저자는 자신의 기술 지원 토마스 Mison에게 감사하고, 원고를 수정하기위한 레이첼 한전합니다.

1. 세균성 문화 <ol><li> LB 한천 배지의 플레이트의 표면에, LB (루리아 - 베르 타니 배지)에 30 ° C에서 배양 한 균주의 하룻밤 배양 100 μl를 분산시켜 박테리아 (바실러스 세레 우스 균주 ATCC 14579)의 잔디를 준비한다. 30 ℃에서 하룻밤 접시를 품어. </li></ol> 2. ECL : 등가 체인 길이 <ol><li> 다음과 같이 ECL을 계산합니다 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/54960/54960eq1.jpg" /> 와: 내가 관심있는 용질; N, 용질 전에 용출 직쇄 포화 지방산 메틸 에스테르의 탄소수 I; N + 1, 용질 후 용출 직쇄 포화 지방산 메틸 에스테르의 탄소수 I; RTI, RTN,있는 걸 (N + 1) 상기 FAME 피크의 유지 시간. 주 : (표준 혼합 주사 B가 직쇄 포화 지방산 메틸 에스테르의 체류 시간을 구하는AME). </li></ol> 3. FAME 준비 및 분석 <ol><li> 한천 플레이트에서 콜로니를 긁어 지질 지방산, 수확물 균체를 얻고 스크류 캡과 PTFE 씰 10 mL 유리 튜브에 박테리아 (109 생세포 등가 신선 중량) 40 mg을 전송하기 위해. </li><li> 아래에 설명 에스테르 링크 방법 14, 15을 통해 에스테르 교환 반응을 수행합니다. <ol><li> 신선한 박테리아 세포에 메탄올 0.2 M KOH의 5 ML을 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. 이 반응은 지질에 에스테르 연결을 끊고 지방산 메틸 에스테르를 생산하고, 알칼리 메탄 구성된다. </li><li> 7.0 pH를 낮추기 위해 1 M 아세트산 1 ㎖를 추가한다. 산도 테스트 스트립 pH를 확인합니다. </li><li> FAMES를 추출 헥산 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 약 200 μL를 얻는 질소의 연속 흐름하에 실온에서 증발시켜 깨끗한 튜브에 상청 (유기상)을 전송하고 집중추출물. 삽입과 GC 바이알에 샘플을 전송합니다. </li><li> 가스 크로마토 그래피 질량 분석 (GC-MS)로 추출 시스템을 주입한다. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS 조건 <ol><li> 모세관 컬럼 ZB-WAX (직경 0.25 mm, 필름 두께 0.25 ㎛의 길이, 30m)를 구비 한 GC-MS 기기 FAME에 샘플을 주입. </li><li> (비분 모드) 주입구 250 ° C까지 온도를 설정합니다. 37cm / sec의 속도로 선형, 캐리어 가스로서 헬륨을 사용한다. 20 ° C / 분의 속도로 190 ℃로 증가시키고, 2 ℃ / 분의 속도로 230 ℃의 최종 온도로 점진적 증가, 1 분 동안 50 ° C의 오븐 온도를 잡아. </li><li> 상기 MS를 들어 70 eV로에서 전자 이온화 (EI)에 의하여 질량 스펙트럼을 기록하고, 50 내지 400 원자 질량 단위 (AMU) (2 스캔 / 초) 사이에 총 이온 전류의 인수를 설정한다. </li><li> 필요한 경우, 동일한 조건 excep에서 DMOX 및 picolinyl 파생 상품을 주입다음과 같이 온도 프로그램 오븐 T : DMOX : 50 ° C (1 분), 20 ° C 210 ° C까지 / 분, 2 ° C / 분 240 ° C (5 분)까지; Picolinyl : 6 ° C (1 분), 220 ° C까지 20 ° C / 분, 250 ° C (20 분)까지 2 ° C / 분. </li></ol> FAME (16) 5. Picolinyl 에스테르 준비 <ol><li> 질소의 흐름 (적어도 10 mg의 건조 물질)와 함께 제 3 항 중 FAME 추출액을 증발 건조 디클로로 메탄 1 ㎖에 용해. </li><li> 테트라 히드로 푸란 칼륨 터 t- 부톡 사이드의 1.0 M 용액을 준비합니다. </li><li> 명성 추출물 단계 5.2에서 만든 용액 0.2 ml의 3 피리딘 메탄올 0.1 ML을 추가합니다. </li><li> 밀폐 된 바이알에서 30 분 동안 40 ° C에서 상기 용액을 가열한다. </li><li> 실온으로 냉각시킨 후, (재료 표 참조, 2 ㎖)와 헥산 (4 mL) 중 정제 된 탈 이온수를 추가한다. 와류 혼합 상을 분리 할 수 ​​있도록하고, 유기상을 수집한다. </li><li> 박사유기상까지 무수 황산나트륨을 첨가하여 Y 완벽하게 알 수있다. 깨끗한 튜브로 전송합니다. 그런 다음 200 μl를 증발. 삽입과 GC 바이알에 샘플을 전송합니다. </li></ol> FAME (17) 6. DMOX 준비 <ol><li> 질소 (최소 10 mg의 건조 물질)의 흐름을 제 3의 FAME 추출물을 증발. </li><li> 명성 건조 추출물에 2- 아미노 -2- 메틸 -1- 프로판올 250 ㎎을 추가. 질소 용기를 세척하는 스토퍼를 추가하고, 190 ℃에서 하룻밤 가열 블록에 넣습니다. </li><li> 실온으로 냉각 한 후, 튜브를 3 ml의 디클로로 메탄을 추가하고, 5 ml의 탈 이온수 (재료 표 참조) 정제 하였다. </li><li> 상 분리 흔들어 후, 수성 상을 제거합니다. </li><li> 5 ㎖의 물, 유기 상을 세척한다. 상 분리 흔들어 후, 수성 상을 제거합니다. </li><li> 유기상까지 무수 황산나트륨을 첨가하여 건조 완벽하고 명확한깨끗한 튜브로 전송할 수 있습니다. 200 μL의 부피에 도달 할 때까지 질소 기류 하에서 증발시켰다. 삽입과 GC 바이알에 샘플을 전송합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipid Analysis 4th Edition. , (2010).</li><li>H&#220;bschmann, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , (2015).</li><li>Sasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Bacteria+by+Gas+Chromatography+of+Cellular+Fatty+Acids.">Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids.</a> MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).</li><li>Spitzer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+analysis+of+fatty+acids+by+gas+chromatography+-+Low+resolution+electron+impact+mass+spectrometry+of+their+4,4-dimethyloxazoline+derivatives+-+A+review.">Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review.</a> Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).</li><li>Harvey, D. J., Christie, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in lipid methodology. Volume 1. , 19-80 (1992).</li><li>Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebreti&#232;re, M. -. H., Broussolle, V., Brillard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+fatty+acids+in+Bacillus+environmental+adaptation.">Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation.</a> Front Microbiol. 6, (2015).</li><li>Brillard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Bacillus+cereus+Genes+Specifically+Expressed+during+Growth+at+Low+Temperatures.">Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).</li><li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Anaerobiosis+and+Low+Temperature+on+Bacillus+cereus+Growth,+Metabolism,+and+Membrane+Properties.">Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).</li><li>Diomand&#233;, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+CasK/R+two-component+system+in+optimal+unsaturation+of+the+Bacillus+cereus+fatty+acids+during+low-temperature+growth.">Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth.</a> Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).</li><li>Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P., Berkeley, R. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. , 1-7 (2002).</li><li>K&#228;mpfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+and+Possibilities+of+Total+Fatty+Acid+Analysis+for+Classification+and+Identification+of+Bacillus+Species.">Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species.</a> System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).</li><li>Kaneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty-acids+of+genus+bacillus+-+example+of+branched-chain+preference.">Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference.</a> Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).</li><li>Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+Biosynthesis+of+Unsaturated+Fatty+Acids+in+Bacillus+cereus+ATCC+14579+and+Functional+Characterization+of+Novel+Acyl-Lipid+Desaturases.">Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).</li><li>Sasser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Bacillus+anthracis+from+culture+using+gas+chromatographic+analysis+of+fatty+acid+methyl+esters.">Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters.</a> J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).</li><li>Schutter, M. E., Dick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fatty+acid+methyl+ester+(FAME)+methods+for+characterizing+microbial+communities.">Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities.</a> Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).</li><li>Destaillats, F., Angers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+methodology+for+the+synthesis+of+FA+picolinyl+esters+from+intact+lipids.">One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids.</a> J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).</li><li>Fay, L., Richli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+double-bonds+in+polyunsaturated+fatty-acids+by+gas-chromatography+mass-spectrometry+after+4,4-dimethyloxazoline+derivatization.">Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization.</a> J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).</li><li>Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+in+mass+spectrometry+IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines+as+derivatives+for+the+double+bond+location+of+long-chain+olefinic+acids.">Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids.</a> Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).</li><li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unsaturated+fatty+acids+from+food+and+in+the+growth+medium+improve+growth+of+Bacillus+cereus+under+cold+and+anaerobic+conditions.">Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).</li><li>Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic+characterization+of+fatty+acids.Identification+constants+for+mono-+and+dicarboxylic+methyl+esters.">Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters.</a> Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).</li><li>van Den Dool, H., Kratz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generalization+of+the+retention+index+system+including+linear+temperature+programmed+gas-liquid+partition+chromatography.">A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography.</a> J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).</li><li>Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+equivalent+chain+length+values+of+monoenic+and+polyenic+(methylene+interrupted)+fatty+acids.">Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids.</a> J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

표 1에 나타낸 FA를 크로마토 프로필 한천 플레이트 표면에 성장 B. 세레 우스 ATCC 14579에 대응한다. 세균을 동일 온도에서 8 통기 액체 배지에서 성장했을 때 유사한 프로파일을 얻었다. 액체 배지에서 성장 세균의 경우 세균 미생물이 성장 배지를 원심 분리에 의해 회수하고, 성장 조건에 따라 8,19 전술 한 프로토콜에 따라 세척 될 수있다. B. 세레 우스에 의해 생성 된 각종의 FA 식별 저온 7,9의 성장에 필요한 몇 가지 유전자 돌연변이 균주에서 검출 될의 FA 비율에 미세한 변화를 허용. 보통, ECL은 고정 된 온도에서 결정된 조정 된 체류 시간의 로그 값을 사용하여 계산된다 (20) (등온 온도 제어 오븐을 사용하여). 여기서 때문에 P에 비등 레인지의 사용관심 FAME 최적화 된 분리 ermit, 계산 방법은 이전에 선형 고정 지수 3,21 대해 기재된 것을 사용했다. 이 연구의 목적은, 문헌에 기재된 것과 산출 ECL 값을 비교하지만, 이러한 보존 데이터 및 스펙트럼 정보에 기초하여, 동일 크로마토 프로파일 내에 FA 구조를 예측할 수 없었다. 실제로, 포화 FA를 들어,은 (이소 또는 안테 이소) 분기 주어진에 해당하는 직 쇄상 FA에 비해 항상 ECL에서 같은 변화가 발생합니다. 또한, ECL은 동일 극성의 열 Stransky (22)에 의해 측정 된 값과 일치 본 연구에서 계산. 이전에보고 된 값이 동의는 ECL 값이 따라서, 다른 균주의 다른 조건에서 재배 B. 세레 우스의 FA를 크로마토 그램 프로파일 (예., 돌연변이) B. 세레 우스의에서 피크의 신속한 식별을위한 매우 유용하다는 것을 나타냅니다. <p<html> 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; Picolinyl 유도체 긴 체류 시간을 표시하지만, 시험 된 다른 유도체에 비해 낮은 신호 / 잡음비. 이전 보고서는 용출 4 더 어려운 것이 좋습니다. 낮은 막 두께, 바실러스 종 18 미만 탄소수 FA에 포함되어 있다는 사실과 컬럼의 사용이 가능 고품질 GC-MS 크로마토 그램을 생성하기 위해 동일한 극성 크로마토 그래피 컬럼을 사용할 수 있도록하는 것이 쉽다 3 파생 상품. 이중 결합의 위치가 더 용이 DMOX 유도체 할당하면서 Picolinyl 유도체, DMOX 유도체에 의해 생성 된 이온보다 분지 위치를 나타내는 이온 이상의 특성을 제공한다. 본 연구는 지금까지 제대로 문헌에 기술 된 B. 세레 우스로부터의 FA 불포화 메틸 분지 쇄를 식별 유도체 모두로부터의 정보를 조합의 유용성을 보여준다. jove_content &quot;&gt; 제안 된 방법은 NMR 분광 분석에 대한 비교로서, 각 FA가 작업 및 생물학적 물질의 대량의 수주를 나타내는 정제한다. 이일 내에 완료 될 수있다. 그러나, 접근법 (형상을 구별하지 않는다 이중 경계) 시스, 트란스. 일단 각 FA가 식별되고, 이들은 통상적 균주 및 변이체를 비교하거나 성장 조건의 영향을 연구하기 위해, 즉 그들의 FAME 유도체에 의해 정량화 될 수있다. 우리 손에 작은로 8 mg의로 신선한 박테리아 세포. 박테리아 성장하기 어려운 적용 방법하게 식별 FA들 각각에 대한 정량 한계는 GC / MS에 주입 액 1 NG / μL 인 FA를 정량화, 충분한 하였다들.

지방산 메틸 에스테르 (FAME) 기체 크로마토 그래피 (GC)의 지질 특성에 필수적인 메소드이다. 이는 신속 분리 짧은 추출 공정 후의 시료의 각종 지방산 (FA들)을 정량화한다. 메틸 에스테르의 유도체는 크로마토 그래피 컬럼을 향해 매우 휘발성 안정하고 불활성시켜 미행 피크를 회피. 크로마토 그래피 프로파일 중 하나를 게시 또는 기준에 비교하기 때문에 샘플이 잘 알려진 FA를 구성 할 때 그들의 인식은 오히려 간단합니다. 또한, 각종의 FA 정량 검정 표준의 반복 분사 불꽃 이온화 검출 (FID) 한 그들의 거의 일정한 응답 주어진 요구되지 않는다. FID에 더하여, 질량 분광 (MS) 검출 FAMES를 확인하는 내용의 상보 세트를 제공한다. FAMES가 전자 이온화 (EI)를 이용하여 충전하는 경우에는, 결과적인 스펙트럼은 항상 일을 허용하지FA 미세 구조의 전자 식별. 진단 이온 하나를 감지하기 어렵고 대상 이온 풍부 특성 변화가 질량 스펙트럼 라이브러리 (2)의 사용을 방지하는 시스템에 의존하기 때문에 예를 들어, 위치를 분기 (즉, 측쇄 메틸기)을 예측하는 것은 곤란하다. 또 다른 문제는 EI는 이중 결합의 이동을 야기하기 때문에 이중 결합의 위치를 ​​식별에있다. 따라서, 이중 결합의 위치를 ​​변화와 FA 이성질체들은 질량 스펙트럼에 의해 구별 될 수 없다. 다행히도 다른 도구 FA 식별을 위해 개발되었다. 예를 들어, 존재 및 준하여 이중 결합 또는 분지의 위치는 해당 체인 길이 (ECL) (3)을 계산함으로써 추측 할 수있다. 기타 유도체 화 방법은 이중 결합 또는 측쇄 메틸기의 위치에 따라 서로 다른 질량 스펙트럼 결과. 4,4- 디메틸 옥사 졸린 유도체 (DMOX) 4 EAS 허용불포화 지방산의 이중 결합의 위치의 Y 식별. 에스터 (picolinyl 에스테르) 메틸 유도체의 위치의 명확한 식별이 가능 -3- pyridylcarbinyl는 FA를 5 분지. 핵 자기 공명 (NMR) 스펙트럼 구조 특성 1의 uncontestable 방법에 필요한 정제의 복잡한 방법을 사용하지 않고도 크로마토 유지율 (ECL) 질량 스펙트럼 (DMOX 및 picolinyl) 정보는 대부분의 FA의 식별을 가능하게 결합 . 일부 인간과 동물의 병원체를 포함 바실러스의 박테리아는 매우 다양한 틈새 시장에 정착 할 수 있으므로 널리 환경 (6)에 배포됩니다. 바실러스 속 중에서, FA 조성물 (환경 변화의 넓은 범위에 적응 FA 패턴의 변조와 종의 생태적 틈새에 의해 영향을 받는다 예를 들어, 성장 배지, 온도,산도 등) 7-9. 이 때문에 표준 조건에서 성장 동안 바실러스 종의 FA에 걸쳐 패턴의 상대적 균질성에, FA 조성물의 결정은 바실러스 종을 정의하는 데 사용되는 중요한 조건 중 하나이다. 바실러스 속의 독특한 특성은 12-17 탄소 ISO 및 환경 조건에 대한 적응의 주요 결정 인 안테 이소 이성체의 비율로 10-12 분지 쇄의 FA 풍부하다. 바실러스 종은 불포화 지방산의 비율을 변경함으로써, 환경의 변동에 적응. 이러한 바실러스 세레 우스와 같은 일부 종에서는,이 지방산 desaturases 적응 9 다른 역할로 알킬 체인 (13)의 다른 위치에 이중 결합을 만들 수 있습니다. 바실러스 속의 예 정확하게 이중 결합의 위치를 식별하고 FA 분지의 중요성을 나타낸다. 수집ively, 바실러스 FA 패턴의 식별은 몇 가지 유용한 응용 프로그램이 있습니다. 여기서, 우리는 고전 GC-MS 분석의 고유 한 한계를 극복 바실러스 FA 패턴을 식별하기위한 신규 GC-MS 방법을 제안한다. 이 혁신적인 접근 방식은 원시 생물학적 물질에 직접 사용하고, 기존 기술의 조합으로 구성 할 수 있습니다 체류 시간 (ECL) 및 다른 FA들 유도체 (FAME, DMOX 및 picolinyl 에스테르)의 질량 스펙트럼에 대한 정보를 제공합니다. 우리는 다음과 FA 명칭을 사용합니다. a 및 n은 ISO를 나타낸다 난, 안테 이소 메틸 각각 분지 및 직쇄 지방산. 불포화의 FA는 C로 명명 하였다 : C는 탄소 지방산 원자 및 (D)의 수이고, D는 이중 결합의 수이다. Δ의 X는 이중 결합이 카르 복실 말단으로부터 계수, x 번째의 탄소 - 탄소 결합에있는 이중 결합의 위치를 나타낸다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>QP2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capillary column ZB WAX</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>7HG-G007-11</td>
			<td>30m x 0.25mm x 0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Lichrosolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.06018.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THF</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>28559.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>23373.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>24575.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pyridinemethanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>P6-680-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium tertiobutoxide</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>156671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-amino-2-methyl-1-propanol</td>
			<td></td>
			<td>A-9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47080-U Supelco</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of fatty acids in bacillus cereus

바실러스 종 메틸 분기의 다양한 위치 체인 및 불포화 지방산 (FA들)을 포함 분지 (ISO 또는 안테 이소) 및 이중 결합. FA 조성물의 변화는 환경에 박테리아의 적응에 중요한 역할을한다. 이러한 수정은 안테 이소 FA들에 비해 분지 ISO의 비율의 변화를 수반하고, 특정 위치에 생성 된 이중 결합을 갖는 불포화 포화 FA를 FA에 대하여, 비율이다. 각 FA 프로파일의 정확한 식별은 바실러스 종의 적응 메카니즘을 이해하는 것이 필요하다. 바실러스에서의 FA의 대부분은 상업적으로 사용할 수 없습니다. 지방산 메틸 에스테르 (FAMES), 4,4- 디메틸 옥사 졸린 : 본 명세서에서 제안 된 전략은 세 FA 유도체의 종류의 질량 스펙트럼과 (등가 체인 길이 (ECL)의 연산에 의해) 보유 시간에 대한 정보를 조합하여 FA를 식별 파생 상품 (DMOX), 및3 pyridylcarbinyl 에스터 (picolinyl). 이 방법은 미지의 FA를 정제 할 필요없이 FA를 식별 할 수있다. 표준 상용 혼합물 바실러스 세레 우스로부터 제조 FAME의 크로마토 그래피 프로파일을 비교하는 다른 FA들 중 신원의 FA의 ECL의 계산 및 가설 포화 직쇄의 식별을 허용한다. FAMES의 탄소수가 동일한 수의 선형 포화 FA들에 비해 FA들, 또는 ISO 안테 이소에서, ECL에 일정한 마이너스 시프트를 표시 포화 분지. 불포화의 FA FAMES는 분자 이온의 질량을 감지하고 대응하는 포화 FA들에 비해 ECL의 양의 변화가 발생할 수있다. FA들의 분기 위치의 FA 불포화 이중 결합의 위치는 각각 picolinyl 및 DMOX 유도체의 전자 이온화 질량 스펙트럼에 의해 확인 될 수있다. 이 접근법은 모든 미지의 포화 지점을 식별ED의 FA 불포화 직쇄 FA들 및 B. 세레 우스 추출물의 불포화 측쇄의 FA.

박테리아 세포에서 FA 식별의 전략은 그림 1에 제시되어있다. 각 단계는 상호 보완적인 스펙트럼 정보 또는 크로마토 그래피 보존에 대한 정보를 제공합니다. 1 단계는 표준 용액을 사용하여 예비 FA 식별 구성된다. 단계 2 임시 제품을 식별하기 위해, FAME EI 스펙트럼 및 ECL의 해석을 허용한다. 3 단계는 분지 쇄-의 FA의 정확한 분기 위치를 식별합니다. 마지막으로, 4 단계는 불포화의 FA에 이중 결합의 정확한 위치를 식별합니다. FAME 및 ECL BAME 혼합물은 우리가 직쇄 포화 지방산의 시리즈 (N17에서 N12)를 식별하도록 허용 일부 메틸 지방산 (I15, A15, I16, I17)를 분지. 그러나, B. 세레 우스에 거의 FA들에 특정는 develo의 정당화, 우리의 샘플에서 검출되었다식별 방법에 대하여 설명시 발생한. 무관 사슬 길이의 분지 쇄 포화 FA를 상동 시리즈 (ISO은 또는 안테 이소) (즉, 동일한 화학식을 갖는 화합물의 시리즈)의 직선 포화 FA가 탄소 동일한 수를 갖는 비교 ECL에 일정한 변화를 표시 그들의 탄소 사슬. 이러한 변화라는 부분 체인 길이 (FCL)는 상 동성 시리즈의 FA의 식별이 가능합니다. (접두사 &quot;A&quot;로 표시) 안테 이소의 FA는 -0.33의 FCL있는 동안 예를 들어, 이소의 FA가 (접두사로 표시 &quot;난&quot;), -0.48의 FCL 값을 가지고있다. 이 각각 13.52 및 12.52의 일 ECL 함께 I14과 I13를 식별 한 다음 용이하고, 각각 12.67 및 14.66의 일 ECL와 A13 및 A15. 표 FA들 각각에 대한 1 표시으로 ECL은 우리의 샘플에서 검출. 체류 시간 예측함께 MS 스펙트럼과 FAMES 얻을 ISO 및 안테 이소 시리즈 ED는, 우리의 샘플에서 분지 쇄-FA를 모두 식별 할 수있었습니다. 이 단계에서 이러한 확인은 임시했지만, 나중에 picolinyl의 FA 유도체에서 얻은 EI 스펙트럼에 의해 확인. 자신의 분자 이온의 질량으로 표시된 바와 같이 ISO에 해당하지으로 ECL 또는 안테 이소 변화와 FAMES는 직선 또는 분지 쇄의 FA, 불포화된다. 해당 포화 FA에 비해 불포화의 FA는 ECL에 긍정적 인 변화를 보여줍니다. 분지의 FA에 대한 picolinyl 유도체로부터 스펙트럼 결합 DMOX 유도체로부터 스펙트럼은, 이중 결합의 위치의 식별을 허용한다. 이러한 유도체 화 방법은 그림에있는 3 개의 유도체의 혼합물 (즉, FAME, DMOX 및 picolinyl)에 대해 도시로 용출 순서가 유지되는 경우에만 FA 식별에 적합하나의 FA : 16 몇 가지 2. 이 방법은 FA 구조를 식별하기 위해 결합 될 수있는 3 유도체 화 방법을 이용하여 하나의 피크의 상보 스펙트럼 정보의 수집을 허용한다. 체류 시간 및 오븐 온도가 다르다하더라도 용출 순서 차이는 3 파생 상품 사이에 관찰되지 않았다. 이소의 Picolinyl 에스테르 및 안테 이소 메틸 분지 쇄 포화 지방산 EI 의해 얻어진 스펙트럼 메틸 분지 쇄의 FA의 존재를 확인한다. 실제로, 분자 이온을 포화 FA들에 대응하는 m / z있다. 우리는 치환 된 탄소 원자에 대응하는 이온이없는 분기점의 영역에서 제외 메틸렌 기의 손실에 해당하는 14 질량 단위 (AMU)의 갭 이온 시리즈를 관찰 하였다. 우리는 그 다음 이전에 만든 단편에 해당하는 두 이온 사이 28 AMU의 차이를 관찰하고분기 탄소 후. 도 3은 분기 위치를 나타내는 진단 이온 (304, 332)과 I16의 스펙트럼을 나타낸다. 직 쇄상의 불포화 지방산 DMOX 한 지방산 :도 2는 16과 관련된 다섯 가지의 피크를 나타낸다. 처음 두 피크 ECL 값이 16 &lt;있다. 우리는 그들의 구조는 확실히 분기 결론. 이들 화합물의 동정은 DMOX 및 picolinyl 에스테르 유도체에 의해 생성 된 질량 스펙트럼 해석을 요구한다. ECL&gt; 16 매치를 갖는 세 개의 피크가 직쇄 지방산 불포화. DMOX 유도체 질량 스펙트럼은 이들 화합물의 이중 결합의 위치를 ​​식별하는 진단 이온을 나타낸다. Δ 1 :도 4에 우리는 N16의 탄소 8 이중 결합의 존재를 나타내는 196과 208 사이의 12 AMU 이온의 갭을 볼 수 <sup&gt; 8 지방산, 장 (18)에 의해 정의 된 지방산 사슬 이중 결합의 위치는 경험적 규칙에 따라. 이중 결합의 위치가 탄소수 7 이전 인 경우, 진단 이온 다르다. 예를 들면, 장 (18)와 페이 17 / 탄소 (5)에 불포화 이중 결합을 갖는 FA를 들어, 이중 결합, m / z 152에서 절단 유래의 딸 이온이 m에 강렬한 홀수 딸 수반 관찰 한 Δ 5 :도 5의 (Z) (153)는 강한 m / z 153 단편 및 m / z 307 분자 이온의 존재가, N16로이 화합물을 식별한다. 메틸 분지 쇄의 DMOX picolinyl 및 질량 스펙트럼은 지방산 monounsatured 한 Δ 9 FA :도 6은 I16의 구조를 결정하는 데 사용 DMOX의 스펙트럼과 picolinyl 에스테르 유도체를 나타낸다. 의 위치분기 모두 파생 상품 28 AMU의 간격으로 표시됩니다. 도 6에 도시 된 바와 같이 picolinyl 에스테르위한 DMOX 12 AMU의 갭 (26)은 이중 결합의 위치를 식별한다. 지방산 및 진단 이온 식별 표 1은 30 ° C에서 성장 바실러스 세레 우스 ATCC 14579의 해당 진단 이온과 확인 된 다양한 지방산을 보여줍니다. 이러한 진단 이온 상보 구조 정보를 제공하고 DMOX picolinyl 에스테르 유도체에 대해 탄소 쇄의 메틸 분지의 위치 및 이중 결합을 확인한다. 진단 이온이 picolinyl 유도체 관찰하기 쉽게 때로는 DMOX 유도체 관찰하기 쉽게, 그리고 다른 시간에 있습니다 같이 두 가지 방법은, 진정으로 보완. <img alt="그림 1"<html> SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54960 / 54960fig1.jpg&quot;/&gt; 도 1 : 바실러스 세레 우스의 지방산의 식별을위한 전략. 연속 DMOX의 FAME의 질량 스펙트럼에 체류 시간 (ECL)에 대한 정보를 생성하는 단계, 및 picolinyl 에스테르의이 표시됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig2.jpg" /> 그림 2 : 바실러스 세레 우스에서 검출 한 지방산 : 다른 16 크로마토 그래피 프로파일의 비교. (A) FAME 유도체 (m에서 추출 된 분자 이온 / z 268); (B) DMOX 유도체 (m에서 추출 된 분자 이온 / z 307); (C) picolinyl 유도체 (m / z 345에서 추출 된 분자 이온).세틸 / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig3.jpg" /> 그림 3 : 전자 이온화에 의해 생성 I16 picolinyl 유도체 질량 스펙트럼. m / z 151, m / z 164에서 이온은 존재 지방산의 picolinyl 유도체를 나타낸다. m / z 347에서 분자 이온은 팔 미트 산의 이성질체로 식별됩니다. m에서, 이온 (28) 사이의 갭 AMU의 존재 / z 304, m / z 332 I16 나타낸다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig4.jpg" /> 그림 4 : N16 : 1 Δ 8 DMOX 유도체 질량 스펙트럼 전자에 의해 생성이온화. m에서 이온 / z 126 DMOX 유도체, m / z 307 (16)의 분자 이온 나타내는 1 DMOX 및 m / z 196, m / z 208에서 이온과 12 AMU의 갭의 존재 위치를 식별 탄소 8. 이중 결합의 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig5.jpg" /> 그림 5 : N16 : 전자 이온화에 의해 생성 된 1 Δ 5 DMOX 유도체 질량 스펙트럼. DMOX 1 : m에서 이온 / z 126 DMOX 유도체 나타내는 m / z 307 (16)의 분자 이온이다. 강렬한 m / z 153 이온이 탄소 (5)에있는 이중 결합의 특징 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 6 : DMOX (위)와 picolinyl (아래) I16의 비교 : 1Δ 9 스펙트럼. 두 경우 모두 28 AMU의 간극은 메틸 분지의 위치를 ​​나타낸다. 이중 결합의 위치는 각각 DMOX 및 picolinyl 유도체 12 AMU의 갭 26 AMU로 유도 될 수있다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 추정 화합물 </td><td> 분자 이온 (m / z) FAME; DMOX; picolinyl </td><td> RT </td><td> ECL </td><td> 확인 된 식별 </td><td> 진단 이온 DMOX </td><td> 진단 이온 picolinyl </td></tr><tr><td> I12 </td><td> (214), (253), (291) </td><td>7.93 </td><td> 더 참조하지 </td><td> I12 </td><td></td><td> [276 (15) 262 (0); 248 (15)] MB </td></tr><tr><td> N12 </td><td> (214), (253), (291) </td><td> 8.21 </td><td> 12.00 </td><td> N12 </td><td></td><td> [276 (10), 262 (20); 248 (20)] MB </td></tr><tr><td> I13 </td><td> (228), (267), (305) </td><td> 8.53 </td><td> 12.5 </td><td> I13 </td><td></td><td> [290 (15) 276 (0); 262 (48)] MB </td></tr><tr><td> A13 </td><td> (228), (267), (305) </td><td> 8.64 </td><td> 12.67 </td><td> A13 </td><td></td><td> [276 (48) 262 (0); 248 (65)] MB </td></tr><tr><td> I14 </td><td> (242), (281), (319) </td><td> 9.24 </td><td> 13.52 </td><td> I14 </td><td></td><td> [304 (20); 276 (45) 290 (0)] MB </td></tr><tr><td> N14 </td><td> (242), (281), (319) </td><td> 9.60 </td><td> 14.00 </td><td> N14 </td><td></td><td> [304 (7), 290 (17); 276 (17)] MB </td></tr><tr><td> I15 </td><td> 256, 295, 333 </td><td> 10.06 </td><td> 14.51 </td><td> I15 </td><td></td><td> [318 (20) 314 (0); 290 (50)] MB </td></tr><tr><td> A15 </td><td> 256, 295, 333 </td><td> 10.19 </td><td> 14.66 </td><td> A15 </td><td></td><td> [304 (30) 290 (TR); 276 (62)] MB </td></tr><tr><td> N15 </td><td> 256, 295, 333 </td><td> 10.49 </td><td> 15.00 </td><td> N15 </td><td></td><td> [318 (5), 304 (13); 290 (18)] MB </td></tr><tr><td> I16 </td><td> (270); (309), (347) </td><td> 11.04 </td><td> 15.5 </td><td> I16 </td><td></td><td> [332 (18) 318 (TR); (304) (42)] MB </td></tr><tr><td> 1 : 메틸 16 분지 </td><td> 268; (307), (345) </td><td> 11.19 </td><td> 15.64 </td><td> I16 : 1Δ 5 </td><td> [152 (2), 153 (10)] dB [292 (3), 278 (TR); (264) (2)] 메가 </td><td></td></tr><tr><td> 1 : 메틸 16 분지 </td><td> 268; (307), (345) </td><td>11.40 </td><td> 15.83 </td><td> I16 : 1 Δ (9) </td><td> [210 (3) 222 (3)] dB [292 (12) 278 (TR); 264 (40)] MB </td><td></td></tr><tr><td> N16 </td><td> (270); (309), (347) </td><td> 11.59 </td><td> 16.00 </td><td> N16 </td><td></td><td> [332 (5), 318 (15); (304) (15)] MB </td></tr><tr><td> 16 : 1 </td><td> 268; (307), (345) </td><td> 11.78 </td><td> 16.14 </td><td> N16 : 1 Δ (5) </td><td> [152 (2), 153 (10)] dB </td><td></td></tr><tr><td> 16 : 1 </td><td> 268; (307), (345) </td><td> 11.94 </td><td> 16.24 </td><td> N16 : 1 Δ 8 </td><td> [196 (5), 208 (3)] dB </td><td></td></tr><tr><td> 16 : 1 </td><td> 268; (307), (345) </td><td> 12.00 </td><td> 16.31 </td><td> N16 : 1Δ 9 </td><td> [210 (3) 222 (3)] dB </td><td></td></tr><tr><td> 16 : 2 </td><td> (266); (305), (343) </td><td> 12.18 </td><td> 16.44 </td><td> N16 : 2 Δ (5), Δ (9) </td><td> [152 (2), 153 (12)] dB [208 (1) 220 (2)] dB </td><td></td></tr><tr><td> I17 </td><td> (284), (323), (361) </td><td> 12.25 </td><td> 16.5 </td><td> I17 </td><td></td><td> [346 (20) 332 (TR); 318 (35)] MB </td></tr><tr><td> 1 : 메틸 17 분지 </td><td> 282, 321, 359 </td><td> 12.43 </td><td> 16.64 </td><td> I17 : 1Δ 5 </td><td> [152 (2), 153 (10)] dB </td><td> [344 (10), 316 (5)] MB </td></tr><tr><td> A17 </td><td> (284), (323), (361) </td><td> 12.47 </td><td> 16.66 </td><td> A17 </td><td></td><td> [332 (30) 318 (0); (304) (52)] MB</td></tr><tr><td> 1 : 메틸 17 분지 </td><td> 282, 321, 359 </td><td> 12.57 </td><td> 16.74 </td><td> I17 : 1Δ 8 </td><td> [196 (2), 208 (2)] dB </td><td> [344 (10), 316 (5)] MB </td></tr><tr><td> 1 : 메틸 17 분지 </td><td> 282, 321, 359 </td><td> 12.64 </td><td> 16.79 </td><td> I17 : 1Δ 9 </td><td> [210 (3) 222 (3)] dB </td><td></td></tr><tr><td> 1 : 메틸 17 분지 </td><td> 282, 321, 359 </td><td> 12.70 </td><td> 16.84 </td><td> I17 : 1Δ (10) </td><td> [224 (1), 236 (1)] dB </td><td></td></tr><tr><td> 1 : 메틸 17 분지 </td><td> 282, 321, 359 </td><td> 12.84 </td><td> 16.94 </td><td> A17 : 1Δ 9 </td><td> [210 (3) 222 (4)] dB </td><td> [330 (10) 316 (0); (90)] MB </td></tr></tbody></table> 표 1 : 바실러스 세레 우스 ATCC 14579로부터의 지방산의 식별. 지방산 메틸 에스테르 (FAMES)에 대한 유지 시간, 상응하는 쇄 길이 (ECL) 값 및 분자 이온과 함께 분자 이온 DMOX 진단 이온 picolinyl 유도체와 같다. [] 28 AMU 전에 탄소 분기 이후 단편에 대응하는 손실을 나타내는 MB 진단 이온 쌍. [] dB 진단 이온 쌍은 이중 결합의 절단에 해당하는 12 AMU의 손실을 나타낸다.

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Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).

지방산의 확인 시험<em&gt; 바실러스 세레 우스</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

9.5K 조회수.  INRA, Université d'Avignon. We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl). 

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A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

핵산 폴리아닐린 계 센서

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

연구

생화학

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis is an obligate pathogen that causes fatal inhalational anthrax. Bacillus cereus is considered a useful model for studying B. anthracis due to its close evolutionary relationship. The gene cluster ba1554 - ba1558 of B. anthracis is highly conserved with the bc1531- bc1535 cluster in B. cereus, as well as with the bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, indicating the critical role of the associated genes in the Bacillus genus. This manuscript describes methods to prepare and characterize a protein product of the first gene (ba1554) from the gene cluster in B. anthracis using a recombinant protein of its ortholog in B. cereus, bc1531.

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis is the obligate pathogen of fatal inhalational anthrax, so studies of its genes and proteins are strictly regulated. An alternative approach is to study orthologous genes. We describe biophysicochemical studies of a B. anthracis ortholog in B. cereus, bc1531, requiring minimal experimental equipment and lacking serious safety concerns.

재조합 단백질 발현, 결정화 및 생물 물리학 연구<em&gt; 바실러스</em&gt; 보존 된 뉴클레오티드 피로 인산화 효소, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

전압 클램프 형광 측정법<em&gt; Xenopus</em&gt; 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer tissue with minor or no modification, allowing the dietary routing between different trophic levels. However, the FA trophic marker approach is still hampered by the limited knowledge in lipid metabolism of the soil fauna. This study used entirely labelled palmitic acid (13C16:0, 99 atom%) as a tracer in fatty acid metabolism pathways of two widespread soil Collembola, Protaphorura fimata and Heteromurus nitidus. In order to investigate the fate and metabolic modifications of this precursor, a method of isotopologue profiling is presented, performed by mass spectrometry using single ion monitoring. Moreover, the upstream laboratory feeding experiment is described, as well as the extraction and methylation of dominant lipid fractions (neutral lipids, phospholipids) and the related formula and calculations. Isotopologue profiling does not only yield the overall 13C enrichment in fatty acids derived from the 13C labeled precursor but also produces the pattern of isotopologues exceeding the mass of the parent ion (i.e., the FA molecular ion M+) of each labeled FA by one or more mass units (M+1, M+2, M+3, etc.). This knowledge allows conclusions on the ratio of dietary routing of an entirely consumed FA in comparison to de novo biosynthesis. The isotopologue profiling is suggested as a useful tool for evaluation of fatty acid metabolism in soil animals to disentangle trophic interactions.

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

The fatty acid trophic marker approach, i.e., the assimilation of fatty acids as entire molecule and transfer into consumer tissue with no or minor modification, is hampered by knowledge gaps in fatty acid metabolism of small soil invertebrates. Isotopologue profiling is provided as a valuable tool to disentangle trophic interactions.

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled antibodies. It is a multistep process in which the optimization of each step is crucial to obtain the optimum specific signal. Through IHC, the distribution and localization of specific biomarkers can be detected, revealing information on evolutionary conservation. Moreover, IHC allows for the understanding of expression and distribution changes of biomarkers in pathological conditions, such as obesity. IHC, mainly the immunofluorescence technique, can be used in adult zebrafish to detect the organization and distribution of phylogenetically conserved molecules, but a standard IHC protocol is not estasblished. Orexin and endocannabinoid are two highly conserved systems involved in the control of food intake and obesity pathology. Reported here are protocols used to obtain information about orexin peptide (OXA), orexin receptor (OX-2R), and cannabinoid receptor (CB1R) localization and distribution in the gut and brain of normal and diet-induced obese (DIO) adult zebrafish models. Also described are methods for immunoperoxidase and double immunofluorescence, as well as preparation of reagents, fixation, paraffin-embedding, and cryoprotection of zebrafish tissue and preparation for an endogenous activity-blocking step and background counterstaining. The complete set of parameters is obtained from previous IHC experiments, through which we have shown how immunofluorescence can help with the understanding of OXs, OX-2R, and CB1R distribution, localization, and conservation of expression in adult zebrafish tissues. The resulting images with highly specific signal intensity led to the confirmation that zebrafish are suitable animal models for immunohistochemical studies of distribution, localization, and evolutionary conservation of specific biomarkers in physiological and pathological conditions. The protocols presented here are recommended for IHC experiments in adult zebrafish.

Presented here are protocols for immunohistochemical characterization and localization of orexin peptide, orexin receptors, and endocannabinoid receptors in the gut and brains of normal and diet-induced obesity (DIO) adult zebrafish models using immunoperixidase and double immunofluorescence methods.

면역페록시다아제 및 면역형광방법을 이용한 성인용 제브라피시의 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 수용체 식별

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

핵산 프로브를 이용한 뉴클레아제 활성의 운동 스크리닝

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...