、ロタウイルスの検出のために記載されており、大腸菌ファージMS2、ネコカリシウイルス（FCV）、及びバクテリオファージP22 13、14、15、16。しかし、高速乾燥（&lt;1時間）と小さい表面領域（25×100 cm 2）を含む、これらの研究に記載の検証条件は、適切にフィールドの設定を表していない場合があります。また、エンバイロの低い汚染レベルを期待nmental表面は、非常に少数のウイルス粒子を検出することができるプロトコルを必要とします。 私たちは、ノロウイルスの検出とタイピングのためのマクロフォームベースの表面サンプリング法を開発しました。この方法は、いくつかのノロウイルス集団発生時に検証されています。プロトコルは、1）（2）どのように最善の研究室に収集・輸送中のサンプルの完全性を維持するために、およびノロウイルスの3）実験室での試験とタイピング環境表面からスワブサンプルを収集する方法。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Generic name for kits</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macrofoam swab</td>
			<td>Premoistened EnviroMax Swab kit&#160;</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>2588060PFUW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;RNA Lysis buffer&#160;</td>
			<td>CDC UNEX buffer</td>
			<td>Microbiologics</td>
			<td>Cat No MR0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA extraction spin column</td>
			<td>Midi column</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>Cat No R6664-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">RNA purification spin column</td>
			<td>Zymol RNA Clean and Concentrator kit&#160;</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>Cat No R1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Real time RT-PCR kit</td>
			<td>AgPath kit One-Step RT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat No 4387391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conventional RT-PCR kit</td>
			<td>Qiagen one step RT-PCR kit</td>
			<td>Qiagen kit</td>
			<td>Cat No 210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen kit</td>
			<td>Cat No 28704 or 28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;"></td>
			<td>Coliphage MS2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Cat No 15597-B1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;"></td>
			<td>RNA run-off transcripts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:285px;">Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;"></td>
			<td>Realtime PCR platform</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model ABI 7500</td>
			<td style="width:285px;">GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 &#215; 106 copies/ &#956;l, and stored at &#8722;80&#176;C with 1.0 U /&#956;l RNasin (Promega, Madison, WI).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td>Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat No 4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp;showAddButton=true&amp;productID=4306311&amp;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx%0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D&amp;returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp Clear Adhesive Film&#160;</a></td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat No 4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swab sampling method for the detection of human norovirus on surfaces

人間のノロウイルスは、世界的流行と散発的な胃腸炎の主要な原因です。ほとんどの感染はいずれかの環境表面や食品を介して間接的に個人対個人の経路を介して直接広がったりしているため、汚染された媒介物と無生物表面は、ノロウイルスの集団感染時のウイルスの拡散のための重要な媒体です。 私たちは、硬質表面からのヒトノロウイルスの検出およびタイピングのためのマクロフォームスワブを使用してプロトコルを開発し、評価しました。繊維が先端に付いた綿棒や帯電防止ワイプと比較すると、マクロフォームスワブは、最大700 cm 2の便座表面からのウイルス回収（範囲1.2から33.6パーセント）を許可します。プロトコルは、スピンカラムを用いてウイルスRNAのスワブからウイルスを抽出し、さらに濃縮するためのステップを含みます。ノロウイルス胃腸炎がされていたクルーズ船や介護施設での表面から収集された217スワブサンプルの合計で、127（58.5パーセント）RT-qPCRによりGIIのノロウイルス検査で陽性と報告しました。これらの29（22.8％）のうち、正常遺伝子型を決定することができました。結論として、私たちが開発したプロトコルを使用して、環境面でのノロウイルスの検出は、臨床試料が入手できないときに大流行中の環境汚染のレベルだけでなく、ウイルスの検出を判断する際に役立つかもしれ。それはまた、改善戦略の有効性の監視を容易にすることができます。

Watch this Scientific Journal Video about Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces at JoVE.com

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

swab-sampling-method-for-the-detection-of-human-norovirus-on-surfaces

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.5K ビュー.  Centers for Disease Control and Prevention. A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces. 

ビデオ: Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

免疫・感染学

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

運動誘発性リンパ球のアポトーシスの決定のための指先穿刺の採血方法

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

インフルエンザのためのDNAマイクロアレイ上ampliPHOX比色検出

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

マウスノロウイルスのプラークアッセイ

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

の検出のための磁気スターラー方法<em&gt;旋毛虫</em筋肉試料中&gt;幼虫

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...