The authors have no acknowledgements.

Alanında 1. Swab Örnekleme <ol><li> eldiven temiz bir çifti giymek. </li><li> bir ölçüm bandı veya cetvel kullanarak yüzeyine dokunmadan örnekleme alanının boyutunu ölçün. Mümkün olduğu kadar doğru bölgeyi tahmin ve bir rapor formu (Ek Tablo 1) doldurmak için deneyin. </li><li> olası sızıntı ve etiket örneği taşıma çantaları ve çubukla kitleri için sürüntü kiti edin. </li><li> şu şekilde numune alanı boyunca çubukla hareket Yatay yönde bir felç, dikey yönde bir vuruş ve bir köşegen yönünde bir vuruş. 700 cm 2 den bir yüzey alanı büyük çubukla etmeyin. </li><li> bir tüp içine her bezi yerleştirin ve güvenli kapağı sıkın. </li></ol> Laboratuvara Swablar 2. Depolama ve Taşıma <ol><li> en fazla 48 saat boyunca 4 ° C &#39;de bezlerden tutun. daha uzun süreler boyunca depolama gerekli ise, -20 ° C &#39;de bezlerden saklamak (ya da -70 ° C). </li><li> 0-4 ° C&#39;de tüpler tutmak (örn. Toplama 24-48 saat içinde laboratuar ve gemiye taşıma sırasında izole edilmiş bir kap içinde) soğuk paketleri kullanır. </li></ol> 3. Virüs Konsantrasyon, Viral RNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm santrifüj adımları, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 x g&#39;de bir masa üstü santrifüjü kullanabilirsiniz. evrensel nükleik asit ekstraksiyon (UNEX) tamponu ile çalışırken ekstra dikkatli olun. gözlük veya yüz siperi takın. <ol><li> bir 15 ml tüp ve her bir numune için bir RNA Midi sütun etiketleyin. Her deneyde negatif çıkarma kontrolü içerir. </li><li> 10 çubuklar için lizis çözeltisinin hazırlanması PBST 25 mL UNEX tamponu 25 ml karışımı (% 0.02 oranında içeren PBS pH 7.2 Tween-80). </li><li> Lizis çözeltisinin 50 mL kolifaj MS2 süspansiyonu (10 6 PFU / ml) 50 ul ekleyin. </li><li> 15 ml bir tüp içinde bir çubukla yerleştirilir ve 5 mi liz çözeltisi ilave edin. Karıştırınız ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li>10 sn için, her bir tüp ve vorteks 5 mi% 100 etanol ilave edin. </li><li> Dikkatle 15 ml tüp çubukla kaldırmak aşırı sıvı kaldırmak ve sonra çubukla atmak için tüpün kenarına hafifçe bastırarak (o UNEX tampon içerir). Geri kalan hacim 9-10 ml arasında olmalıdır. </li></ol> 4. Midi Sütun Viral Nükleik Asit Ekstraksiyon <ol><li> Dikkatle bir midi sütun, santrifüj üzerine adım 3.6 4.5 mL UNEX / etanol karışımı aktarın ve süzüntü atın. </li><li> Aynı sütun, santrifüj üzerine aynı karışımdan başka 4.5 mL yükleyin ve süzüntü atın. </li><li> İlk yıkama için, Midi kolonu, santrifüjün üzerine,% 70 etanol 3.5 ml ilave edilir ve filtrat atılır. </li><li> İkinci yıkama için, Midi kolonu üzerine% 70 etanol bir 3,5 ilave edin. Santrifüj süzüntü atın ve. </li><li> kuru spin için, etanol tüm izlerini (olumsuz viral RNA kurtarma etkileyebilir) kaldırmak için Midi sütunları santrifüj. </li><li>yeni bir 15 ml&#39;lik santrifüj tüpüne Midi sütun. Midi kolonuna 250 ul elüsyon tamponu ekleyin; En yüksek Viral RNA iyileşmeyi elde etmek santrifüj edilmeden önce 1 dakika boyunca bekleyin. </li><li> -70 ° C&#39;de çıkarılan nükleik asidi saklayın veya adım 5&#39;e hemen geçin. </li></ol> RNA Temiz ve Konsantratörü Setlerini Kullanma Viral Nükleik Asit 5. Konsantrasyon <ol><li> RNA 10 saniye süreyle yukarıda adım 4.7 ve vorteks yıkandı RNA 250 uL Bağlama Tamponu 500 mcL ekleyin. </li><li> 10 sn için 750 mcL% 100 etanol ve vorteks ekleyin. </li><li> Her bir numune için bir spin kolon etiketleyin. spin kolona 750 uL örnek yükleyin. </li><li> 1 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de dönüş sütunları santrifüj. flow-through atın. </li><li> 1 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de bir spin kolon ve santrifüj üzerine kalan 750 uL yükleyin. </li><li> ön yıkama için 1 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de her spin kolon ve santrifüj 400 uL RNA Hazırlık tampon ekleyin. flow-through atın. </li><li> İlk yıkama için, 1 dakika için 12,000 x g&#39;de her spin kolon ve santrifüj 800 uL RNA yıkama tamponu ilave edin. flow-through atın. </li><li> İkinci yıkama için, 1 dakika için 12,000 x g&#39;de sütun ve santrifüj dönmeye 400 uL RNA yıkama tamponu ilave edin. flow-through atın. </li><li> kuru spin için, 2 dakika süreyle 12,000 xg&#39;de yıkama tamponu tüm izlerini silmek için spin kolon santrifüj. </li><li> Dikkatle temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüp spin kolon aktarın. </li><li> Spin kolonu üzerine 25 uL elüsyon tamponu ilave edin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin. Bu sütundan viral RNA kurtarma artacaktır. </li><li> 1 dakika 10.000 xg&#39;de spin kolon santrifüj edilerek RNA toplayın. </li><li> Her iki durumda da, -70 ° C&#39;de, RT-qPCR (aşama 6) veya mağaza RNA doğrudan devam edin. </li></ol> 6. Genogroup I Mutiplex RT-qPCR Algılama ve II Noroviruses ve Kolifaj MS 2 (Ek Tablo 2) <ol><li> Temiz çalışma yüzeyleri, pipettes, RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile ve santrifüjler olası kirlenmeyi azaltmak için. </li><li> buz üzerinde RT-qPCR reaktifler çözülme. (Ayrı bir alan / oda) buz üzerinde Çözülme RNA. </li><li> Reaksiyonların sayısını belirlemek ve bunların en az% 10 daha fazla eklemek (10 reaksiyonlar gerektiği takdirde, örneğin, 11 master karışımı olun). </li><li> 5 saniye için 25x RT-qPCR enzimi haricinde Vortex bireysel master miks bileşenleri. Dikkatli bir parmak ile tüp hafifçe vurarak enzimi karıştırın. </li><li> 5 saniye süreyle kısaca santrifüj master miks bileşenleri. </li><li> Kiti talimatlarına göre Norovirus GI ve GII gerçek zamanlı RT-PCR tespiti için ana karışım hazırlanarak, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü (Ek Tablo 3) norovirus spesifik oligonükleotid primerler ve problar ekleyin. </li><li> yukarı ve aşağı 5-10 kez pipetleme ana karışımı karıştırın (vorteks tavsiye edilmez). Gerçek zamanlı PCR, 96 oyuklu plakanın her bir master karışımı kısım 22 uL. </li><li> Vortex örnek RNA5 saniye için, ve kısa (5 s) santrifüjle toplanır. </li><li> RT-qPCR plaka (Tablo 2 şablonu izleyin) örnek RNA ve GI ve GII pozitif kontroller 3 mcL ekleyin. no-şablon kontrolü (NTC) kuyularda nükleaz Freewater 3 mcL ekleyin. </li><li> Optik yapışkan film ile gerçek zamanlı plaka basım. </li><li> 1 dakika kuyularda mevcut olabilecek herhangi bir hava kabarcığı veya sıvı damlaları kaldırmak için dikkatlice 1,300 xg&#39;de gerçek zamanlı plaka santrifüj. </li><li> 10 dakika 1) RT adım: Bir gerçek zamanlı PCR cihazı ve set-up aşağıdaki thermocycling koşullar ayarlayın. Taq polimeraz, 45 ° C (2) aktivasyonu, 10 dak. 95 ° C ve (3) 95 ° C&#39;de 15 saniye, 45 döngü, 60 ° C&#39;de 60 s. </li></ol> Çubuğu Örneklerinde Norovirus 7. sayısallaştırılması <ol><li> RT-qPCR sonuçları (Ek Tablo 3) doğrulamak için pozitif ve negatif kontrollerin sonuçlarını kontrol edin. </li><li> Her bir standart eğri karşılayıp karşılamadığını belirlemekkabul edilebilir değerler Ek Tablo 2&#39;de verilmiştir ve Eşitlik 1 kullanılarak standart eğri için genel standart sapmayı hesaplar. (Denklem 1)% verim = 100 x 10 (ortalama Ct Değerleri-Intercept) / Eğim. </li><li> PCR termal döngü cihazı yazılımı her standart eğri için eğimi hesaplamak etmezse, eğim ve R istatistik yazılımı kullanılarak regresyon ile 2 değerleri (örneğin Excel, SPSS, ya da SAS) belirler. Buna ek olarak, denklem I aşağıdaki standart eğriler için% verimliliğini hesaplamak </li><li> Ek Tablo 4&#39;te belirtilen kriterlere uygun standart eğrileri dayalı tüm test numuneleri için termal döngü cihazı yazılımı tarafından hesaplanan RNA kopya numarasını kaydedin. Kriterlere uygun ya da yanlış pozitif kontroller yok, standart eğrileri t şapka ile herhangi bir örnekleri yeniden. PCR inhibisyonunu izlemek için bir iç kontrol olarak eklenmiştir kolifajla MS2, Ct değerlerini kontrol edin. </li><li> RNA kopyası p sayısını belirlemekRT-qPCR Reaksiyon için kullanılan RNA (3 uL 5), bu, toplam RNA, yıkama sıvısı hacmi (25 ila 50 uL) oranında adım 7.2 hesaplanan RNA kopya sayısı ile çarpılarak er örneği. Alternatif olarak, analiz nesne yüzey alanı (cm2) toplam RNA kopya sayısına bölünmesi ile RNA yoğunluğunu hesaplamak. </li></ol> Yan yerleştirilmiş geleneksel PCR amplifikasyonu ile gerçek zamanlı RT-PCR pozitif örnek 8. Genotiplendirme <ol><li> RT-PCR testinin her bir primer seti için ana karışımı ilk turda hazırlayın (Ek Tablo 2 ve 5). </li><li> ana karışımı 20 mcL norovirus pozitif RNA 5 mcL ekleyin. </li><li> aşağıdaki koşullar altında, RT-PCR deneyinde (1) içinde oda sıcaklığında 95 ° C&#39;de, Taq polimeraz, 42 ° C (2) aktivasyonu, 15 dakika, 30 dakika boyunca aşama, ve (3) 95 ° C&#39;de 30 saniyelik 40 döngü 50 ° C&#39;de 30 saniye ve 72 ° C&#39;de 60 san. 40 döngü sonrasında, 72 ° C&#39;de ek bir 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li>RT-PCR testinin her bir primer seti (Ek Tablo 2 ve 5) için mater karışımı ikinci tur hazırlayın. </li><li> 23 uL ana karışımı ekleyin ve her tüp (ideal ilk tur ürünü RNaz içermeyen su içinde 1/10 seyreltilmiş olmalıdır) için (ilk turdan) ilk tur RT-PCR ürünlerinin 2 mcL ekleyin. </li><li> Adımı tekrarlayın 8.3. </li><li> (PH 8.3, 40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA) 100 mL 1x Tris-asetat EDTA,% 2 agaroz jel hazırlayın. Bir mikrodalga fırında karışımın ısıtılmasıyla agaroz çözüldükten sonra, 60-70 ° C&#39;ye kadar soğutulduktan sonra karışım hazırlanmış jel, 100 ml başına nükleik asit leke 10 mcL jel dökün ve tarak yerleştirin. Jel en az 30 dakika süreyle dinlendiriniz. </li><li> 6x yükleme boyası 3 uL her bir RT-PCR ürünü 15 ul karıştırın. Yük Her numunenin 15 uL ve 1 saat boyunca 100 V&#39;ta agaroz jeli Electrophorese. </li><li> Jel An uygun büyüklükte (GI için 330 bp ve GII 341 bp) tüketim hedefi RT-PCR fragmanlarıticari bir jel özütleme kiti kullanılarak RNA&#39;yı saflaştırmak d. Arıtılmış PCR ürünü, artık Sanger sekanslama için de kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Isakbaeva, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+transmission+on+cruise+ship.">Norovirus transmission on cruise ship.</a> Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).</li><li>Lopman, B. A., Gasta&#241;aduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinj&#233;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+transmission+of+norovirus+gastroenteritis.">Environmental transmission of norovirus gastroenteritis.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).</li><li>Malek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+norovirus+infection+among+river+rafters+associated+with+packaged+delicatessen+meat,+Grand+Canyon,+2005.">Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005.</a> Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).</li><li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+shedding+after+experimental+human+infection.">Norwalk virus shedding after experimental human infection.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).</li><li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+gastroenteritis.">Norovirus gastroenteritis.</a> N. Engl. J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li><li>Park, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+New+Environmental+Sampling+Protocol+for+Detection+of+Human+Norovirus+on+Inanimate+Surfaces.">Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).</li><li>Barker, J., Jones, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+spread+of+infection+caused+by+aerosol+contamination+of+surfaces+after+flushing+a+domestic+toilet.">The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet.</a> J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).</li><li>Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosolization+of+a+Human+Norovirus+Surrogate,+Bacteriophage+MS2,+during+Simulated+Vomiting.">Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting.</a> PloS one. 10, 0134277 (2015).</li><li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+50%+human+infectious+dose+for+Norwalk+virus.">Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus.</a> J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).</li><li>Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+introduction+routes+into+nursing+homes+and+risk+factors+for+spread:+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies.">Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centers+for+Disease+Control+Prevention.+Norovirus+outbreak+in+an+elementary+school--District+of+Columbia,+February+2007.">Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).</li><li>Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+prolonged+environmental+survival+of+small+round+structured+viruses.">Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses.</a> J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).</li><li>Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+surface+sampling+methods+for+virus+recovery+from+fomites.">Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).</li><li>Taku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+detection+of+caliciviruses+from+food+contact+surfaces.">Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces.</a> J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).</li><li>Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+swab+sampling+method+for+the+detection+of+norovirus+and+rotavirus+on+artifically+contaminated+food+and+environmental+surfaces.">Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces.</a> Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).</li><li>Herzog, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+recovery+efficiency+for+bacteriophage+P22+on+fomites.">Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).</li><li>Vega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaliciNet:+A+Novel+Surveillance+Network+for+Norovirus+Gastroenteritis+Outbreaks+in+the+United+States.">CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).</li><li>Rolfe, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internally+controlled,+one-step,+real-time+RT-PCR+assay+for+norovirus+detection+and+genogrouping.">An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping.</a> J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).</li><li>Kittigul, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+GII-4+2006b+variant+circulating+in+patients+with+acute+Thailand+during+a+2006-2007+study.">Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study.</a> J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).</li><li>Teunis, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus:+how+infectious+is+it.">Norwalk virus: how infectious is it.</a> J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).</li><li>Wollants, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+norovirus+sampling+method+using+sodium+dodecyl+sulfate/EDTA-pretreated+chromatography+paper+strips.">Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips.</a> J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).</li><li>Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Surface+Sampling+and+Recovery+of+Viruses+and+Non-Spore+Forming+Bacteria+on+a+QMRA+Model+for+Fomites.">The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiology+of+food+and+animal+feed-Horizontal+method+for+determination+of+hepatitis+A+virus+and+norovirus+in+food+using+real-time+RT-PCR.">Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR.</a> International Organization for Standardization (ISO). , (2013).</li><li>Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+approach+to+defining+"high-touch"+surfaces+in+hospitals.">A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).</li><li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+norovirus+outbreak+at+a+long-term-care+facility:+the+role+of+environmental+surface+contamination.">A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).</li><li>Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+recovery+of+viruses+from+water:+a+comprehensive+review.">Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review.</a> Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).</li><li>Gallimore, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+monitoring+for+gastroenteric+viruses+in+a+pediatric+primary+immunodeficiency+unit.">Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).</li><li>Ganime, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+human+adenoviruses+and+rotavirus+species+A+on+fomites+of+hospital+pediatric+units.">Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units.</a> Am J Infect Control. , (2016).</li><li>Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+contamination+of+aerosol+and+surfaces+through+toilet+use+in+health+care+and+other+settings.">Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings.</a> Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).</li></ol>

Authors have no conflicting interest. The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the official position of the Centers for Disease Control and Prevention.

Noroviruses 18 ve 10 3 virüs parçacıkları 20 arasında% 50 insan bulaşıcı dozu var. Bu nedenle, yüzeylerin bile düşük seviyeli kirlenme bir halk sağlığı riski doğurabilir. iç çıkarma kontrolü olarak taşıma sırasında 1) farklı sürüntü malzemeleri, 2) depolama koşulu bezlerden, 3) viral RNA konsantrasyonu ve 4) kolifaj MS2: çubukla örnekleme protokolünün çeşitli yönleri de dahil olmak üzere değerlendirildi. Yakın zamana kadar, pamuk, polyester, naylon ve benzeri) silin antistatik yapılan bezlerden sadece performansı değerlendirilmiştir edildiğini ve saha kullanımı 13, 14, 15, 21, 22 için önerdi. Bunlardan, pamuklu Norovirusla ve hepatit gıda hazırlama yüzeyleri ve fomitler 23 A virüsü tespiti için ISO 15216 protokol tarafından tavsiye edilmiştir. NasılHiç sık Noroviruses 24, 25 iletilmesi suçlanmıştır gibi doorknobs, bilgisayarlar ve klozet gibi büyük yüksek dokunmatik yüzeyli saha şartlarında pamuklu test performansı üzerinde sınırlı veri vardır. Ayrıca, bu çevresel yüzeylerin büyüklüğü fiber uçlu bezlerden kapasitesini aşıyor. Bizim çalışmamızda, 700 cm 2 kadar bir alana sahip çevre yüzeyleri örnekleme zaman fiber uçlu bezlerden daha büyük bir çubukla kafasına sahip macrofoam bezlerden, insan norovirusa için daha yüksek geri kazanım oranlarına sahip olduğunu göstermiştir. çözelti içinde Noroviruses çevre sıcaklığında nispeten kararsızdır ve en soğutma yapılmasını gerektirir. Bu nedenle, laboratuvara kargo bezlerden toplandıktan sonra 48 saat içinde 0-4 ° C&#39;de gerçekleşmelidir. tipik olarak, bir PCR reaksiyonunda test edilebilir örneğin hacmi miktarının çok daha küçüktürÖrnek konsantrasyonu olmadan, önemli ölçüde pozitif oranını azaltır, çubukla (5-10 mL vs 3-5 ul) elüsyon sonra. Çevre viroloji olarak, polietilen glikol (PEG) çevresel suların büyük hacimli virüsleri konsantre başarıyla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, en fazla 10 ml hacim kolaylıkla ekstre edilmiş ve 250 uL kadar düşük miktarlar Midi spin sütunları kullanılarak konsantre edildi, ve daha fazla yüksek verimli kullanarak kolonlanyla ile 10 kat konsantre edilebilir. RT-qPCR hassas algılama ve norovirusa ölçümü için altın standart olmasına rağmen, bu deneylerin duyarlılığı kolayca çubukla örneklerinden birlikte ekstre edilir PCR inhibitörlerinin varlığı ile etkilenebilir. Bu nedenle, MS2 yanı sıra her iki Norovirus algılayan bir multipleks PCR formatında, böyle kolifajla MS2 virüs partikülleri gibi bir ekstraksiyon kontrolü, dahil PCR inhibisyonu varlığını izlemek ve farklı deneyler arasında varyasyon değerlendirmek için yardımcı olur. &lt;/ P&gt; Bir laboratuvar doğrulama yönteminin test değişkenleri test yöntemi ayrımcı gücünü belirlemek için kritiktir ve daha fazla yöntemin muhtemel saha örnekleme performansı çevrilir. Gerçek dünya alan koşulu alarak (örneğin, 700 cm 2 büyük yüzey alanları gecikmeli örnekleme) dikkate, norovirusa için algılama sınırı 3.4 log 10 (paslanmaz çelik) ve 4 günlük 10 (klozet) yüzey başına kopya norovirus örneklenen oldu 6. Sonuç olarak, negatif sürüntü sonucu viral kontaminasyon oluştu olduğu kesin değildir. Norovirus hastalığın klinik ve epidemiyolojik bilgiler her zaman 6, çevresel bulgulara göre 2 koz. Bir cruise gemisi bizim veriler, telefonlar, bilgisayar klavyeleri, ve kapı gibi yüksek dokunmatik yüzeyler kabin nerede insanlar norovirusa testinin pozitif kolları olduğunu gösterdiile bildirilen viral gastroenterit kalmıştı. Bu yüzeyler tuvalet kızarma veya kusma atakları 6, 7, 8, 9, 10 sırasında üretilen damlacıklar yoluyla dolaylı olarak doğrudan temas yoluyla kontamine veya olmuş ya. Klinik örnekler mevcut ve temizlik uygulamalarının etkinliğinin izlenmesinde değilken Sonuç olarak, salgınlar sırasında çevresel kirlilik düzeyinin belirlenmesinde yardımcı olabilir bu yeni geliştirilen çubukla protokolünü kullanarak çevresel yüzeylerde norovirusa tespiti, virüs tespit. Fiber (örn rotavirüs ve adenovirüs) 27, 28, 29 yüzey örnekleme yöntemleri yaygın diğer enterik virüsler araştırmak için kullanılmıştır tabanlı bez (pamuk ve ipekten) uçlu. yüksek göz önüne alındığındaBu liflerin üzerinde macrofoam bezlerden norovirusa kurtarma verimliliği biz macrofoam bezlerden de diğer enterik virüsleri tespit etmek mümkün olması beklenmektedir, bezlerden 6 uçlu.

<html> İnsan Noroviruses salgın ve sporadik akut gastroenterit, dünya çapında 1, 2, 3 lider nedenidir. Virüs son derece bulaşıcıdır ve iletim kişi etkileşim ya da dolaylı kirlenmiş yiyecek, su ya da çevresel yüzeylerle temas yoluyla doğrudan kişi aracılığıyla gerçekleşir. Noroviruses uzun süre tutacak ve uzun süreli çevresel yüzeyler üzerinde virüs yaşam 1, 2, 3, belgelenmiştir edilebilir. Pik ağızlık açma işlemi esnasında, virüs partiküllerinin milyarlarca dışkıların gramı başına serbest bırakılır, ve kusmuk da enfeksiyonu 4, 5, 6, 7, 8 neden viral parçacıkların yeterli sayı içerir,ef &quot;&gt; 9, 10. Buna ek olarak, cansız yüzeyler ve insan cilt arasındaki virüsün transferi kolayca oluşabilir 2, 11, 12. Dolayısıyla, çevresel kirlilik izleme salgını soruşturmalarda yardımcı ve temiz-up etkinliğini değerlendirmede olabilir ve dezenfeksiyon işlemleri. Bir çok çevresel numune alma protokolleri rotavirüs saptanması için tarif edilmiştir, kolifaj MS2, kedigiller calicivirüs (FCV) ve bakteriyofaj P22 13, 14, 15, 16. Ancak, hızlı kurumaya (&lt;1 saat) ve küçük yüzey alanları da dahil olmak üzere bu çalışmalarda, açıklanan doğrulama koşulları (25 x 100 cm 2), yeterli alan ayarlarını temsil etmeyebilir. Buna ek olarak, Çevreyi düşük kirlilik seviyeleri tahminnmental yüzeyler çok az virüs partiküllerini tespit edebiliyoruz protokolleri gerektirir. Biz Norovirüs tespiti ve yazmak için bir macrofoam esaslı yüzey örnekleme yöntemi geliştirdi. Bu yöntem, birkaç norovirus salgınlar sırasında valide edilmiştir. protokol içerir 1) (2) nasıl en iyi laboratuvara toplama ve nakliye sırasında numunelerin bütünlüğünü korumak için, ve norovirusa 3) laboratuvar testleri ve yazarak çevresel yüzeylerden sürüntü örnekleri toplamak için nasıl.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Generic name for kits</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macrofoam swab</td>
			<td>Premoistened EnviroMax Swab kit&#160;</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>2588060PFUW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;RNA Lysis buffer&#160;</td>
			<td>CDC UNEX buffer</td>
			<td>Microbiologics</td>
			<td>Cat No MR0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA extraction spin column</td>
			<td>Midi column</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>Cat No R6664-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">RNA purification spin column</td>
			<td>Zymol RNA Clean and Concentrator kit&#160;</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>Cat No R1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Real time RT-PCR kit</td>
			<td>AgPath kit One-Step RT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat No 4387391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conventional RT-PCR kit</td>
			<td>Qiagen one step RT-PCR kit</td>
			<td>Qiagen kit</td>
			<td>Cat No 210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen kit</td>
			<td>Cat No 28704 or 28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;"></td>
			<td>Coliphage MS2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Cat No 15597-B1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;"></td>
			<td>RNA run-off transcripts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:285px;">Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;"></td>
			<td>Realtime PCR platform</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model ABI 7500</td>
			<td style="width:285px;">GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 &#215; 106 copies/ &#956;l, and stored at &#8722;80&#176;C with 1.0 U /&#956;l RNasin (Promega, Madison, WI).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td>Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat No 4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp;showAddButton=true&amp;productID=4306311&amp;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx%0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D&amp;returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp Clear Adhesive Film&#160;</a></td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat No 4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swab sampling method for the detection of human norovirus on surfaces

İnsan Noroviruses salgın ve dünya çapında dağınık gastroenteritin önde gelen nedenidir. En enfeksiyonlar ya çevresel yüzeylerde ya da gıda yoluyla dolaylı olarak kişiden kişiye yolla doğrudan yayılır ya, çünkü kirlenen fomitler ve cansız yüzeyler norovirus salgınları sırasında virüsün yayılması için önemli araçlardır. Biz geliştirdik ve algılama ve sert yüzeylerde insan Noroviruses bir tiplemesi için macrofoam bezlerden kullanarak bir protokol değerlendirildi. Fiber uçlu bezlerden veya antistatik mendil ile karşılaştırıldığında, macrofoam bezlerden 700 cm2 klozet yüzeylerinden virüs kurtarma (aralık 1,2-33,6%) izin verir. Protokol spin sütunları kullanılarak viral RNA&#39;nın bezlerden virüsün çıkarma ve bir daha konsantrasyon yapılması adımlarını içerir. norovirus gastroenterit olmuştu yolcu gemileri ve uzun süreli bakım tesislerinde yüzeylerinden toplanan olmuştu 217 sürüntü örneklerinin toplam olarak, 127 (% 58.5)RT-qPCR GII norovirusa için pozitif test bildirildi. Bu 29 (% 22.8) başarıyla genotip olabilir. Sonuç olarak, klinik örnekler mevcut olmadığında virüsün saptanması yanı sıra salgınlar sırasında çevresel kirlilik düzeyinin belirlenmesinde yardımcı olabilir geliştirilen protokolü kullanılarak çevresel yüzeylerde norovirusa tespiti; aynı zamanda iyileştirme stratejilerinin etkinliğinin izlenmesi kolaylaştırabilir.

Şekil 1 sürüntü örnekleme protokolünün bir akış şemasını göstermektedir. Bu protokol dört ana aşamadan oluşmaktadır; 1) numune toplama, 2) örnek depolama ve nakliye, 3) viral RNA arıtma ve konsantrasyon ve 4) RT-qPCR tahlil ve genotiplendirme. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> Şekil 1: norovirusa çevresel yüzey örnekleme için nihai protokolün akış şeması <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55205/55205fig1large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Tablo 1 bir yolculuk sırasında şüpheli norovirus gastroenterit vakaları rapor eden bir gemisi toplanan 34 sürüntü örneklerinden sonuçlarını özetlemektedir. Sürüntü örnekleri çıkarılan ve te edildiçoklu gerçek zamanlı RT-qPCR Norovirus için iki kopya halinde sted. Onyedi (% 18.5) numuneleri norovirus belirtileri olan yolcular gemideki ortak alanlardan kaldı ve 9 olan kabinler yüzeylerden 8 örneklerin de dahil olmak üzere pozitif çıktı. Örnek başına genomik kopya sayısı Norovirus GII.7 RNA transkriptinin bir standart eğri kullanılarak (16 ile 31 arasında değişen) Ct değerleri hesaplandı. Ortak alanlarda (aralık: 1,2-2,1 log 10 genom kopya) den genom kopya anlamlı derecede yüksek olduğu: - (4.5 log 10 RNA kopya 2.4 aralık), (kabinlerde sürüntü örneklerinden genom kopya ortalama sayısı 3.6 log 10 oldu p &lt;0.001). 17 pozitif sürüntü örneklerinin dört (% 23.5) genotip için başardık ve tüm örnekler aynı GII.1 dizileri vardı. <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Yer çevre takas toplanan bir </td><td><strong&gt; Numune Noktası Açıklama </td><td> Ortalama Ct değeri (test edilen numunelerin toplam sayısının pozitif #) </td><td> Genotip </td><td> Norovirüs RNA örneklenmiş alan c başına kopya sayısı </td></tr><tr><td> kulakçık </td><td> Korkuluk </td><td> 34.3 (1/2) </td><td> GII </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Kabin A </td><td> Klozet </td><td> 31.4 (2/2) </td><td> GII. b </td><td> 31.217 </td></tr><tr><td> Kabin A </td><td> Musluk </td><td> 37.5 (1/2) </td><td> GII </td><td> 491 </td></tr><tr><td> Kabin A </td><td> Kapı kolu </td><td> 35.0 (2/2) </td><td> GII </td><td> 2675 </td></tr><tr><td> Kabin A </td><td> Uzaktan kumanda </td><td> 38.6 (2/2) </td><td> GII.1 b </td><td> 233 </td></tr><tr><td> Kabin B </td><td> Klozet </td><td> 33.5 (2/2) </td><td> GII.1 b </td><td> 986 </td></tr><tr&gt; <td> Lido </td><td> Dondurma makinesi </td><td> 34.2 (2/2) </td><td> GII </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Lido </td><td> Masa Bal </td><td> 35.2 (1/2) </td><td> GII </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Lido </td><td> Masaüstü </td><td> 35.3 (1/2) </td><td> GII </td><td> 14 </td></tr><tr><td> Pizzacı </td><td> karşı yüzey </td><td> 35.7 (1/2) </td><td> GII </td><td> 14 </td></tr><tr><td> ana Gale </td><td> Fun-time Makinası </td><td> 37.1 (1/2) </td><td> GII </td><td> 64 </td></tr><tr><td> Otomat </td><td> dokunmatik yüzeyler </td><td> 38.8 (1/2) </td><td> GII </td><td> 18 </td></tr><tr><td> ekip salonu </td><td> Klavye ve Fare Yüzey </td><td> 36.8 (1/2) </td><td> GII </td><td> 80 </td></tr><tr><td> Kabin C </td><td> Musluk ve kapı kolu </td><td> 31.6 (2/2) </td><td> GII.1 b </td><td> 26458 </td></tr><tr><td> Kabin C </td><td> Telefon </td><td> 36.4 (2/2) </td><td> GII </td><td> 1035 </td></tr><tr><td> Kabin C </td><td> Tuş takımı </td><td> 33.0 (2/2) </td><td> GII </td><td> 1317 </td></tr><tr><td> Sağlık Merkezi </td><td> Pano </td><td> 36.0 (2/2) </td><td> GII </td><td> 113 </td></tr><tr><td> Bir kabin A, B ve C viral gastoenteristis belirtileri ile klinik olarak hasta olmuştu bireyler tarafından işgal edilmiştir. </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> b 17 GII pozitif sürüntü örneklerinin Dört genotip olabilir. </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cı RNA kopyası norovirus GII.7 RNA transkriptlerinin standart bir eğri göre caluated edildi. </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Not: Bugüne biraz üzerinde orijinal 6 ncı modifiye edildi. </td><td></td><td&gt; </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bir yolculuk sırasında şüpheli norovirus gastroenterit vakaları rapor eden bir gemisi toplanan 34 sürüntü örneklerinden sonuçları. Şekil 2, RT-qPCR ve bu örnekleri sırası yeteneği belirlenir Ct değerleri arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Toplamda 127 217 üzerinden sürüntü örnekleri RT-qPCR GII norovirusa testi pozitif. Numuneler Ct değerleri geniş bir (12-40) göstermiştir. Toplam olarak, RT-qPCR pozitif örnek 29 (% 22.8) genotip olabilir. Ct değerleri 27 altında ve 28-31 arasında değişen ile sürüntü örnekleri sırasıyla% 100 ve% 72,2, oranlarında genotiplendirilmiştir. Buna karşılık, sadece% 22.0 ve 32-36 ve 37-40 Ct değerleri ile svap örneklerinin% 1.6, sırasıyla başarılı bir şekilde dizildi olabilir, yarı-iç içe amplikonları üretti. Şekil 2: RT-qPCR tarama ve teyit norovirus salgınları sırasında toplanan olmuştu sürüntü örneği sıralama sonuçları. Beyaz barlar RT-qPCR pozitif sürüntü örnekleri virüs sayısını temsil. Bu RT-qPCR pozitif örneklerin İnsan Norovirus nükleik asitler yarı iç içe PCR deneyi kullanılarak büyütülmüş ve daha sonra genotipleme onay sekanslandı. Siyah çubuklar ve satır numarası ve genotip yüzdesi sırasıyla çubukla örnekleri doğruladı temsil etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55205/55205fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ct değeri aralığı </td><td> RT-qPCR pozitif örneklerin sayısından </td><td> Dizisi teyit numune sayısı (%) Bir </td></tr><tr><td> 20-23</td><td> 4 </td><td> 3 (75) </td></tr><tr><td> 24-27 </td><td> 3 </td><td> 3 (100) </td></tr><tr><td> 28-31 </td><td> 18 </td><td> 13 (72.2) </td></tr><tr><td> 32-36 </td><td> 41 </td><td> 9 (22.0) </td></tr><tr><td> 37-40 </td><td> 61 </td><td> 1. (1.6) </td></tr><tr><td colspan="3"> a) yarı iç içe PCR </td></tr></tbody></table> Tablo 2: RT-qPCR ve sürüntü örneği genotiplendirme sonuçları. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> örnek Numarası </td><td> YER </td><td> Yüzey Açıklaması </td><td> Yüzey alanı (cm2) </td><td> Numune toplama Tarih / saat </td><td> Temiz (E / H) </td><td> Temizlenmiş, hangi dezenfektan kullanılmıştır? &lt;/ Strong&gt; </td><td> Yüzey malzemesinin ve yer ayrıntılı açıklaması </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Room # 7-1302 </td><td> Klozet </td><td> 700 cm2 </td><td> 2016/06/26; 09:00 </td><td> Yok hayır </td><td> uygulanamaz </td><td> Tuvalet koltuk [üst yüzeyler) ve sabit plastoc </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Room # 7-1330 </td><td> telefon sap </td><td> 500 cm 2 </td><td> 2016/06/26; 09:25 </td><td> Evet </td><td> 1000 ppm ağartma </td><td> Sert plastik, kauçuk düğme </td></tr></tbody></table> Ek Tablo 1: Örnek açıklama formu örneği. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> genogroup / virüs </td><td> İsim oligonükleotid primer / prob </td><td> Sıra 5 → 3 &amp; #900; </td><td> Referans </td></tr><tr><td rowspan="5"> GI </td><td> Cog1F </td><td> CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Cog1R </td><td> CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C </td><td> 17 </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA </td><td> 17 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> CCA ACC CAR CCA TTR TAC A </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Ring1E prob </td><td> FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ bir </td><td> Bu çalışma </td></tr><tr><td rowspan="5"> GII </td><td> Cog2F </td><td> ARAÇ GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Cog2R </td><td> TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Ring2-astar </td><td> TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT </td><td> 17 </td></tr><tr><td> G2SKR </td><td> CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT </td> &lt;td&gt; 17 </td></tr><tr><td> Ring2 prob </td><td> Cy5 veya QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b </td><td> 17 </td></tr><tr><td rowspan="3"> MS2 </td><td> MS2F </td><td> TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG </td><td> 18 </td></tr><tr><td> MS2R </td><td> GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Ms2p-prob </td><td> HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 c </td><td> 18 </td></tr><tr><td colspan="4"> Bir GI TaqMan probu 6-karboksifloresan (FAM) ve 3&#39;-etiketli MGBNFQ (Minor-oluk Binding site) ile birlikte-5&#39;etiketli </td></tr><tr><td colspan="4"> b GII TaqMan probu Cy5 veya Quasar 670 ile 5&#39;-etiketli 3&#39;-etiketli Black Hole söndürücü ile; uygunluk durumundan dolayı kullanılan Black Hole Quencher (BHQ) 2, BHQ 3 tercih edilir. </td></tr><tr><td colspan="3"> c MS2 TaqMan probu 5R olduğunu17; ile -etiketli HEX ve BHQ1 olan 5&#39;-etiketli </td><td></td></tr></tbody></table> Ek Tablo 2: Oligonükleotid primerleri ve probları bilgileri. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> 2x RT-PCR Tampon * </td><td> 12.5 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su * </td><td> 1.08 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Algılama Arttırıcı * </td><td> 1.67 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Cog 1F (10 uM) </td><td> 1 </td><td> 400 nM </td></tr><tr><td> Cog 1R (10 uM) </td><td> 1 </td><td> 400 nM </td></tr><tr><td> Halka 1E-prob (10 uM) </td><td> 0.5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr&gt; <td> Cog 2F (10 uM) </td><td> 1 </td><td> 400 nM </td></tr><tr><td> Cog 2R (10 uM) </td><td> 1 </td><td> 400 nM </td></tr><tr><td> Halka 2-prob (10 uM) </td><td> 0.5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> MS2F (10 uM) </td><td> 0.25 </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> MS2R (10 uM) </td><td> 0.25 </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> Ms2p-prob (10 uM) </td><td> 0.25 </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> 2x RT-PCR enzim * </td><td> 1 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Master Mix hacmi </td><td> 22 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> * Gerçek zamanlı RT-PCR kiti dahil </td></tr></tbody></table> Ek Tablo 3: multipleks gerçek zamanlı GI / GII / MS2 norovirus RT-PCR Master mix <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Kontrol tipi </td><td colspan="2"> Sonuç yorumlama </td></tr><tr><td rowspan="6"> Numune </td><td> Negatif kontrol </td><td colspan="2"> negatif olmalıdır </td></tr><tr><td> Pozitif kontrol </td><td colspan="2"> pozitif olmalı </td></tr><tr><td> negatif örnek </td><td colspan="2"> Her Ct değeri GI / GII için saptanamaz ise örnek negatiftir </td></tr><tr><td> pozitif örnek </td><td colspan="2"> Her iki çoğaltır Ct değerleri (GI / GII) &lt;38 ise; Bu (keyfi) kesme her gerçek zamanlı PCR platformu ve kit için deneysel olarak tespit edilmesi gerekmektedir </td></tr><tr><td> Geçici pozitif numune </td><td> Örnek bir çoğaltmak Ct değeri (GI / GII) ise geçici pozitiftir &lt;38 </td><td></td></tr><tr><td> İç proses kontrol (MS2) </td><td colspan="2"> ≥32 f bir eşik döngüsü olan numuneler (Ct) değeriveya MS2 sulandırılmamış tekrar test edilmeli ve 1/10 seyreltilmiş. </td></tr><tr><td></td><td> Parametre </td><td> Kabul edilebilir değer </td><td></td></tr><tr><td> Standart eğri norovirus RNA transkriptleri kullanarak </td><td> R2 </td><td> &gt; 0.97 </td><td></td></tr><tr><td> verim </td><td> % 115% 90 </td><td></td></tr></tbody></table> Ek Tablo 4: Çevre sürüntü örneklerinde norovirusa tespiti için her bir RT-qPCR testi dahil etmek denetler. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> hacim / rxn (ul) </td></tr><tr><td> 5x RT-PCR tamponu </td><td> 1x </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> dNTP karışımı (10 mM) </td&gt; <td> 0.4 mM </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> Enzim karışımı (RT ve Taq) </td><td></td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> İleri primer bir </td><td> 0.5 uM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> Ters primer bir </td><td> 0.5 uM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü (20 U / ul) </td><td> 20 u </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> RNaz içermeyen su </td><td></td><td> 11.00 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td></td><td> 20.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> ileri ve GI ve GII grubu için primer setleri ters sırasıyla Cog1F + G1SKR ve Cog2F + G2SKR vardır. </td></tr><tr><td> İkinci tur RT-PCR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bileşen </td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> hacim / rxn (ul) </td></tr><tr><td> 5x RT-PCR tamponu &lt;<html> / Td&gt; <td> 1x </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> dNTP karışımı (10 mM) </td><td> 0.4 mM </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> Enzim karışımı (RT ve Taq) </td><td></td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> İleri primer b </td><td> 0.5 uM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> Ters astar b </td><td> 0.5 uM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü (20 U / ul) </td><td> 20 u </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> RNaz içermeyen su </td><td></td><td> 14.00 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td></td><td> 23.0 </td></tr><tr><td colspan="3"> b ileri ve GI ve GII grubu için primer setleri ters sırasıyla G1SKF + G1SKR ve Ring2 astar + G2SKR vardır. </td></tr><tr><td> Not: bilgilerden biraz üzerinde orijinal 19. madde modifiye edilmiş </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; Ek Tablo 5: Hemi-nested RT-PCR Master mix:&quot; keep-together.within-page = fo &quot;_content. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="4"> faz I </td><td rowspan="4"> saha Örnekleme </td><td> 1. Kontrol macrofoam sürüntü kitleri (örneğin, son kullanma tarihi, tüp kaçakları ve çubukla ıslaklık) </td></tr><tr><td> 2. Çubuğu yüzeyi (sınır yüzey alanı ≤100 inç 2 (645 cm2) için) </td></tr><tr><td> 3. taşıma tüpleri içine Swab ve nakliye sırasında sızıntı önlemek için sıkıca kapaklarını sıkın </td></tr><tr><td> Bir Kilitli-çanta içinde 4. çubukla kiti </td></tr><tr><td rowspan="2"> Faz II </td><td rowspan="2"> Numune taşıma ve depolama </td><td> 1. Örneklenmiş çubuklar saklanmalıdır -70 ° C (ya da -20 ° C) </td></tr><tr><td> 2. Nakliye çubuklatoplama bezlerden 48 saat içinde yalıtılmış bir kap ve gemi 0-4 ° C (soğuk-paketleri) de laboratuvara numuneleri </td></tr><tr><td rowspan="4"> faz III </td><td rowspan="2"> RNA etraction </td><td> 1. Kontrol lizis tamponu (örneğin, son veriler) </td></tr><tr><td> 2.% 100 etanol eklenmesinden önce parçalama tamponu içinde bir iç kontrol olarak MS2 ekleme </td></tr><tr><td rowspan="2"> RNA saflaştırma ve konsantrasyon </td><td> 3. Temiz laboratuvar tezgah ve RNA RNaz kaldırma çözümü kullanarak küçük ekipman </td></tr><tr><td> Bir RNA çapraz bulaşmayı önlemek için sık sık adımları sırasında 4. eldivenleri değiştirin </td></tr><tr><td rowspan="2"> faz IV </td><td rowspan="2"> RT-PCR Testi (QA / QC) </td><td> 1. Her bir PCR çalışması için Ct değerleri varyasyonlarının kontrol etmek için her bir RT-qPCR deneyi için sayısal norovirus transkript RNA (Gl ve GII) gibi </td></tr><tr><td> 2.PCR inhibitörleri varlığını izlemek için MS2 sinyal yokluğu kullanın </td></tr></tbody></table> Ek Tablo 6: CDC çevre örnekleme prosedürü için kontrol listesi.

Watch this Scientific Journal Video about Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces at JoVE.com

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

swab-sampling-method-for-the-detection-of-human-norovirus-on-surfaces

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.5K Görüntüleme.  Centers for Disease Control and Prevention. A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces. 

Video: Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

Egzersizle indüklenen Lenfosit Apoptoz belirlenmesi için parmak sopa Kan Örnekleme Metodolojisi

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Mürin Norovirüs için Plak Testi

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Tespiti için Manyetik Karıştırıcı Yöntemi<em&gt; Trichinella</emKas Samples&gt; Larva

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...