The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

주 : 정의 목록에 대한 보충 자료 섹션 S1을 참조하십시오. USEPA 방법 1615과 관련된 품질 보증 절​​차는 보충 자료 섹션 S2에 설명되어 있습니다. 1. 필터 용출 절차 <ol><li> 먼저 용출 <ol><li> 버퍼 1.5 % 쇠고기 추출물의 pH 9.0 500ml의 배치, 메스 실린더 내에 실온으로 가온. 필터 카트리지 하우징을 열고 완전히 전기 양성 필터를 덮도록 쇠고기 추출물 충분한 양을 추가한다. 필터 하우징 덮개를 교체하고 멸균 비이커에 남아있는 쇠고기 추출물을 붓는다. </li><li> 접촉 시간이 1 분 후, 그 압력 용기 또는 연동 펌프를 이용하여 서서히 상기 필터를 통해 무균 비이커에 나머지와 함께 하우징의 비프 엑기스 용액을 전달한다. 2 L의 유리 비커에 용출액을 수집합니다. </li></ol></li><li> 두 번째 용출 <ol><li> 반복 버퍼 1.5 % 쇠고기 추출물의 추가 500 mL로하여 1.1 단계하지만, 15 분에 단계 1.1.2의 접촉 시간을 증가시킨다. </li><li> 제 1 용출에서이 포함 된 2 L 비커에 두 번째 용출에서 쇠고기 추출물을 추가합니다. 비커에 멸균 교반 막대를 추가합니다. </li></ol></li></ol> 2. 유기 응집 농도 절차 <ol><li> 적어도 5 분 동안 0.525 %의 차아 염소산 나트륨 결합 형 pH 전극을 소독. 멸균 DH 2 O와 전극을 씻어 후 0.05 M 티오 황산나트륨으로 탈염 소화. pH가 4와 7 표준을 사용하여 pH 미터를 보정. </li><li> 저어 접시에 용출액을 포함하는 비커를 놓습니다. 접시에 돌려 와류가 형성 될 때까지 교반 속도를 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 천천히 용출액을 1.2 M HCl을 적가하여 3.5 ± 0.1 용출액의 pH를 조정합니다. 빠른 또한이 바이러스를 불 활성화 것이기 때문에 염산 드롭 현명 추가합니다. 침전물이 형성되기 시작으로이 시간 동안 용출액은 흐린 될 것입니다. </li><li> 혼합 SPE를 감소다음, 천천히 교반 ED 및 30 분 동안 실온에서 3.5 ± 0.1에서 용출액의 pH를 모니터링하고 유지하는 것을 계속한다. </li><li> 4 ° C에서 2,500 XG에서 15 분 동안 침전 된 쇠고기 추출물의 하나 또는 그 이상의 원심 분리기 병에 서스펜션과 원심 분리기를 따르십시오. 원심 분리기와 두 흡로부터 병을 제거하거나 천천히 펠릿 석출물의 손실을 방지하기 위해 상등액을 가만히 따르다. 상층 액을 버린다. 참고 : 침전물의 양과 질에 쇠고기 추출물 많이들 사이에 상당한 변화가있을 수 있습니다. 다른 로트에서 그 어려움 용해하는 동안 일부 많이에서 생성 된 침전물을 빠르게 용해됩니다. </li><li> 침전물을 함유하는 원심 분리 병에 0.15 M 인산 나트륨 30 ㎖를 추가한다. <ol><li> 0.15 M 인산 나트륨, 5 분 이내에 용해 쇠고기 추출물 많이에서 침전을위한 pH가 9.0을 사용합니다. 침전물이 완전히 용해 된 후 10 분 동안 교반 한 다음 270 단계로 바로 간다. </li><li> 다른 모든 침전물을 위해 0.15 M 인산 나트륨, pH가 7.0-7.5을 사용합니다. , 또는 더 어려운 침전물에 대한 용해 10 ~ 15 분 동안 교반 궤도 통에 160 rpm에서 침전물을 흔들어는 피펫으로 교반하는 동안 반복적으로 상하 솔루션을 그려, 멸균 주걱으로 그들을 파괴, 이들 절차의 조합에 의해. 주 : 하나 이상의 원심 분리 용기를 사용하는 경우, 인산 나트륨 미만 30 ㎖를 사용하여 침전물을 결합하고 하나의 병 또는 비이커에 침전물을 조합 한 후 병을 린스하기 위해 30 ㎖의 나머지 부분을 사용한다. </li><li> 결합 된 침전물은 평평한 바닥 원심 분리기 병에있는 경우, 병에 교반 막대를 추가합니다. 2.6.5 단계로 이동합니다. </li><li> 합한 침전물 원추형 바닥 원심 분리 병에있는 경우 작은 유리 비이커로 옮기고 비이커에 교반 막대를 추가한다. </li><li> 자석 교반기 위에 병이나 비커를 놓고 홍보 할 때까지 저어ecipitate 완전히 해산했다. </li><li> 0.525 %의 차아 염소산 나트륨 결합 형 pH 전극을 다시 소독 단계 2.1에 기재된 바와 같이 0.05 M 황산나트륨으로 탈염 소화. pH를 7 ~ 10 표준을 사용하여 pH 미터를 보정. 천천히 1 M NaOH로 9.0로 완전히 용해 침전물의 pH를 조정 한 다음 10 분 동안 교반한다. </li></ol></li><li> 스터 막대를 제거하고 4,000-10,000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 용해 된 침전물을 원심 분리. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 유리 비커에 상층 액을 붓는다. 비커에 교반 막대를 추가하고 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 자석 교반기에 비커를 놓고 솔루션을 저어. 7.0-7.5로 pH를 조정하는 것이 현명 1.2 M 염산 드롭을 추가합니다. </li><li> 필터는 1.5 % 소고기 추출물 15 ㎖, 0.05 M 글리신, pH를 7.0-7.5로 전처리 된 프리 필터를 포함하는 살균 필터를 통과하여 상층 액을 멸균. </li><li> 분석 샘플 있습니다 volum전자 (S) 계산 : <ol><li> 사용 식 1은 실험실 요새는 빈과 빈 실험실 시약을 제외한 모든 테스트 샘플 S를 계산하는 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> 식 (1) D는 (있는 분석 원수 샘플 볼륨) 지하수 500 L이고, TSV (총 샘플 량)은 실험에 의해 수신 된 5 인치 전기 양성 카트리지 필터에 통과 필드 샘플의 부피이고, FCSV (최종 농축 샘플 볼륨) 단계 2.10 여과 다음 볼륨이다. 예 보충 자료 섹션 S4.1에 도시된다. </li><li> 그리고 빈 실험실 시약 (LRB, 즉, 시약 등급의 물을 사용하여 음의 품질 관리) 0.3에 의해 FCSV를 곱하여, 빈 실험실 요새 (즉, 시드 시약 등급의 물을 사용하여 긍정적 인 품질 관리 LFB)에 대한 S를 계산합니다. </li></ol></li><li> THRE에 FCSV 나눈다전자 부 표본. <ol><li> 1.04 배를 분석 된 샘플 부피와 동일한 부피의 서브 샘플 1 및 2를 제조 하였다. ; 이하에서 -70 ° C가 총 바이러스 배양 분석 (표본 1, 단계 4)를 이용하여 분석 또는 24 시간 내에 (도시되지 않음), 분자 분석을 처리 할 수​​없는 경우, 이러한 서브 샘플을 동결 그렇지 않으면, 4 ° C에서 개최합니다. </li><li> 이하에서 나머지 볼륨 (표본 3) 고정 -70 ° C ~. </li></ol></li><li> (10)에 의해 S를 나누어 접종 볼륨을 계산합니다. </li></ol> 3. 총 배양 가능한 바이러스 계량 적 분석 참고 : 모든 단계가 항상 세포 단층을 방해하지 않도록주의 솔루션을 추가하십시오. <ol><li> 경사 분리 또는 3-6일 포스트 분할에서 BGM 세포의 단층을 함유하는 시험 용기로부터 흡 미디어 다음 제거 매체와 동일한 평형 염 용액의 부피를 추가한다. </li><li> 경사 분리 또는 세포 배양 TE에서 평형 염 용액 대기음성 용기를 사용하고 세포 배양 시험 용기에 접종되고 <ol><li> 총 배양 바이러스 계량 적 분석 컨트롤 (보충 자료 섹션 S2.4)과 함께 접종 볼륨과 동일한 표본 1의 부피와 각 시험 샘플 (10) 테스트 혈관을 접종한다. </li><li> (LFSM, 즉, 시드 물 매트릭스 샘플)을 LFB와 랩 강화 샘플 매트릭스를 들어, 희석제로 표본 3 0.15 M 인산 나트륨, pH가 7.0-7.5을 사용하여 5-, 25-, 125 배 희석액을 준비합니다. 희석 물을 만들기위한 방법의 일례는 보충 자료 섹션 S3에서 주어진다. 단계 3.2.1로 희석 한 표본 접종 혈관 외에 각 시험 용기에 접종 볼륨을 사용하여 각 희석 계열 열 세척하고 세포 배양 시험 용기에 접종. </li><li> 부화 14 일 후 10 개의 복제에 CPE가 (단계 3.2.2에서 접종 이외의) 단계 3.2.1에서 어떤 시료의 경우, 사전 (단계 3.3 참조)표본 (3)의 5-, 25- 및 125-, 625 배 희석 깎다 접종 10은 전체 배양 바이러스 계량 적의 새로운 세트와 함께 각 시험 용기에 접종 볼륨을 사용하여 각 희석 계열의 세포 배양 시험 용기 세정 분석 컨트롤 (보충 자료 섹션 S2.4). </li><li> 전후로 용기를 기울여서 세포 단층의 표면 위에 접종 배포. 1-5 진동 / 분 또는 본 바이러스는 세포에 흡수 할 수 있도록 용기마다 15 ~ 20 분으로 요동 기계적 요동 플랫폼에서 80-120 분 동안 실온에서 시험 용기 부화. </li><li> 데워진 유지 보수 매체를 추가 한 후 36.5 ± 1 ° C에서 테스트 혈관을 품어. </li></ol></li><li> 설정 냉동실에 ≥75 %의 CPE를 표시하는 테스트 선박 하루 14 전송까지 그들에게 2-3 일마다 검사 후 처음 3 일 동안 매일 현미경을 사용하여 각 시험 용기의 CPE의 모습을 찾아 나-70 이하 C °. 또는 아래에 남아있는 모든 문화와 총 배양 바이러스 계량 적 분석 컨트롤을 고정 -70 ° C의 마지막 날에 혈관을 검사 한 후. </li><li> 모든 문화를 해동하고 0.2 μm의 살균 필터를 통해 모든 CPE 양성 시험 용기에서 매체의 ≥15 %를 필터링 할 수 있습니다. 지정된 볼륨 1,500-18,000 XG에서 10 분 동안 의한 막힘, 원심 분리기, 필터를 통해 매질을 통과시키고, 여과 4 ° C 이전 할 수없는 경우. </li><li> 세척 BGM 시험 용기를 사용하는 모든 1 차 통과 시험 용기의 제 2 통로를 수행합니다. <ol><li> 모든 부정적인 테스트 선박에서 긍정적 인 혈관에서 여과 매체로부터 해동 매체의 10 %를 나타내는 접종 볼륨과 새로운 테스트 혈관을 접종한다. </li><li> 반복 3.2.4-3.4.3 단계하지만, 단계 3.3에 설명 된대로 2 차에서 1 차 통과에 부정과 긍정적 모든 시험 용기를 동결. 3 번째 패스를 수행단지 음의 분석 제어와 2 차 통과에서 1 차 통과시 음성 및 양성이었다 세포 배양 물을 사용하여 2 차 통과에서 기술 한 바와 같이 세. </li></ol></li><li> 그들은 1 차 및 2 차 단락 또는 모두에서 CPE를 표시 할 때 CPE는 2 차 통로까지의 모두 2 차 및 3 차 통로를 발생하지 않는 경우, 바이러스 긍정적 인 개별 테스트 선박을 식별합니다. </li><li> 모든 테스트 샘플의 바이러스 역가를 계산하는 표 S2와 같이 설정 한 기본 프로그램 설정으로 USEPA의 가장 가능성있는 번호 계산기를 사용합니다. <ol><li> 입력 MPN / ㎖ 값 (M mL) 및 상부 (CL UML) 및 하부 (CL 1 ㎖) 95 % 신뢰 한계 / ml의 값을 결정하기 위해 계산기에 각각의 테스트 샘플에 대한 단계 3.6에서 바이러스 양 복제에 시험 용기의 개수 . </li><li> 영형수학 식 2를 사용하여 상응하는 시료의 MPN / L 값 (M의 L) btain. <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> 식 (2) M mL의 단계 3.7에서 MPN / ㎖ 값이고, S는 분석 샘플 볼륨이고, D는있는 분석 원래 물 샘플의 볼륨입니다. </li><li> M 개의 mL의 값의 CL UML 값을 대입하여 상부 신뢰 한계 / L을 계산한다. M 개의 mL의 값의 1 ㎖ CL 값을 대입하여 낮은 신뢰 한계 / L을 계산한다. 계산 예는 보충 자료 섹션 S4.2에 도시된다. </li><li> 0 / D 1 ≤ 등의 보고서 M mL의 값. 예를 들어, 지하수 샘플 0.002 MPN / L (≤ 1/500 L) ≤. </li><li> 강화 각 연구소의 MPN 95 % 신뢰 한계 값을 계산 빈과 랩 다시제 S에 의해 계산에서 얻어진 값 / ㎖를 승산하고 0.3 결과를 나눔으로써 빈 에이전트. </li></ol></li></ol>

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	<li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells.">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li><li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters.">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li><li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico.">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li><li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming,+2001.">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li><li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+gastroenteritis.">Norovirus gastroenteritis.</a> N.Engl.J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li><li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterovirus+surveillance--United+States.">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li><li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterovirus+infections:+diagnosis+and+treatment.">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li><li>Abzug, M. J., Finn, A., Pollard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteroviruses:+an+emerging+infectious+disease?+The+real,+the+speculative+and+the+really+speculative.">The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative.</a> Hot Topics in Infection and Immunity in Children. , (2008).</li><li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths+from+norovirus+among+the+elderly,+England+and+Wales.">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li><li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan.">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li><li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+murine+norovirus,+feline+calicivirus,+poliovirus,+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater.">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li><li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water.">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li><li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus,+Coxsackievirus,+Echovirus,+and+Murine+Norovirus.">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li><li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment.">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPA/600/R-95/178.">EPA/600/R-95/178.</a> ICR Microbial Laboratory Manual. , (1996).</li><li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water.">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=40+CFR+Parts+141+and+142+Revisions+to+the+Unregulated+Contaminant+Monitoring+Regulation+(UCMR3)+for+Public+Water+Systems+Final+Rule.">40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule.</a> Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=40+CFR+Part+141+National+Primary+Drinking+Water+Regulations:+Monitoring+Requirements+for+Public+Drinking+Water+Supplies;+Final+Rule.">40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule.</a> Federal Register. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li><li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J., McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+occurrence+and+health+risks+in+drinking+water+.">Virus occurrence and health risks in drinking water .</a> Information Collection Rule Data Analysis. , 437-462 (2002).</li><li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , (2002).</li><li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters.">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li><li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee,+wisconsin,+collected+august+1994.">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li><li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water.">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li><li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples:+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies.">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

USEPA 방법 1615은 규제되지 오염 물질 모니터링 규정의 세 번째 모니터링주기 (UCMR3) 17시 사용하기 위해 개발 주로 지하수에서 바이러스 발생을 측정하기 위해 설계되었다. 그것은 정보 수집 규칙 (ICR) 방법, 15,18와 일반적인 단계의 번호를 공유하지만이 약간의 차이가 있습니다. 모두 가장 가능성이 수 (MPN) 계산에 기초하는 정량와 BGM 세포 단일 층에 CPE를 생산하는 바이러스를 측정하는 계량 적 분석을 사용합니다. 방법 1615은 다양한 물 행렬로부터 바이러스를 농축하는 새로운 전기 양성 필터의 사용을 허용하고 세포 배양 시험 용기의 개수는 20 내지 모두 작은 변화가 전체에있어서 비용 절감 (10)에 희석 당 복제 감소시킨다. 복제 횟수의 감소는 노동력을 줄일 수 있지만, 약간 낮은 검출 한계 초래한다. 지하수는 지표수보다 바이러스의 낮은 농도를 가질 것으로 예상되지만, 19, 20 일분석 시료의 전자 량의 차이에 대한 일부 보상 지표수의 다섯 배이다. 적은 복제의 사용은 대부분의 지표수에 적합 수 있지만 일부는 샘플 희석이 필요합니다. 방법 1615 여러 가지 중요한 단계 및 제한 사항이 있습니다. 쇠고기 추출물은 많은에서 많이 다릅니다. 설명이 보충 자료 섹션 S2.3와 같이 각 많은 바이러스 용출의 효율성과 보조 농도 단계를 통해 바이러스 농도의 용량을 테스트해야합니다. 상기 방법은 BGM 세포 배양에 접종하고, 바이러스 역가를 결정하는 시료의 양을 계산하기위한 정확한 식을 사용한다. 이러한 수식을 엄격하게 준수하지 않을 경우 부정확 한 결과가 생성됩니다. 적절한 무균 기술은 세포 배양을 유지하기 위해 사용되어야한다. 14 일의 배양 기간 동안 곤란을 표시 BGM 비감염 세포 배양 제어 가능성 세포 배양 정비 문제를 나타낸다. 큰 관심은 따해야합니다현의 접종 및 교차 오염을 방지하기 위해 세포 배양 플라스크에 매체 추가와 관련된 단계를 피펫 팅시. 보충 자료 섹션 S2에 기술 된 품질 관리가 엄격하게 따라야합니다. 제 S2는 품질 문제에 대한 문제 해결 조언을 제공합니다. 필터를 전기 양성하는 바이러스 흡착 기본 메커니즘은 필터의 양전하의 강도 및 등전점 관련 바이러스 &#39;음전하의 강도와 21 테스트되는 물의 pH 관련된 전하의 상호 작용이다. 필터로부터 용출은 이러한 상호 작용의 강도에 의해 영향을 받는다. 그들은 바이러스 유형 사이에도 동일한 타입 내 균주 중에서 다르기 때문에 필터로부터 용출이 균일하지 않다. 이 모든 결과는 환경 물에 존재하는 바이러스의 실제 수준을 과소 평가 수 있다는 것을 의미한다. 단일 BGM 세포주의 사용은 바이러스 발생을 과소. 범위주로 polioviruses 및 엔테로 바이러스 B 종의 혈청 형뿐만 아니라 일부 reoviruses 14,15,22에 제한이 셀 라인에서 CPE를 생성 할 수 있습니다 장내 바이러스. 기타 감염성 바이러스 유형이 검출 될 수 없다. 지상 및 시약 등급의 물에서 폴리오 바이러스 복구는 모두 성과 평가 (PE에 대한 USEPA 방법 1615 성능 판정 기준을 충족, 즉, 시작하기 전에 분석의 성능을 평가하는 데 사용됩니다 애널리스트 알 수없는 역가와 시드 시약 등급의 물 샘플 연구) 및 LFB 샘플 (보충 자료 표 S1)의. 배양 절차에 지하수 중 58 % 회수 수돗물 (23, 24)를 사용하여 다른 사용자에 의해보고 된 것과 유사하다. 변동 계수가 100 % (CV) 111 %로 LFB 샘플의 평균 회복도가 PE 샘플에 대해 관찰 된 것보다 더 높은 경우에도있어서 성능 판정 기준을 충족 DURICR을 보내고. ICR은 평균 intralaboratory 회수율이 85 % (상기 ICR PE 데이터베이스에서 게시되지 않은 데이터 이력서 58 131 %)로 36까지 변화하면서 실험실 간 복구는 92 %의 편차 (CV)의 계수가 56 %이었다 의미한다. 높은 회수율 높은 종자 샘플 (1백22퍼센트 42 대)보다 낮은 시드 LFB 샘플에 대한 본 연구에서 관찰되었다. ICR가 계획 될 당시에, 그것은 낮은 시드 값을 수신 PE 샘플은 그 높은 종자를 수용하는 것이 낮은 회복했을 것으로 예상되었다. LFB 샘플 여기 관찰 된 것과 유사한, ICR PE 샘플에 대한 폴리오 복구 시드 값 (CV, 100 %), 54 % (CV 69 %) 및 ​​44 % (CV 71 %) 71 %였다 ≤300 MPN, 300- 각각 1,500 MPN, 및&gt; 1500 MPN. 물 샘플 25 전염성 바이러스를 측정하기위한 많은 방법이있다. 이 방법은 표준화의 정도에 다른 방법에 관하여 중요하다. 표준화, 품질 및 성능 컨트롤이 포함뿐만 아니라,뿐만 아니라 모든 분석 실험실은 동일 방법을 수행하도록 정의 된 볼륨과 수식을 사용합니다. 표준화 없이는 실험실에 걸쳐 결과를 비교하는 것은 곤란하고, 복수의 분석 실험실에서 대규모 연구를 수행 할 때, 따라서 표준화가 필수적이다. 내장 표준화이 방법은 추가로 바이러스 유형 및 세포주를 포함하는 미래에 확장 할 수있다. 연구 방법에 아데노 바이러스를 포함하기 위해 데이터를 제공하는 것.

A correction was made to: <a href="www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

장 바이러스는 인간의 장 시스템을 감염 및 분변 - 경구 경로를 통해 전송되는 바이러스의 다양한 그룹입니다. 이 바이러스는 하수 처리장 및 오수 정화조 폐수, 잘못 설계되거나 깨진 정화조, 깨진 하수도, 결합 하수 오버 플로우 및 기타 점과 비점 원 1-4을 통해 표면 및 지상 물을 입력합니다. 수 인성 바이러스의 인간 감염과 질병은 오염 또는 부적절하게 소독 물 소비를 통해 또는 레크리에이션 물 접촉을 통해 발생합니다. 질병 증상이 심한 위장염에 가벼운 포함 할 수있다; 결막염; 열; 상부 호흡 곤란; 수족구 병; 심근염; 무균 성 뇌막염; 뇌염; 마비; 패혈증 5-8, 죽음 9,10. USEPA 방법 1615 환경 마시는 물에서 감염 장내 바이러스 입자를 측정하는 절차를 제공합니다. 이 물은 포함 할 수 있습니다감염성 및 비 감염성 비리의 혼합물,하지만 전염성 입자는 잠재적 인 건강 위험을 포즈. 감염성 바이러스 입자로 인해 11 ~ 13 존재할 수있는 소독제로 단백질 캡시드의 무결성 인해 자외선 광선 방사선 손상에 핵산 손상의 손실, 환경, 마시는 물에서 시간이 지남에 감염을 잃게됩니다. 상기 방법에서 제공되는 전체 바이러스 배양 절차는 버팔로 녹색 원숭이 신장 (BGM) 세포주에서 세포 변성 효과 (CPE)의 제조에 기초한다. 이 세포주는 검출 된 감염성 바이러스 유형의 범위가 특정 엔테로 15 주로 제한 되더라도 때문에 환경 바이러스학 분야 14,15에서의 광범위한 사용으로 선택되었다. 이 논문의 목적은 다섯 인치 전기 양성 카트리지 필터의 용출, 보조 농도, 총 배양 바이러스의 측정 방법 1615의 절차를 설명하는 것입니다. 의 평가전체적인 방법은 Cashdollar 외. (16)에 대하여 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:149px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Beef extract, desiccated powder</td>
			<td style="width:120px;">BD Bacto</td>
			<td style="width:143px;">211520</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Cryogenic tubes</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:143px;">3775/945373</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hank&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">14170-112</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mechanical rocking platform</td>
			<td style="width:120px;">Daigger</td>
			<td style="width:143px;">EF4907G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:143px;">14-285-729</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sterilizing filter with prefilter</td>
			<td style="width:120px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">28143-295</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sterilizing syringe filter</td>
			<td style="width:120px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">431219</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">pH Standards</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">33643, 33646, 33648</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">M1018 or M4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Leibovitz L-15</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sodium bicarbonate, 7.5%</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">10082-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Trypsin, EDTA</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. ii. total culturable virus assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

바이러스는 세 식수 처리장 전용 잘 이용한 전기 양성 필터의 소스 지하수에서 농축시켰다. 필드 샘플 LFSM 제어 이루어진 두 개의 샘플 세트는, 차례에 처리장에서 수집하고, 하나의 샘플 세트는 전용 웰로부터 수집 하였다. 각 샘플에 사용되는 종자의 MPN 값이 정확하게 때문에 판단 할 수 없기 때문에 전체 바이러스 복구는 계산에서 제외 된 식물과 민간 아니라 (한 식물과 서로 하나의 샘플에서 두 샘플의 두에서 LFSM 샘플을 사용하여 측정 하였다 복제 플라스크 중 이상 CPE 결과)에. 지하수 샘플에서 소아마비 바이러스의 회복을 의미한다 (그림 2) 16 79 %의 변동 계수가 58 %의 평균. 배양 가능한 바이러스 복제 시드 화 지하수 필드 표본에서 검출되지 않았다. 방법의 성능은 LFB (S)로 측정 하였다amples 두 가지 시드 수준​​을 사용하여 개질. 폴리오 바이러스의 1000 MPN은 상기 성능을 테스트하는데 사용 하였다 폴리오 300 MPN의 A &quot;LOW&quot;역가 USEPA 방법 1615 A​​ &quot;높은&quot;역가에서 사용되는 &quot;표준&quot;500 MPN LFB 레벨 미만 수준의 성능을 평가 하였다 LFSM 제어의 수준입니다. 이러한 컨트롤 111 %의 평균 복구 및 100 %의 변동 계수 (그림 2)와 유사하게 수행 하였다. 모든 LRB 샘플은 음성이었다 모든 LFB 샘플 수용 범위 (보충 자료 표 S1) 내에서 수행. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> 도 1 필터 용출. 카트리지 필터 용출하는 압력 용기를 사용하는 개략도가 도시되어있다. 양의 공기 압력이 카트리지 하우징 콘 통해 압력 용기 비프 엑기스 용액을 밀어 사용전기 양성 카트리지 필터 이닝. 펌프의 유입구는 쇠고기 추출액 채 컨테이너에 배치되면서 연동 펌프는, 압력 용기로 대체 될 수있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> 지상에서 그림 2. 평균 폴리오 바이러스 복구 (%) 및 시약 급 물. 평균 회수율은 지상에서 소아마비 바이러스에 대해 표시됩니다 ( <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; N = 4), 시약 등급의 물 ( <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; 여기서 n은 = 12) 샘플. 열두 시약 등급의 물 샘플 여섯이 소아마비 바이러스의 1,000 MPN 시드 300 MPN 여섯 시드 포함되어 있습니다. 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다.

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K 조회수.  U.S. Environmental Protection Agency. Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

비디오: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

물에서 바이러스 농도에 대한 작은 볼륨 절차

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

연구

환경과학

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석<em&gt; 엔테로 종.</em&gt;과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP, 개선 INEX 방법에 대한<em&gt; 현장에서</em&gt; 미립자의 측정 및 용존 화합물은 액티브 서스펜션 피더에 의해 처리

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

소형 인 결정 방법을 사용 하 여 세분화 된 제 2 철 수산화에 Phosphonates의 흡착을 결정 하기 위한 최적화 된 절차

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Tilapia 호수 바이러스를 사용 하 여 기존의 RT-PCR 및 SYBR의 탐지 RT 정량 그린

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

15개의질소 분석을 위한 마이크로플롯 설계 및 식물 및 토양 샘플 준비

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

토양에서 미립자 유기물을 제거하는 정전기 방법

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...

A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The rhizosphere chemistry of wetland plants is particularly challenging to capture because of steep oxygen gradients from the roots to the bulk soil. Here a protocol is described that effectively preserves root structure and rhizosphere chemistry of wetland plants through slam-freezing and freeze drying. Slam-freezing, where the sample is frozen between copper blocks pre-cooled with liquid nitrogen, minimizes root damage and sample distortion that can occur with flash-freezing while still minimizing chemical speciation changes. While sample distortion is still possible, the ability to obtain multiple samples quickly and with minimal cost increases the potential to obtain satisfactory samples and optimizes imaging time. The data show that this method is successful in preserving reduced arsenic species in rice roots and rhizospheres associated with iron plaques. This method can be adopted for studies of plant-soil relationships in a wide variety of wetland environments that span concentration ranges from trace-element cycling to phytoremediation applications.

We describe a protocol to sample, preserve, and section intact roots and the surrounding rhizosphere soil from wetland environments using rice (Oryza sativa L.) as a model species. Once preserved, the sample can be analyzed using elemental imaging techniques, such as synchrotron X-ray fluorescence (XRF) chemical speciation imaging.

원소 이미징을 위한 습지 뿌리와 류스피어를 보존하는 방법

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

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