The authors have no acknowledgements.

1. Swab Amostragem no campo <ol><li> Usar um par limpo de luvas. </li><li> Medir o tamanho da área de amostragem, sem tocar na superfície utilizando uma fita de medição ou régua. Tente estimar a área com a maior precisão possível e preencher um formulário de relatório (Tabela Suplementar 1). </li><li> Verifique o kit cotonete para possíveis fugas e amostras rótulo sacos de transporte e kits de esfregaço. </li><li> Mover a haste de toda a área de amostragem, como segue: um acidente vascular cerebral em direcção horizontal, um acidente vascular cerebral em direcção vertical, e um acidente vascular cerebral em um sentido diagonal. Não pincelar uma maior área de superfície de 700 cm2. </li><li> Coloque cada mecha em um tubo e aperte a tampa de segurança. </li></ol> 2. Armazenamento e Transporte de cotonetes para o Laboratório <ol><li> Manter cotonetes a 4 ° C durante até 48 h. Se for necessário o armazenamento por períodos mais longos, armazenar os cotonetes a -20 ° C (ou -70 ° C). </li><li> Mantenha os tubos a 0-4 ° C (ou seja,. , Use compressas frias) em um recipiente isolado durante o transporte para o laboratório e navio dentro de 24-48 h da coleta. </li></ol> 3. concentração de vírus, Viral RNA extração e purificação NOTA: Todos os passos de centrifugação usar uma centrífuga de bancada a 5000 xg durante 5 min à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma. Tenha cuidado extra quando se trabalha com o tampão universal extração de ácidos nucléicos (UNEX). Usar óculos ou viseira. <ol><li> Rotular um tubo de 15 mL e uma coluna RNA Midi para cada amostra. Incluir um controlo de extração negativo em cada experimento. </li><li> Para preparar a solução de lise durante 10 esfregaços, misturar 25 mL de tampão de UNEX com 25 mL de PBST (PBS, pH 7,2, contendo 0,02% de Tween-80). </li><li> Adicionar 50 ul de suspensão colifago MS2 (10 6 PFU / mL) a 50 ml de solução de lise. </li><li> Coloque um algodão embebido em um tubo de 15 ml e 5 ml da solução de Lise. Misturar e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li>Adicionar 5 ml de etanol a 100% a cada tubo e agitar com vortex durante 10 s. </li><li> Cuidadosamente retire o cotonete do tubo de 15 mL (contém tampão UNEX) pressionando-o suavemente contra o lado do tubo para remover o excesso de líquido e, em seguida, descartar o cotonete. Os volumes restantes deve ser entre 9-10 mL. </li></ol> 4. Coluna Midi viral Nucleic Acid Extraction <ol><li> Transferir cuidadosamente 4,5 mL UNEX mistura / etanol a partir do passo 3.6 para uma coluna de midi, centrífuga e descartar o filtrado. </li><li> Carregar mais 4,5 ml a partir da mesma mistura na mesma coluna, centrifugação, e descartar o filtrado. </li><li> Para a primeira lavagem, adicionar 3,5 mL de etanol a 70% para a coluna Midi, centrifugar e rejeitar-se o filtrado. </li><li> Para a segunda lavagem, adicionar outros 3,5 mL de etanol a 70% para a coluna Midi. Centrífuga e descartar o filtrado. </li><li> Para o spin seca, centrifugar as colunas Midi para remover todos os vestígios de etanol (que pode afetar negativamente a sua recuperação RNA viral). </li><li>Colocar a coluna Midi em um novo tubo de centrífuga de 15 ml. Adicionar 250 ul de tampão de eluição na coluna Midi; aguarde 1 min antes da centrifugação para obter o maior recuperação de RNA viral. </li><li> Armazenar o ácido nucleico extraído a -70 ° C ou prosseguir imediatamente para a etapa 5. </li></ol> 5. Concentração de Ácido Nucleico Utilizando Viral RNA limpo e Concentrador Kits <ol><li> Adicionar 500 uL de ARN de Tampão de Ligação para 250 ul de ARN eluída no passo 4.7 acima e vortex durante 10 s. </li><li> Adicionar 750 uL de 100% de etanol e agitar com vortex durante 10 s. </li><li> Rotular uma coluna de centrifugação para cada amostra. Coloque a amostra de 750 mL para uma coluna de spin. </li><li> Centrifugar as colunas de spin a 12.000 xg por 1 min. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Carregar os restantes 750 uL numa coluna de centrifugação e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. </li><li> Para a pré-lavagem, adicionar 400 ul de tampão de ARN Prep para cada coluna de centrifugação e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Para a primeira lavagem, adicionar 800 uL de ARN tampão de lavagem para cada coluna de centrifugação e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Para a segunda lavagem, adicionar 400 uL de ARN de Tampão de Lavagem a girar coluna e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Para o spin seco, centrifugar a coluna de centrifugação para remover todos os vestígios de tampão de lavagem a 12.000 xg durante 2 min. </li><li> Transferir cuidadosamente coluna de rotação para um tubo de microcentrífuga limpo 1,5 mL. </li><li> Adicionar 25 ul de tampão de eluição na coluna de rotação e incuba-se durante 1 minuto à temperatura ambiente. Isto irá aumentar a recuperação de RNA viral a partir da coluna. </li><li> Recolha de ARN por centrifugação a coluna de centrifugação a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Ou prosseguir directamente para RT-qPCR (passo 6) ou ARN armazenar a -70 ° C. </li></ol> 6. MULTIPLEX Detecção RT-qPCR de genogrupo I e II norovírus, e colifagos MS 2 (Tabela Complementar 2) <ol><li> superfícies de trabalho limpas, pipetaes, e centrífugas com solução de descontaminação RNase para reduzir a possibilidade de contaminação. </li><li> Descongelar reagentes RT-qPCR em gelo. RNA Thaw no gelo (em uma área / sala separada). </li><li> Determinar o número de reacções e adicionar pelo menos 10% mais deles (por exemplo, se são necessários 10 reacções, certifique-master mix para 11). </li><li> componentes master mix Vortex individuais, com exceção de 25x enzima RT-qPCR, por 5 s. Misturar cuidadosamente a enzima sacudindo o tubo com um dedo. </li><li> Resumidamente componentes Mix Master centrífuga por 5 s. </li><li> Preparar a mistura de mestre para a detecção em tempo real de RT-PCR do GI e GII norovírus de acordo com as instruções do kit e adicionar iniciadores oligonucleotídicos específicos do norovírus e sondas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Tabela 3 Complementar). </li><li> Misture a mistura principal pipetando 5-10 vezes para cima e para baixo (vórtice não é recomendado). Aliquota de 22 uL da mistura principal em cada poço de PCR em tempo real placa de 96 poços. </li><li> RNA amostra Vortexdurante 5 seg, e recolher por breve (5 s) de centrifugação. </li><li> Adicionar 3 mL da amostra de RNA e GI e GII controlos positivos para a placa de RT-qPCR (siga molde a partir da Tabela 2). Adicionar 3 mL de nuclease-freewater nos poços não-molde-controlo (NTC). </li><li> Selar a placa em tempo real com película adesiva óptica. </li><li> Cuidadosamente centrifugar a placa em tempo real a 1.300 xg durante 1 min para remover quaisquer bolhas de ar ou gotas de líquido que podem estar presentes nos poços. </li><li> Configurar um tempo real instrumento de PCR e set-up as seguintes condições ciclos térmicos: 1) etapa RT por 10 min. a 45 ° C (2) activação da polimerase Taq, 10 min. a 95 ° C e (3) 45 ciclos de 15 s a 95 ° C, e 60 s a 60 ° C. </li></ol> 7. Quantificação de norovírus em amostras de swab <ol><li> Confira os resultados dos controlos positivos e negativos para validar os resultados RT-qPCR (Tabela Complementar 3). </li><li> Determinar se cada curva padrão encontra ovalores aceitáveis dada no quadro suplementar 2 e calcular o desvio padrão geral para a curva padrão, usando a Equação 1. (Equação 1)% de eficiência = 100 x 10 (média Ct Valores-Intercept) / Slope. </li><li> Se o software termociclador PCR não calcula a inclinação para cada curva padrão, determinar encosta e R 2 valores por regressão usando software estatístico (por exemplo, Excel, SPSS ou SAS). Além disso, o cálculo da% de eficiência para as curvas de padrão seguinte equação I </li><li> Grave o número de cópias de RNA calculado pelo software termociclador para todas as amostras de teste com base em curvas padrão que atendem aos critérios especificados na Tabela Complementar 4. Execute novamente todas as amostras com curvas padrão chapéu de t, não satisfazem os critérios ou ter controles de falso-positivos. Verifique os valores Ct de colifago MS2, que foi adicionado como um controlo interno para monitorar a inibição PCR. </li><li> Determinar o número total de cópias de RNA per amostra pela multiplicação do número de cópias de ARN calculada no passo 7.2 pela razão entre o volume (25 a 50 ul) de eluente de ARN total para o ARN que de (3-5 uL) utilizado para a reacção de RT-qPCR. Em alternativa, o cálculo da densidade ARN dividindo o número total de cópias de ARN por área de superfície do objecto (2 cm) analisados. </li></ol> 8. A genotipagem de tempo-real amostras RT-PCR positivos por Hemi Nested convencional PCR Amplification <ol><li> Preparar a primeira rodada de master mix para cada conjunto de primers do ensaio de RT-PCR (Tabelas complementares 2 e 5). </li><li> Adicionar 5 mL de RNA positiva norovirus para 20 l de mistura principal. </li><li> Executar o RT-PCR sob as seguintes condições: (1) passo de RT durante 30 min a 42 ° C (2) activação da polimerase Taq, em 15 min a 95 ° C, e (3) 40 ciclos de 30 s a 95 ° C , 30 s a 50 ° C, e 60 seg a 72 ° C. Após 40 ciclos, incubar durante um adicional de 10 min a 72 ° C. </li><li>Prepare a segunda rodada de mix mater para cada conjunto de primers do ensaio de RT-PCR (Tabelas complementares 2 e 5). </li><li> Adicionar 23 mL master mix e adicionar 2 mL de primeira rodada produtos de RT-PCR (da primeira rodada) a cada tubo (o ideal é o produto da primeira rodada deve ser diluído 1/10 em água RNase-free). </li><li> Repita o passo 8.3. </li><li> Preparar um gel de agarose a 2% em 100 ml de EDTA 1x Tris-acetato (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, e EDTA 1 mM, a pH 8,3). Após a dissolução de agarose por aquecimento da mistura num forno de micro-ondas, adicionam-se 10 ul de mancha de ácido nucleico por 100 ml de gel preparada depois de se arrefecer a mistura para 60-70 ° C, verter o gel e inserir os pentes. Deixe o gel se contentar com, pelo menos, 30 min. </li><li> Misturar 15 uL de cada produto de RT-PCR com 3 ul de corante de carga de 6x. Carga de 15 uL de cada amostra e electroforese do gel de agarose, a 100 V durante 1 h. </li><li> fragmentos alvo especial sobre o consumo de RT-PCR de tamanho adequado (330 pb para GI e 341 pb para GII) a partir do geld purificar RNA usando um kit de extracção de gel comercial. O produto de PCR purificado pode agora ser utilizada para a sequenciação de Sanger. </li></ol>

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Authors have no conflicting interest. The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the official position of the Centers for Disease Control and Prevention.

Os norovírus têm uma dose infecciosa humana 50% entre 18 e 10 3 partículas de vírus 20. Portanto, mesmo a contaminação de baixo nível de superfícies podem representar um risco para a saúde pública. Vários aspectos do protocolo de amostragem swab foram avaliados, incluindo: 1) diferentes materiais de esfregaço, 2) cotonetes condição de armazenamento durante o transporte, 3) concentração de RNA viral, e 4) colifago MS2 como controle de extração interno. Até recentemente, apenas o desempenho de esfregaços feitos de algodão, poliéster, nylon e antiestático limpe) foram avaliadas e propostos para uso no campo 13, 14, 15, 21, 22. Destes, cotonetes foram recomendado pelo protocolo 15216 ISO para a detecção de norovirus e vírus da hepatite A partir de superfícies de preparação de alimentos e fômites 23. Comonunca, há poucos dados sobre o desempenho de testes de cotonetes de algodão em condições de campo, com grandes superfícies high-touch, como maçanetas, computadores e assentos sanitários que têm sido frequentemente implicados na transmissão do norovírus 24, 25. Além disso, o tamanho destas superfícies ambientais excede a capacidade de cotonetes com ponta de fibra. Em nosso estudo, demonstramos que compressas macro-espuma, que têm uma cabeça cotonete maior do que os cotonetes de fibra ponta, têm taxas de recuperação mais elevados para norovirus humana na amostragem superfícies do ambiente com uma área de até 700 cm2. Noroviruses em solução são relativamente instável à temperatura ambiente e requerem, pelo menos, de refrigeração. Portanto, o transporte para o laboratório deve ocorrer em 0-4 ° C dentro de 48 h após a coleta dos cotonetes. O volume de amostra que pode ser tipicamente testados numa reacção de PCR é muito menor do que a da quantidade deApós eluição da amostra da zaragatoa (3-5 mL vs. 5-10 ml), que, sem concentração, reduz significativamente a taxa de positividade. Em virologia ambiental, polietileno glicol (PEG) tem sido utilizado com sucesso para concentrar vírus a partir de grandes volumes de águas ambientais. No entanto, o volume até 10 ml pode ser facilmente extraído e concentrou-se utilizando colunas de centrifugação Midi para volumes tão baixas como 250 uL, e concentrou-se mais de 10 vezes com elevada recuperação, utilizando colunas de centrifugação. Embora RT-qPCR é o padrão de ouro para a detecção sensível e quantificação de norovírus, a sensibilidade desses ensaios podem ser facilmente afectadas pela presença de inibidores de PCR que são co-extraído das amostras de esfregaço. Por conseguinte, a inclusão de um controlo de extracção, tais como partículas de vírus colifago MS2, num formato de PCR multiplex, que detecta ambas as norovírus, bem como MS2, ajuda a controlar a presença de inibição da PCR e para avaliar a variação entre as diferentes experiências. &lt;/ P&gt; As variáveis ​​de teste de um método de validação por um laboratório são cruciais para determinar o poder discriminatório de um método de ensaio e são posteriormente traduzidos para o desempenho no campo de amostragem provável do método. Tomando condição de campo do mundo real (por exemplo, amostragem atrasado, áreas de superfície maiores de até 700 cm2) em conta, o limite de detecção para norovirus foi de 3,4 log 10 (aço inoxidável) e 4 log 10 (assento do vaso sanitário) cópias norovirus por área de amostragem 6. Consequentemente, os resultados de esfregaços negativos não são definitivos que nenhuma contaminação viral ocorreu. Informação clínica e epidemiológica da doença norovirus sempre supera resultados ambientais 2, 6. Nossos dados de um navio de cruzeiro mostrou que as superfícies de alto toque, tais como telefones, teclados de computador, e maçanetas testou positivo para norovirus em cabines onde as pessoascom gastroenterite viral relatado tinha ficado. Estas superfícies quer tornou-se contaminado através do contato direto ou indiretamente através de gotículas produzidas durante a descarga do banheiro ou episódios 6, 7, 8, 9, 10 vómitos. Em conclusão, a detecção de norovírus em superfícies ambientais utilizando este protocolo swab recentemente desenvolvido pode ajudar a determinar o nível de contaminação ambiental durante os surtos, detectar vírus quando amostras clínicas não estão disponíveis e no monitoramento da eficácia das práticas de limpeza. Fibra derrubado cotonete (de algodão e rayon) com base métodos de amostragem de superfície têm sido amplamente utilizados para investigar outros vírus entéricos (por exemplo, rotavírus e adenovírus) 27, 28, 29. Considerando a maiora eficiência de recuperação para norovirus de cotonetes macro-espuma sobre essas fibras derrubado cotonetes 6, esperávamos que os cotonetes macro-espuma será capaz de detectar outros vírus entéricos também.

<html> Noroviruses humanos são uma das principais causas da epidemia e gastroenterite aguda esporádica em todo o mundo 1, 2, 3. O vírus é extremamente contagiosa ea transmissão ocorre por meio de pessoa direta a interacção pessoa ou indirectamente, através de contacto com os alimentos contaminados, água ou superfícies ambientais. Norovírus pode ser derramado por longos períodos e prolongada sobrevivência do vírus em superfícies ambientais tem sido documentada 1, 2, 3. Durante derramamento de pico, bilhões de partículas de vírus são liberados por grama de fezes e vômito também contém um número suficiente de partículas virais para causar a infecção 4, 5, 6, 7, 8,ef &quot;&gt; 9, 10. Além disso, a transferência do vírus entre as superfícies inanimadas e pele humana pode ocorrer facilmente 2, 11, 12. Por isso, o monitoramento de contaminação ambiental pode ajudar na investigação de surtos e na avaliação da eficácia da limpeza e procedimentos de desinfecção. Vários protocolos de amostragem ambientais foram descritos para a detecção de rotavírus, colifago MS2, calicivírus felino (FCV), e bacteriófago P22 13, 14, 15, 16. No entanto, as condições de validação descritos nestes estudos, incluindo a dessecação rápida (&lt;1 hora) e da superfície reduzida (25 x 100 cm 2), pode não representar adequadamente as configurações de campo. Além disso, a baixos níveis de contaminação de Enviro esperadosuperfícies nmental requerem protocolos que são capazes de detectar muito poucas partículas de vírus. Foi desenvolvido um método de amostragem de superfície à base de macro-espuma para a detecção e tipagem de norovírus. Este método foi validado durante vários surtos de norovírus. O protocolo inclui 1) como coletar amostras de esfregaço de superfícies ambientais (2) a melhor forma de manter a integridade das amostras durante a recolha e envio para o laboratório, e 3) testes de laboratório e tipagem de norovirus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Generic name for kits</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macrofoam swab</td>
			<td>Premoistened EnviroMax Swab kit&#160;</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>2588060PFUW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;RNA Lysis buffer&#160;</td>
			<td>CDC UNEX buffer</td>
			<td>Microbiologics</td>
			<td>Cat No MR0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA extraction spin column</td>
			<td>Midi column</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>Cat No R6664-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">RNA purification spin column</td>
			<td>Zymol RNA Clean and Concentrator kit&#160;</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>Cat No R1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Real time RT-PCR kit</td>
			<td>AgPath kit One-Step RT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat No 4387391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conventional RT-PCR kit</td>
			<td>Qiagen one step RT-PCR kit</td>
			<td>Qiagen kit</td>
			<td>Cat No 210212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen kit</td>
			<td>Cat No 28704 or 28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;"></td>
			<td>Coliphage MS2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Cat No 15597-B1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;"></td>
			<td>RNA run-off transcripts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:285px;">Bacteriophage MS2 (ATCC No. 15597-B1) can be cultivated using Escherichia coli (E.coli) Famp (ATCC No. 700891).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;"></td>
			<td>Realtime PCR platform</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model ABI 7500</td>
			<td style="width:285px;">GI and GII RNA run off transcripts were quantified spectrophotometrically at A260, diluted in diethyl pyrocarbonate-treated water to 1 &#215; 106 copies/ &#956;l, and stored at &#8722;80&#176;C with 1.0 U /&#956;l RNasin (Promega, Madison, WI).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td>Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat No 4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp;showAddButton=true&amp;productID=4306311&amp;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx%0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D&amp;returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp Clear Adhesive Film&#160;</a></td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat No 4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swab sampling method for the detection of human norovirus on surfaces

noroviruses humanos são uma das principais causas da epidemia e gastroenterite esporádica em todo o mundo. Porque a maioria das infecções são ou transmitida diretamente por via da pessoa-a-pessoa ou indirectamente através de superfícies ambientais ou alimentos, fômites contaminados e superfícies inanimadas são veículos importantes para a propagação do vírus durante surtos de norovírus. Nós desenvolvido e avaliado um protocolo com cotonetes macro-espuma para a detecção e tipagem de norovírus humanos de superfícies duras. Comparado com cotonetes com ponta de fibra ou toalhetes anti-estáticos, compressas macro-espuma permitir a recuperação de vírus (intervalo 1,2-33,6%) das superfícies de assento de sanita de até 700 cm2. O protocolo inclui passos para a extracção do vírus a partir dos cotonetes e ao aumento da concentração do RNA viral utilizando colunas de centrifugação. No total, 127 (58,5%) das 217 amostras de esfregaço que tinham sido recolhidas a partir de superfícies em navios de cruzeiro e instalações de cuidados de longo prazo, onde norovirus gastroenterite tinham sidorelatado testou positivo para GII norovirus por RT-qPCR. Destes 29 (22,8%) poderia ser genotipados com sucesso. Em conclusão, a detecção de norovírus em superfícies ambientais utilizando o protocolo desenvolvido que pode ajudar a determinar o nível de contaminação do meio ambiente durante surtos, bem como a detecção de vírus quando as amostras não estão disponíveis clínicos; pode também facilitar o acompanhamento da eficácia de estratégias de remediação.

A Figura 1 apresenta um fluxograma do protocolo de amostragem cotonete. Este protocolo consiste em quatro etapas principais; 1) coleta de amostra, 2) o armazenamento de amostras e transporte, 3) purificação viral RNA e concentração e 4) ensaio de RT-qPCR e genotipagem. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxograma do protocolo final para amostragem de superfície ambiental de norovirus <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55205/55205fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A tabela 1 resume os resultados de 34 amostras de esfregaço que foram coletados a partir de um navio de cruzeiro que tinham relatado casos de suspeita de gastroenterite norovirus durante uma viagem. swab foram extraídos e tested em duplicado para norovirus por multiplex em tempo real RT-qPCR. Dezessete (18,5%) amostras foram positivos, incluindo 8 amostras de superfícies em cabines onde os passageiros com sintomas de norovírus tinha ficado e 9 de áreas comuns do navio. O número de cópias genómicas por amostra foram calculadas a partir dos valores Ct (que variou de 16 a 31) utilizando uma curva padrão de um transcrito norovírus GII.7 ARN. O número médio de cópias do genoma a partir de amostras de esfregaço em cabines foi de 3,6 log 10 (variação: 2,4 - 4,5 log 10 cópias de RNA), que foi significativamente maior do que as cópias do genoma de áreas comuns (variação: 1,2 - 2,1 log 10 cópias do genoma) ( P &lt;0,001). Quatro (23,5%) das 17 amostras de esfregaço positivos foram capazes de ser genotipados, e todas as amostras tinham sequências idênticas GII.1. <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Localização de swap ambiental coletado uma </td><td><strong&gt; Ponto Descrição da Amostra </td><td> Valor médio CT (# positivo do número total de amostras testadas) </td><td> Genótipo </td><td> Norovirus RNA copiar número por área amostrada c </td></tr><tr><td> Átrio </td><td> corrimãos </td><td> 34,3 (1/2) </td><td> GII </td><td> 16 </td></tr><tr><td> cabine A </td><td> Assento da privada </td><td> 31,4 (2/2) </td><td> GII. b </td><td> 31217 </td></tr><tr><td> cabine A </td><td> Torneira </td><td> 37,5 (1/2) </td><td> GII </td><td> 491 </td></tr><tr><td> cabine A </td><td> Maçaneta </td><td> 35,0 (2/2) </td><td> GII </td><td> 2675 </td></tr><tr><td> cabine A </td><td> Controle remoto </td><td> 38,6 (2/2) </td><td> GII.1 b </td><td> 233 </td></tr><tr><td> Cabin B </td><td> Assento da privada </td><td> 33,5 (2/2) </td><td> GII.1 b </td><td> 986 </td></tr><tr&gt; <td> Lido </td><td> Máquina de sorvete </td><td> 34,2 (2/2) </td><td> GII </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Lido </td><td> Condimentos de mesa </td><td> 35.2 (02/01) </td><td> GII </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Lido </td><td> Table Top </td><td> 35,3 (1/2) </td><td> GII </td><td> 14 </td></tr><tr><td> Pizzaria </td><td> contador superfície </td><td> 35,7 (1/2) </td><td> GII </td><td> 14 </td></tr><tr><td> principal Galley </td><td> Machine-tempo divertido </td><td> 37.1 (02/01) </td><td> GII </td><td> 64 </td></tr><tr><td> Maquina de vendas </td><td> Superfícies palpáveis </td><td> 38,8 (1/2) </td><td> GII </td><td> 18 </td></tr><tr><td> sala de tripulação </td><td> Superfície de teclado e mouse </td><td> 36,8 (1/2) </td><td> GII </td><td> 80 </td></tr><tr><td> cabine C </td><td> Torneira e maçaneta da porta </td><td> 31,6 (2/2) </td><td> GII.1 b </td><td> 26458 </td></tr><tr><td> cabine C </td><td> Telefone </td><td> 36,4 (2/2) </td><td> GII </td><td> 1.035 </td></tr><tr><td> cabine C </td><td> Teclado </td><td> 33,0 (2/2) </td><td> GII </td><td> 1317 </td></tr><tr><td> Centro médico </td><td> Prancheta </td><td> 36,0 (2/2) </td><td> GII </td><td> 113 </td></tr><tr><td> uma cabine A, B e C foi ocupado por indivíduos que tinham sido clinicamente doentes com sintomas gastoenteristis virais. </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> b Quatro das amostras de esfregaço 17 GII-positivos podem ser genotipados. </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> c cópias de RNA foram caluated com base numa curva padrão de transcritos de ARN norovírus GII.7. </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Nota: acima data foram ligeiramente modificada do artigo 6 originais. </td><td></td><td&gt; </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Resultados de 34 amostras de esfregaço que foram coletados a partir de um navio de cruzeiro que tinham relatado casos de suspeita de gastroenterite norovirus durante uma viagem. A Figura 2 mostra a relação dos valores Ct determinados por RT-qPCR e a capacidade de sequenciar estas amostras. No total, 127 de 217 amostras de esfregaço testou positivo para GII norovirus por RT-qPCR. As amostras apresentaram uma ampla gama (12-40) dos valores Ct. No total, 29 (22,8%) das amostras positivas RT-qPCR poderia ser genotipados. swab com valores Ct abaixo 27 e que variam entre 28-31 foram genotipados a taxas de 100% e 72,2%, respectivamente. Em contraste, apenas 22,0% e 1,6% de amostras de esfregaço com valores de Ct de 32-36 e 37-40, respectivamente, produzidos amplicons hemi-nested que podem ser sequenciadas com sucesso. Figura 2: Resultados do rastreio RT-qPCR e sequenciação de amostras de esfregaço que haviam sido coletadas durante surtos de norovírus confirmados. As barras brancas representam o número de RT-qPCR vírus amostras positivas de esfregaço. ácidos nucleicos de norovírus humanos nesses amostras positivas RT-qPCR foram amplificadas utilizando ensaio de PCR-hemi e depois sequenciado para confirmação da genotipagem. barras pretas e linha representam o número ea porcentagem de genótipo confirmou swab, respectivamente. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55205/55205fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> faixa de valor Ct </td><td> Número de amostras positivas de RT-qPCR </td><td> Número (%) de amostras de sequências confirmou um </td></tr><tr><td> 20-23</td><td> 4 </td><td> 3 (75) </td></tr><tr><td> 24-27 </td><td> 3 </td><td> 3 (100) </td></tr><tr><td> 28-31 </td><td> 18 </td><td> 13 (72,2) </td></tr><tr><td> 32-36 </td><td> 41 </td><td> 9 (22,0) </td></tr><tr><td> 37-40 </td><td> 61 </td><td> 1 (1,6) </td></tr><tr><td colspan="3"> a) Hemi nested PCR </td></tr></tbody></table> Tabela 2: RT-qPCR e os resultados de genotipagem de amostras de esfregaço. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Número amostra </td><td> LOCALIZAÇÃO </td><td> Descrição da superfície </td><td> Superfície (cm 2) </td><td> Data / hora da coleta de amostras </td><td> Limpo (Y / N) </td><td> Se limpos, o desinfectante foi usado? &lt;/ Strong&gt; </td><td> Descrição detalhada de material de superfície e localização </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Room # 7-1302 </td><td> Assento da privada </td><td> 700 cm 2 </td><td> 2016/06/26; 9:00 da manhã </td><td> Não </td><td> não aplicável </td><td> Toilet seat [superfícies superior) e plastoc disco </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Room # 7-1330 </td><td> alça de telefone </td><td> 500 cm 2 </td><td> 2016/06/26; 09h25 </td><td> sim </td><td> lixívia 1.000 ppm </td><td> plástico rígido, botão de borracha </td></tr></tbody></table> Tabela Suplementar 1: Exemplo de formulário de descrição da amostra. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> genogrupo / virus </td><td> Nome oligonucleotídeo iniciador / sonda </td><td> Sequence 5 → 3 &amp; #900; </td><td> Referência </td></tr><tr><td rowspan="5"> GI </td><td> Cog1F </td><td> CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Cog1R </td><td> CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C </td><td> 17 </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA </td><td> 17 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> CCA ACC CAR CCA TTR TAC A </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Ring1E-sonda </td><td> FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ um </td><td> Este estudo </td></tr><tr><td rowspan="5"> GII </td><td> Cog2F </td><td> CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Cog2R </td><td> TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Ring2-iniciador </td><td> TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT </td><td> 17 </td></tr><tr><td> G2SKR </td><td> CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT </td> &lt;td&gt; 17 </td></tr><tr><td> Ring2-sonda </td><td> Cy5 ou QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b </td><td> 17 </td></tr><tr><td rowspan="3"> MS2 </td><td> MS2F </td><td> TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG </td><td> 18 </td></tr><tr><td> MS2R </td><td> GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Ms2p-sonda </td><td> HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 c </td><td> 18 </td></tr><tr><td colspan="4"> uma sonda GI TaqMan é 5&#39;-rotulados com 6-carboxifluoresceína (FAM) e 3&#39;-rotulados com MGBNFQ (Minor-groove sítio de ligação) </td></tr><tr><td colspan="4"> b sonda TaqMan GII é 5&#39;-marcado com Cy5 ou Quasar 670 e 3&#39;-rotulado com Black Hole inibidor; Black Hole Quencher (BHQ) 2 utilizadas devido à disponibilidade, BHQ 3 é o preferido. </td></tr><tr><td colspan="3"> sonda c MS2 TaqMan é 5R17; marcado com com HEX e 5&#39;-rotulados com BHQ1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela complementar 2: Iniciadores oligonucleotídicos e sondas de informação. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume por reacção de (l) </td><td> A concentração final </td></tr><tr><td> 2x RT-PCR buffer * </td><td> 12,5 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> livre de nuclease de água * </td><td> 1.08 </td><td> n / D </td></tr><tr><td> Enhancer de detecção * </td><td> 1,67 </td><td> n / D </td></tr><tr><td> Cog 1F (10 uM) </td><td> 1 </td><td> 400 nM </td></tr><tr><td> Cog 1R (10 uM) </td><td> 1 </td><td> 400 nM </td></tr><tr><td> Anel 1E-sonda (10 uM) </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr&gt; <td> Cog 2F (10 uM) </td><td> 1 </td><td> 400 nM </td></tr><tr><td> Cog 2R (10 uM) </td><td> 1 </td><td> 400 nM </td></tr><tr><td> Anel 2-sonda (10 uM) </td><td> 0,5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> MS2F (10 uM) </td><td> 0,25 </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> MS2R (10 uM) </td><td> 0,25 </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> Ms2p-sonda (10 uM) </td><td> 0,25 </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> 2x RT-PCR enzima * </td><td> 1 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> volume principal Mix </td><td> 22 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> * Incluídos no kit em tempo real de RT-PCR </td></tr></tbody></table> Tabela Complementar 3: Master Mix para multiplex em tempo real GI / GII / MS2 norovirus RT-PCR <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Tipo de controle </td><td colspan="2"> interpretação dos resultados </td></tr><tr><td rowspan="6"> Amostra </td><td> O controlo negativo </td><td colspan="2"> Deve ser negativo </td></tr><tr><td> controle positivo </td><td colspan="2"> Deve ser positivo </td></tr><tr><td> amostra negativa </td><td colspan="2"> Amostra é negativo se cada valor Ct é indetectável por GI / GII </td></tr><tr><td> amostra positiva </td><td colspan="2"> Os valores Ct (GI / GII) de ambas as repetições é &lt;38; este (arbitrariamente) de corte tem de ser determinada experimentalmente para cada plataforma em tempo real de PCR e o kit </td></tr><tr><td> amostra positiva Tentative </td><td> Amostra é tentativamente positivo se o valor Ct (GI / GII) de uma réplica é &lt;38 </td><td></td></tr><tr><td> controle de processo interno (MS2) </td><td colspan="2"> As amostras com um ciclo limiar (Ct) de ≥32 fou MS2 deve ser reanalisada não diluído e 1/10 diluída. </td></tr><tr><td></td><td> Parâmetro </td><td> valor aceitável </td><td></td></tr><tr><td> Curva padrão usando transcrições de RNA norovirus </td><td> R2 </td><td> &gt; 0,97 </td><td></td></tr><tr><td> Eficiência </td><td> 90% a 115% </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 4 Complementar: Controla a incluir em cada teste de RT-qPCR para a detecção de norovírus em amostras de esfregaço ambientais. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> A concentração final </td><td> vol / rxn (ul) </td></tr><tr><td> 5x tampão RT-PCR </td><td> 1x </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> de mistura de dNTP (10 mM) </td&gt; <td> 0,4 mM </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> mistura de enzima (RT e Taq) </td><td></td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> Encaminhar uma cartilha </td><td> 0,5 uM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> Primer reverse um </td><td> 0,5 uM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> inibidor de ARNase (20 U / ul) </td><td> 20 U </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> água livre de RNase </td><td></td><td> 11.00 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td></td><td> 20,00 </td></tr><tr><td colspan="3"> um frente e verso, conjuntos de primers para GI e GII são Cog1F + G1SKR e Cog2F + G2SKR, respectivamente. </td></tr><tr><td> Segunda rodada RT-PCR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Componente </td><td> A concentração final </td><td> vol / rxn (ul) </td></tr><tr><td> 5x tampão RT-PCR &lt;<html> / Td&gt; <td> 1x </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> de mistura de dNTP (10 mM) </td><td> 0,4 mM </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> mistura de enzima (RT e Taq) </td><td></td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> Adiante b iniciador </td><td> 0,5 uM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> Iniciador inverso b </td><td> 0,5 uM </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> inibidor de ARNase (20 U / ul) </td><td> 20 U </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> água livre de RNase </td><td></td><td> 14.00 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td></td><td> 23,0 </td></tr><tr><td colspan="3"> b frente e verso, conjuntos de primers para GI e GII são G1SKF + G1SKR e Ring2 cartilha + G2SKR, respectivamente. </td></tr><tr><td> Nota: acima informaion foi ligeiramente modificado a partir do artigo original 19 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Tabela Complementar 5: Hemi-nested RT-PCR Master Mix. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="4"> fase I </td><td rowspan="4"> amostragem de campo </td><td> 1. Verifique kits macro-espuma de esfregaço (por exemplo, data de expiração, vazamentos de tubos e umidade swab) </td></tr><tr><td> 2. Cotonete de superfície (área de superfície limite para ≤100 polegadas 2 (645 cm2)) </td></tr><tr><td> 3. Coloque cotonetes para os tubos de transporte, e apertar as tampas de segurança para evitar vazamentos durante o transporte </td></tr><tr><td> kit swab 4. Coloque em um ziplock-bag </td></tr><tr><td rowspan="2"> fase II </td><td rowspan="2"> Transporte e armazenamento de amostras </td><td> 1. compressas utilizadas na amostragem devem ser armazenadas a -70 ° C (ou -20 ° C) </td></tr><tr><td> swab 2. Transportandoamostras para laboratório a 0-4 ° C (frio-packs) em um recipiente isolado e navio dentro de 48 horas de cotonetes de coleta </td></tr><tr><td rowspan="4"> fase III </td><td rowspan="2"> etraction RNA </td><td> 1. Verifique tampão de lise (por exemplo, os dados de validade) </td></tr><tr><td> 2. Adicionar MS2 como um controlo interno em tampão de lise antes da adição de etanol a 100% </td></tr><tr><td rowspan="2"> Purificação e concentração de ARN </td><td> 3. bancada de laboratório limpo e pequenos equipamentos utilizando a solução de remoção de RNA RNase </td></tr><tr><td> 4. luvas de mudar frequentemente durante medidas para evitar a contaminação cruzada RNA </td></tr><tr><td rowspan="2"> fase IV </td><td rowspan="2"> RT-PCR Assay (QA / QC) </td><td> 1. Incluir RNAs quantificados norovírus transcrição (GI e GII) para cada ensaio de RT-qPCR para controlar as variações de valores Ct para cada percurso do PCR </td></tr><tr><td> 2.Use ausência de sinal de MS2 para monitorizar a presença de inibidores de PCR </td></tr></tbody></table> Tabela Complementar 6: Checklist para o procedimento de amostragem ambiental do CDC.

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Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

swab-sampling-method-for-the-detection-of-human-norovirus-on-surfaces

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.5K visualizações.  Centers for Disease Control and Prevention. A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces. 

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Imunologia e Infecção

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

Ponta de dedo Metodologia de amostragem de sangue para a determinação da apoptose induzida pelo exercício de Linfócitos

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX Detecção colorimétrica em um Microarray de DNA para Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Ensaio de placas para Norovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

Método agitador magnético para Detecção de<em&gt; Trichinella</em&gt; As larvas em amostras de músculo

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...