Los autores agradecen a Thomas Mison por su apoyo técnico, y para Rachel Kopec para la revisión del manuscrito.

1. Los cultivos bacterianos <ol><li> Preparar un césped de las bacterias (Bacillus cereus cepa ATCC 14579) mediante la difusión de 100 l de un cultivo nocturno de la cepa se incubó a 30 ° C en LB (medio Luria-Bertani), sobre la superficie de una placa de medio de agar LB. Se incuba la placa durante la noche a 30 ° C. </li></ol> 2. ECL: Longitud Equivalente Cadena <ol><li> Calcular ECL como sigue: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/54960/54960eq1.jpg" /> con: i, el soluto de interés; n, el número de carbonos del éster metílico de ácido graso saturado de cadena lineal de elución antes de soluto I; n + 1, el número de carbonos del éster metílico de ácido graso saturado de cadena lineal, eluyendo después de soluto I; Rti, Rtn, Rt (n + 1) los tiempos de retención de los picos de FAME descritos anteriormente. NOTA: Obtener los tiempos de retención de los ésteres de ácidos grasos saturados de cadena recta de metilo mediante la inyección de una mezcla de estándares (BAME). </li></ol> 3. Preparación y análisis FAME <ol><li> Con el fin de obtener los ácidos grasos de lípidos, células bacterianas cosecha raspando colonias de la placa de agar y la transferencia de 40 mg (peso en fresco, el equivalente a 10 9 células viables) de las bacterias en un tubo de vidrio de 10 ml con tapones de rosca y juntas de PTFE. </li><li> Realizar transesterificación mediante el método de enlace de éster de 14,15 detalla a continuación. <ol><li> Añadir 5 ml de 0,2 M de KOH en metanol a las células bacterianas fresco y se incuba a 37 ° C durante 1 hr. Esta reacción consiste en metanólisis alcalina, rompiendo el enlace éster en el lípido y la producción de ésteres metílicos de ácidos grasos. </li><li> Añadir 1 ml de ácido acético 1 M para bajar el pH a 7,0. Comprobar el pH con tiras de prueba de pH. </li><li> Añadir 3 ml de hexano para extraer FAMEs. </li><li> Transferir el sobrenadante (fase orgánica) en tubos limpios y se concentra por evaporación a temperatura ambiente bajo un flujo continuo de nitrógeno para obtener aproximadamente 200 lde extracto. Transferir la muestra en un vial GC con parte. </li><li> Inyectar extractos en una espectrometría de masa de cromatografía de gas del sistema (GC-MS). </li></ol></li></ol> 4. Condiciones GC / MS <ol><li> Inyectar muestras FAME en un instrumento de GC-MS equipado con una columna capilar ZB-WAX (longitud, 30 m; diámetro, 0,25 mm; espesor de la película, 0,25 m). </li><li> Ajuste el puerto de inyección (en el modo sin división) la temperatura a 250 ° C. Utilice el helio como gas portador, con una velocidad lineal de 37 cm / seg. Mantenga la temperatura del horno a 50 ° C durante 1 min, aumentar a 190 ° C a una velocidad de 20 ° C / min, y aumentar aún más a una temperatura final de 230 ° C a una velocidad de 2 ° C / min. </li><li> Para la MS, registrar los espectros de masas de ionización por electrones (IE) a 70 eV, y establecer la adquisición de la corriente de iones total de entre 50 y 400 unidades de masa atómica (UMA) (2 scans / seg). </li><li> Cuando sea necesario, inyectar derivados DMOX y picolinilo bajo la misma condición except el horno programa de temperatura como sigue: DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min hasta 210 ° C y 2 ° C / min hasta 240 ° C (5 min); Picolinilo: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min hasta 220 ° C y 2 ° C / min hasta 250 ° C (20 min). </li></ol> 5. picolinilo Ester Preparación a partir de 16 FAME <ol><li> Evaporar el extracto de FAME de la sección 3 con un flujo de nitrógeno (al menos 10 mg de material seco) y se disuelve en 1 ml de diclorometano seco. </li><li> Preparar una solución 1,0 M de ter t-butóxido potásico en tetrahidrofurano. </li><li> Agregar el extracto de FAME y 0,2 ml de 3 piridinametanol a 0,1 ml de solución hechas en el paso 5.2. </li><li> Se calienta la solución a 40 ° C durante 30 min en un vial cerrado. </li><li> Después de enfriar a temperatura ambiente, añadir agua desionizada purificada (2 ml, véase Materiales Tabla) y hexano (4 ml). Mezclar con un vórtice, permiten fase para separar y recoger la fase orgánica. </li><li> Dry mediante la adición de sulfato de sodio anhidro hasta que la fase orgánica es perfectamente claro. Transferirlo a un tubo limpio. Entonces se evapora hasta 200 l. Transferir la muestra en un vial GC con parte. </li></ol> 6. DMOX Preparación a partir de 17 FAME <ol><li> Evaporar el extracto de FAME de la sección 3 con un flujo de nitrógeno (material seco de al menos 10 mg). </li><li> Para el extracto seco FAME, añadir 250 mg de 2-amino-2-metil-1-propanol. Enjuague el recipiente con nitrógeno, añadir un tapón, y lo coloca en un bloque de calentamiento durante la noche a 190 ° C. </li><li> Después de enfriar a temperatura ambiente, añadir 3 ml de diclorometano al tubo, y 5 ml agua purificada desionizada (Ver Tabla de Materiales). </li><li> Agitar durante la separación de fases y extraer la fase acuosa. </li><li> Se lava la fase orgánica con 5 ml de agua. Agitar durante la separación de fases y extraer la fase acuosa. </li><li> En seco mediante la adición de sulfato de sodio anhidro hasta que la fase orgánica es perfectamente clara ytransferirlo a un tubo limpio. Se evapora bajo una corriente de nitrógeno hasta alcanzar un volumen de 200 l. Transferir la muestra en un vial GC con parte. </li></ol>

<ol>
	<li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipid Analysis 4th Edition. , (2010).</li><li>H&#220;bschmann, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , (2015).</li><li>Sasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Bacteria+by+Gas+Chromatography+of+Cellular+Fatty+Acids.">Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids.</a> MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).</li><li>Spitzer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+analysis+of+fatty+acids+by+gas+chromatography+-+Low+resolution+electron+impact+mass+spectrometry+of+their+4,4-dimethyloxazoline+derivatives+-+A+review.">Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review.</a> Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).</li><li>Harvey, D. J., Christie, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in lipid methodology. Volume 1. , 19-80 (1992).</li><li>Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebreti&#232;re, M. -. H., Broussolle, V., Brillard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+fatty+acids+in+Bacillus+environmental+adaptation.">Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation.</a> Front Microbiol. 6, (2015).</li><li>Brillard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Bacillus+cereus+Genes+Specifically+Expressed+during+Growth+at+Low+Temperatures.">Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).</li><li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Anaerobiosis+and+Low+Temperature+on+Bacillus+cereus+Growth,+Metabolism,+and+Membrane+Properties.">Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).</li><li>Diomand&#233;, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+CasK/R+two-component+system+in+optimal+unsaturation+of+the+Bacillus+cereus+fatty+acids+during+low-temperature+growth.">Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth.</a> Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).</li><li>Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P., Berkeley, R. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. , 1-7 (2002).</li><li>K&#228;mpfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+and+Possibilities+of+Total+Fatty+Acid+Analysis+for+Classification+and+Identification+of+Bacillus+Species.">Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species.</a> System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).</li><li>Kaneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty-acids+of+genus+bacillus+-+example+of+branched-chain+preference.">Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference.</a> Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).</li><li>Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+Biosynthesis+of+Unsaturated+Fatty+Acids+in+Bacillus+cereus+ATCC+14579+and+Functional+Characterization+of+Novel+Acyl-Lipid+Desaturases.">Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).</li><li>Sasser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Bacillus+anthracis+from+culture+using+gas+chromatographic+analysis+of+fatty+acid+methyl+esters.">Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters.</a> J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).</li><li>Schutter, M. E., Dick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fatty+acid+methyl+ester+(FAME)+methods+for+characterizing+microbial+communities.">Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities.</a> Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).</li><li>Destaillats, F., Angers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+methodology+for+the+synthesis+of+FA+picolinyl+esters+from+intact+lipids.">One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids.</a> J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).</li><li>Fay, L., Richli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+double-bonds+in+polyunsaturated+fatty-acids+by+gas-chromatography+mass-spectrometry+after+4,4-dimethyloxazoline+derivatization.">Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization.</a> J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).</li><li>Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+in+mass+spectrometry+IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines+as+derivatives+for+the+double+bond+location+of+long-chain+olefinic+acids.">Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids.</a> Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).</li><li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unsaturated+fatty+acids+from+food+and+in+the+growth+medium+improve+growth+of+Bacillus+cereus+under+cold+and+anaerobic+conditions.">Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).</li><li>Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic+characterization+of+fatty+acids.Identification+constants+for+mono-+and+dicarboxylic+methyl+esters.">Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters.</a> Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).</li><li>van Den Dool, H., Kratz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generalization+of+the+retention+index+system+including+linear+temperature+programmed+gas-liquid+partition+chromatography.">A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography.</a> J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).</li><li>Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+equivalent+chain+length+values+of+monoenic+and+polyenic+(methylene+interrupted)+fatty+acids.">Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids.</a> J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Los perfiles cromatográficos FAs mostrados en la Tabla 1 corresponden a B. cereus ATCC 14579 crecido en una superficie de la placa de agar. Se obtuvieron perfiles similares cuando la bacteria se cultivó en medio líquido aireado a la misma temperatura 8. En el caso de bacterias cultivadas en medio líquido, la biomasa bacteriana se recoge por centrifugación del medio de crecimiento y se puede lavar de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente dependiendo de las condiciones de crecimiento 8,19. La identificación de los diversos conjuntos combustibles producidos por B. cereus permite cambios precisos en la proporción de la FAS para ser detectados en cepas mutadas en algunos genes necesarios para el crecimiento a baja temperatura 7,9. Por lo general, ECL se calcula utilizando valores de registro del tiempo de retención ajustado determinado a una temperatura fija (usando un horno con control de temperatura isotérmica) 20. Aquí, debido a la utilización de un horno no isotérmico a permit una separación optimizada de la fama de interés, el método de cálculo utilizado fue el descrito anteriormente para los índices de retención lineal 3,21. El objetivo de este trabajo fue no para comparar los valores calculados ECL con los descritos en la literatura, pero para predecir la estructura FA, dentro del mismo perfil cromatograma, en base a estos datos de retención e información espectros. De hecho, para las AF saturados, un dado de ramificación (iso o anteiso) siempre hace que el mismo cambio en la ECL, en comparación con el equivalente de cadena lineal FA. Además, la ECL calcula en el presente estudio emparejado con valores medidos por Stransky 22 en una columna de polaridad equivalente. Esta concurrencia con los valores previamente reportados indica que los valores de ECL son por lo tanto muy útil para una rápida identificación de los picos de perfiles de FAs cromatograma de B. cereus cultivadas en otras condiciones, o de otras cepas (por ejemplo., Mutantes) de B. cereus. <p<html> class = &quot;jove_content&quot;&gt; derivados picolinilo muestran tiempos de retención más largos pero una relación señal / ruido más bajo en comparación con los otros derivados ensayados. En informes anteriores sugieren que la elución es más difícil 4. Es probable que el uso de una columna con un bajo película de espesor, y el hecho de que las especies de Bacillus contiene conjuntos combustibles con menos de 18 átomos de carbono, hacen que sea posible el uso de la misma columna de cromatografía de polar para generar GC-MS cromatogramas de alta calidad de los derivados de 3. derivados picolinilo proporcionan más iones característicos indicativos de la ubicación de ramificación que los iones generados por derivados DMOX, mientras que la posición del doble enlace se asigna más fácilmente con los derivados de DMOX. El presente estudio muestra la utilidad de la combinación de la información de ambos derivados para identificar el metilo de cadena ramificada insaturado AF de B. cereus, que hasta ahora han sido mal descrito en la literatura. jove_content &quot;&gt; El enfoque propuesto se puede completar dentro de 2 días. A modo de comparación, por espectroscopia de RMN, cada FA debe ser purificado, que representa varias semanas de trabajo y una gran cantidad de material biológico. Sin embargo, el enfoque no diferencia la geometría ( cis, trans) de enlaces dobles. Una vez que se identifica cada AF, que se pueden cuantificar de forma rutinaria por sus derivados FAME, por ejemplo, para comparar las cepas bacterianas y mutantes o para estudiar el impacto de las condiciones de crecimiento. En nuestras manos, tan poco como 8 mg de células bacterianas frescas eran suficientes para la cuantificación de conjuntos combustibles, lo que hace el método aplicable a difíciles de cultivar las bacterias. el límite de cuantificación para cada uno de los conjuntos combustibles identificado es 1 ng / l de solución inyectada en el GC / MS.

cromatografía Fatty ácido metil éster (FAME) de gases (GC) es un método esencial para la caracterización de los lípidos. Se separa rápidamente y cuantifica los diversos ácidos grasos (FAS) de una muestra después de una etapa de extracción corto. Los derivados de ésteres metílicos son muy volátiles, estable e inerte hacia la columna cromatográfica, evitando así los picos con cola. Su identificación es bastante sencillo cuando la muestra sea de conjuntos combustibles conocidos porque los perfiles cromatográficos se publican o se pueden comparar con los estándares tampoco. Además, no se requiere la inyección repetida de patrones de calibración para la cuantificación de varios conjuntos combustibles, dada su respuesta casi constante a la detección de ionización de llama (FID) 1. Además de la FID, la espectrometría de masas (MS) de detección proporciona un conjunto de información complementaria para confirmar FAME. Sin embargo, cuando se pagan FAME usando ionización electrónica (EI), los espectros resultantes no siempre permiten THe identificación de estructura fina FA. Por ejemplo, la posición de ramificación (es decir, un grupo metilo ramificado) es difícil de predecir debido a que los iones de diagnóstico son difíciles de detectar 1 y el cambio característico en la abundancia de iones objetivo es dependiente de la máquina, evitando el uso de bibliotecas de espectros de masa 2. Otro reto consiste en identificar la posición de doble enlace, porque IE provoca la migración del doble enlace. Por lo tanto, los isómeros FA con diferentes posiciones de doble enlace no pueden ser diferenciadas por sus espectros de masas. Afortunadamente, otros se han desarrollado herramientas para la identificación FA. Por ejemplo, la presencia y la posición de ramificación o de dobles enlaces en las AF pueden conjeturaron mediante el cálculo de la longitud de cadena equivalente (ECL) 3. Otros métodos de derivatización resultan en diferentes espectros de masa, dependiente de la localización de un doble enlace o un grupo metilo ramificado. 4,4-dimetil derivados de oxazolina (DMOX) 4 permiten a EASy la identificación de la posición de los dobles enlaces de ácidos grasos monoinsaturados. 3-pyridylcarbinyl éster (éster picolinilo) derivados permiten la identificación inequívoca de la ubicación de metilo ramificado AF 5. La combinación de la retención cromatográfica (ECL) y espectros de masas (DMOX y picolinilo) información permite la identificación de la mayoría de las AF sin la necesidad de utilizar métodos complejos de purificación, como se requiere para la resonancia magnética nuclear espectro (NMR), el método incontestable para la caracterización estructural 1 . Las bacterias del género Bacillus, que incluyen algunos agentes patógenos humanos y animales, son capaces de colonizar muy diversos nichos y por lo tanto están ampliamente distribuidos en el medio ambiente 6. Entre el género Bacillus, composición FA está influenciada por el nicho ecológico de las especies con las modulaciones en los patrones de FA para adaptarse a una amplia gama de cambios ambientales (por ejemplo, medio de crecimiento, temperatura,pH, etc.) 7-9. Debido a la homogeneidad relativa de la pauta FA través de las especies del género Bacillus durante el crecimiento en condiciones estandarizadas, determinación de la composición FA es uno de los criterios esenciales utilizados para definir las especies de Bacillus. Un atributo único del género Bacillus es la abundancia de las AF de cadena ramificada que contienen 12-17 átomos de carbono 10-12 con la relación entre la ISO y anteiso isómeros son un determinante clave de la adaptación a las condiciones ambientales. Especies de Bacillus también se adaptan a las fluctuaciones ambientales mediante la alteración de la proporción de ácidos grasos insaturados. En algunas especies, tales como Bacillus cereus, dos desaturasas de ácidos grasos crean enlaces dobles en diferentes posiciones de la cadena de alquilo 13 con diferentes roles en la adaptación 9. El ejemplo del género Bacillus ilustra la importancia de identificar con precisión la posición de doble enlace y FA ramificación. Recogervamente, la identificación de patrones de Bacillus FA tiene varias aplicaciones útiles. En este documento, se propone un nuevo enfoque de GC-MS para la identificación de patrones de Bacillus FA que supera las limitaciones inherentes de un análisis clásico GC-MS. Este enfoque innovador puede ser utilizado directamente en crudo material biológico, y consiste en una combinación de técnicas existentes: información sobre los tiempos de retención (ECL) y los espectros de masas de los diferentes derivados de Fas (FAME, DMOX y picolinilo-éster). Usamos la siguiente nomenclatura FA. i, a, y n indican iso, anteiso metilo ramificado, y el ácido graso de cadena lineal, respectivamente. FAs insaturados fueron nombrados por C: d donde C es el número de átomos de carbono en el ácido graso y d es el número de dobles enlaces. Δ x indica la posición del doble enlace, donde se encuentra el doble enlace en el enlace carbono-carbono de orden x, contando desde el extremo ácido carboxílico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>QP2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capillary column ZB WAX</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>7HG-G007-11</td>
			<td>30m x 0.25mm x 0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Lichrosolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.06018.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THF</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>28559.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>23373.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>24575.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pyridinemethanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>P6-680-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium tertiobutoxide</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>156671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-amino-2-methyl-1-propanol</td>
			<td></td>
			<td>A-9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47080-U Supelco</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of fatty acids in bacillus cereus

Las especies de Bacillus contienen ácidos grasos insaturados (FAS) de cadena y ramificados con diversas posiciones de la rama de metilo (iso o anteiso) y del doble enlace. Los cambios en la composición de la FA juegan un papel crucial en la adaptación de las bacterias a su entorno. Estas modificaciones implican un cambio en la relación de iso frente anteiso ramificada AF, y en la proporción de insaturados AF en relación con las AF saturado, con dobles enlaces creados en posiciones específicas. Identificación precisa del perfil de AG es necesario entender los mecanismos de adaptación de la especie Bacillus. Muchos de los conjuntos combustibles de Bacillus no están disponibles comercialmente. La estrategia propuesta en el presente documento identifica conjuntos combustibles mediante la combinación de la información sobre el tiempo de retención (mediante el cálculo de la longitud de cadena equivalente (ECL)) con los espectros de masas de los tres tipos de derivados FA: ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), 4,4-dimetil oxazolina derivados (DMOX), yéster 3-pyridylcarbinyl (picolinilo). Este método puede identificar los conjuntos combustibles sin la necesidad de purificar el desconocido AF. La comparación de los perfiles cromatográficos de FAME preparado a partir de Bacillus cereus con una mezcla comercial de estándares permite la identificación de cadena lineal saturado Fas, el cálculo de la ECL, y las hipótesis sobre la identidad de la otra AF. FAMEs de ramificado, saturado Fas, iso o anteiso, muestre un cambio negativo constante en la ECL, en comparación con AF saturados lineales con el mismo número de carbonos. FAMEs de FAs insaturados pueden ser detectados por la masa de sus iones moleculares, y dan como resultado un cambio positivo en la ECL en comparación con los conjuntos combustibles saturados correspondientes. La posición de ramificación de conjuntos combustibles y la posición doble enlace insaturado de conjuntos combustibles pueden ser identificados por los espectros de masas de ionización de electrones de derivados picolinilo y DMOX, respectivamente. Este enfoque identifica toda la rama saturado desconocidaed AF, insaturados de cadena lineal AF y AF ramificados insaturados del extracto de B. cereus.

La estrategia de identificación FA a partir de células bacterianas se presenta en la Figura 1. Cada paso proporciona información espectral complementaria o información acerca de la retención cromatográfica. Paso 1 consiste en la identificación preliminar FA utilizando una solución estándar. Paso 2 permite la interpretación de FAME EI espectros y su ECL, con el fin de identificar provisionalmente los productos. Paso 3 identifica la ubicación exacta de ramificación de cadena ramificada-AF. Por último, paso 4 identifica la posición precisa de dobles enlaces en conjuntos combustibles insaturado. FAME y ECL La mezcla BAME nos permitió identificar una serie de ácidos grasos saturados de cadena lineal (n12 a n17) y algunos metílicos de ácidos grasos (i15, A15, i16, i17) ramificado. Sin embargo, se detectaron muy pocos específica AF a B. cereus en nuestra muestra, lo que justifica el desarropo del método de identificación descrito a continuación. AF independientemente de la longitud de la cadena, ramificados saturados (iso o anteiso) de una serie homóloga (es decir, una serie de compuestos con la misma fórmula general) muestran un cambio constante en ECL en comparación con el FA saturada lineal que tiene el mismo número de carbono en su -cadena de carbono. Este cambio, llamada longitud de la cadena fraccional (FCL), permite la identificación de conjuntos combustibles en una serie homóloga. Por ejemplo, iso-AF (indicada con el prefijo &quot;i&quot;) tienen un valor de -0.48 FCL, mientras anteiso FAS (marcados con el prefijo &quot;a&quot;) tienen un FCL de -0,33. Es entonces fácil para identificar un i14 y i13 con un ECL de 13,52 y 12,52, respectivamente, y un a13 y a15 con un ECL de 12,67 y 14,66, respectivamente. Tabla 1 muestra los ECLS para cada uno de los conjuntos combustibles detectan en la muestra. Los tiempos de retención predicened para iso y anteiso serie, junto con MS espectros obtenidos con FAME, nos permitió identificar la totalidad de la cadena ramificada-FA de nuestra muestra. Dicha identificación en este paso era provisional, pero más tarde se confirmó por los espectros de la IE obtenido a partir de derivados FAs picolinilo. FAMEs con LCE no correspondientes a la iso o anteiso cambios son insaturados, de cadena lineal o ramificada Fas, tal como se indica por la masa de su ion molecular. FAs insaturados muestran un cambio positivo en ECL en comparación con el correspondiente FA saturada. Spectra de derivados DMOX, combinados con los espectros de derivado picolinilo las AF ramificado, permite la identificación de la posición de doble enlace. Tales métodos de derivatización son apropiados para la identificación del Rey Sólo cuando el orden de elución se mantiene, como se muestra para las tres mezclas de derivados (es decir, la fama, y DMOX picolinilo) en la figura2 para varios 16: 1 AF. Este enfoque permite la recogida de información espectral complementaria de un pico de 3 formas distintas de derivación que pueden combinarse para identificar la estructura de la FA. No se observaron diferencias en orden de elución entre los derivados de 3, aunque los tiempos de retención y las temperaturas del horno eran diferentes. ésteres de picolinilo iso y anteiso de metilo de ácidos grasos saturados de cadena ramificada Los espectros obtenidos por EI confirmar la presencia de conjuntos combustibles de cadena ramificada metilo. En efecto, los iones moleculares tienen la m / z correspondiente a FAS saturadas. Se observó una serie de iones con una diferencia de 14 unidades de masa (UMA) que corresponden a una pérdida de un grupo metileno, excepto en la región del punto de ramificación en el que el ion correspondiente al átomo de carbono sustituido falta. a continuación, se observa una diferencia de 28 amu entre los dos iones correspondientes a fragmentos creado antes ydespués de que el carbono ramificada. La Figura 3 muestra el espectro de i16 con los iones de diagnóstico (304 y 332) que muestra la ubicación de ramificación. DMOX de ácidos grasos insaturados de cadena lineal La figura 2 presenta cinco picos diferentes asociados con el 16: 1 de ácido graso. Los dos primeros picos tienen valores &lt;16 ECL. Llegamos a la conclusión de que su estructura es, sin duda ramificado. La identificación de estos compuestos requiere la interpretación de espectros de masas obtenidos con DMOX y derivados de éster picolinilo. Tres picos que poseen ECL&gt; 16 partido monoinsaturados ácidos grasos de cadena lineal. DMOX espectros de masas de derivados muestran iones de diagnóstico que identifican la posición del doble enlace de estos compuestos. En la Figura 4 se puede ver una diferencia de 12 amu ion entre 196 y 208 que indica la presencia del doble enlace con el carbono 8 de la n16: 1 Δ <suácido p&gt; 8 graso, de acuerdo con la regla empírica para la localización de un doble enlace en la cadena grasa tal como se define por Zhang 18. Cuando la ubicación de doble enlace está delante de carbono 7, los iones de diagnóstico difieren. Por ejemplo, Zhang 18 y Fay 17 observaron que para una FA con un doble enlace insaturado en el carbono 5, el ion hija derivada de la escisión en el enlace doble, m / z 152, se acompaña de un intenso hija con numeración impar en m / z 153. En la Figura 5, la presencia de la intensa fragmento m / z 153 y del ion molecular m / z 307, identifica este compuesto como n16: 1 Δ 5. DMOX y masa picolinilo espectros de metilo de cadena ramificada monounsatured ácidos grasos La Figura 6 presenta los espectros de DMOX y derivados de éster picolinilo, usados para determinar la estructura de i16: 1 Δ 9 FA. La posición de lade ramificación se indica por una diferencia de 28 amu para ambos derivados. A diferencia de 12 amu por DMOX y 26 para el éster picolinilo identifica la posición doble enlace, como se muestra en la Figura 6. La identificación de los ácidos grasos y iones de diagnóstico La Tabla 1 muestra los diversos ácidos grasos identificados, con los iones de diagnóstico correspondientes, de Bacillus cereus ATCC 14579 cultivadas a 30 ° C. Estos iones de diagnóstico identificar las posiciones de la ramificación de metilo y dobles enlaces en la cadena de carbono para los derivados de éster y DMOX picolinilo, que proporcionan información estructural complementario. Los dos enfoques son realmente complementarios, como iones de diagnóstico son a veces más fáciles de observar con derivados DMOX, y en otros momentos más fácil de observar con derivados de picolinilo. <img alt="Figura 1"<html> src = &quot;/ files / ftp_upload / 54960 / 54960fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1: Estrategia para la identificación de ácidos grasos en Bacillus cereus. Se muestran los pasos sucesivos que generan información sobre los tiempos de retención (ECL), en el espectro de masas de la fama, de DMOX, y de picolinilo-éster. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig2.jpg" /> Figura 2: Comparación de los perfiles cromatográficos para diferentes 16: ácidos grasos 1 detectados en Bacillus cereus. (A) Los derivados de FAME (ion molecular extraído a m / z 268); (B) derivados DMOX (ion molecular extraído a m / z 307); Derivados de picolinilo (C) (ion molecular extraído a m / z 345).iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig3.jpg" /> Figura 3: picolinilo i16 espectro de masas derivado generado por ionización de electrones. Los iones a m / z 151 y m / z 164 indican la presencia de un derivado de ácido graso picolinilo. El ion molecular a m / z 347 se identifica como un isómero de ácido palmítico. La presencia de un espacio de 28 amu entre el ion a m / z 304 y m / z 332 es indicativo de i16. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig4.jpg" /> Figura 4: n16: 1 Δ 8 DMOX espectro de masas derivado generada por electronesionización. El ión a m / z 126 indica un derivado DMOX, m / z 307 es el ion molecular de 16: 1 DMOX y la presencia de una diferencia de 12 amu entre los iones en m / z 196 y m / z 208 identifica la ubicación del doble enlace en el carbono 8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig5.jpg" /> Figura 5: n16: 1 Δ 5 DMOX espectro de masas derivado generado por ionización de electrones. Ion a m / z 126 es indicativo de un derivado de DMOX y m / z 307 es el ion molecular de 16: 1 DMOX. La intensa m / z 153 ion es característica de un doble enlace situado en el carbono 5. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 6: DMOX (arriba) y picolinilo (abajo) la comparación de i16: 1Δ 9 espectros. En ambos casos la diferencia de 28 amu indican la posición de la ramificación de metilo. La ubicación doble enlace se puede derivar por un espacio de 12 amu y 26 amu para los derivados DMOX y picolinilo, respectivamente. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> compuestos putativos </td><td> ion molecular (m / z) FAME; DMOX; picolinilo </td><td> RT </td><td> ECL </td><td> identificación confirmada </td><td> iones de diagnóstico DMOX </td><td> iones de diagnóstico picolinilo </td></tr><tr><td> i12 </td><td> 214; 253; 291 </td><td>7.93 </td><td> ninguna referencia </td><td> i12 </td><td></td><td> [276 (15); 262 (0); 248 (15)] mb </td></tr><tr><td> n12 </td><td> 214; 253; 291 </td><td> 8.21 </td><td> 12.00 </td><td> n12 </td><td></td><td> [276 (10); 262 (20); 248 (20)] mb </td></tr><tr><td> i13 </td><td> 228; 267; 305 </td><td> 8.53 </td><td> 12.5 </td><td> i13 </td><td></td><td> [290 (15); 276 (0); 262 (48)] mb </td></tr><tr><td> a13 </td><td> 228; 267; 305 </td><td> 8.64 </td><td> 12.67 </td><td> a13 </td><td></td><td> [276 (48); 262 (0); 248 (65)] mb </td></tr><tr><td> i14 </td><td> 242; 281; 319 </td><td> 9.24 </td><td> 13.52 </td><td> i14 </td><td></td><td> [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb </td></tr><tr><td> n14 </td><td> 242; 281; 319 </td><td> 9.60 </td><td> 14.00 </td><td> n14 </td><td></td><td> [304 (7); 290 (17); 276 (17)] mb </td></tr><tr><td> i15 </td><td> 256; 295; 333 </td><td> 10.06 </td><td> 14.51 </td><td> i15 </td><td></td><td> [318 (20); 314 (0); 290 (50)] mb </td></tr><tr><td> a15 </td><td> 256; 295; 333 </td><td> 10.19 </td><td> 14.66 </td><td> a15 </td><td></td><td> [304 (30); 290 (tr); 276 (62)] mb </td></tr><tr><td> n15 </td><td> 256; 295; 333 </td><td> 10.49 </td><td> 15.00 </td><td> n15 </td><td></td><td> [318 (5); 304 (13); 290 (18)] mb </td></tr><tr><td> i16 </td><td> 270; 309; 347 </td><td> 11.04 </td><td> 15.5 </td><td> i16 </td><td></td><td> [332 (18); 318 (tr); 304 (42)] mb </td></tr><tr><td> metilo ramificado 16: 1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 11.19 </td><td> 15.64 </td><td> i16: 5 1Δ </td><td> [152 (2); 153 (10)] db [292 (3); 278 (tr); 264 (2)] mb </td><td></td></tr><tr><td> metilo ramificado 16: 1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td>11.40 </td><td> 15.83 </td><td> i16: 1 Δ 9 </td><td> [210 (3); 222 (3)] db [292 (12); 278 (tr); 264 (40)] mb </td><td></td></tr><tr><td> n16 </td><td> 270; 309; 347 </td><td> 11.59 </td><td> 16.00 </td><td> n16 </td><td></td><td> [332 (5); 318 (15); 304 (15)] mb </td></tr><tr><td> 16: 1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 11.78 </td><td> 16.14 </td><td> n16: 1 Δ 5 </td><td> [152 (2); 153 (10)] db </td><td></td></tr><tr><td> 16: 1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 11.94 </td><td> 16.24 </td><td> n16: 1 Δ 8 </td><td> [196 (5); 208 (3)] db </td><td></td></tr><tr><td> 16: 1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 12.00 </td><td> 16.31 </td><td> n16: 9 1Δ </td><td> [210 (3); 222 (3)] Db </td><td></td></tr><tr><td> 16: 2 </td><td> 266; 305; 343 </td><td> 12.18 </td><td> 16.44 </td><td> n16: 2 Δ 5, Δ 9 </td><td> [152 (2); 153 (12)] db [208 (1); 220 (2)] db </td><td></td></tr><tr><td> i17 </td><td> 284; 323; 361 </td><td> 12.25 </td><td> 16.5 </td><td> i17 </td><td></td><td> [346 (20); 332 (tr); 318 (35)] mb </td></tr><tr><td> metilo ramificado 17: 1 </td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.43 </td><td> 16.64 </td><td> i17: 5 1Δ </td><td> [152 (2); 153 (10)] db </td><td> [344 (10); 316 (5)] mb </td></tr><tr><td> a17 </td><td> 284; 323; 361 </td><td> 12.47 </td><td> 16.66 </td><td> a17 </td><td></td><td> [332 (30); 318 (0); 304 (52)] mb</td></tr><tr><td> metilo ramificado 17: 1 </td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.57 </td><td> 16.74 </td><td> i17: 8 1Δ </td><td> [196 (2); 208 (2)] db </td><td> [344 (10); 316 (5)] mb </td></tr><tr><td> metilo ramificado 17: 1 </td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.64 </td><td> 16.79 </td><td> i17: 9 1Δ </td><td> [210 (3); 222 (3)] db </td><td></td></tr><tr><td> metilo ramificado 17: 1 </td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.70 </td><td> 16.84 </td><td> i17: 10 1Δ </td><td> [224 (1); 236 (1)] db </td><td></td></tr><tr><td> metilo ramificado 17: 1 </td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.84 </td><td> 16.94 </td><td> A17: 9 1Δ </td><td> [210 (3); 222 (4)] db </td><td> [330 (10); 316 (0); (90)] mb </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Identificación de los ácidos grasos a partir de Bacillus cereus ATCC 14579. Los tiempos de retención, los valores equivalentes longitud de la cadena (ECL), e iones moleculares de los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) se muestran, junto con los iones moleculares e iones de diagnóstico para DMOX y derivados picolinilo. [] Mb par de iones de diagnóstico que indica una pérdida de 28 amu correspondiente al fragmento de antes y después de la ramificación de carbono. [] Db par de iones de diagnóstico que indica una pérdida de 12 amu correspondiente a la escisión de un doble enlace.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus at JoVE.com

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).

Identificación de los ácidos grasos en la<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

identification-of-fatty-acids-in-bacillus-cereus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

9.5K vistas.  INRA, Université d'Avignon. We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl). 

Video: Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Un sensor basado en polianilina de ácidos nucleicos

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Investigación

Bioquímica

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis is an obligate pathogen that causes fatal inhalational anthrax. Bacillus cereus is considered a useful model for studying B. anthracis due to its close evolutionary relationship. The gene cluster ba1554 - ba1558 of B. anthracis is highly conserved with the bc1531- bc1535 cluster in B. cereus, as well as with the bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, indicating the critical role of the associated genes in the Bacillus genus. This manuscript describes methods to prepare and characterize a protein product of the first gene (ba1554) from the gene cluster in B. anthracis using a recombinant protein of its ortholog in B. cereus, bc1531.

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis is the obligate pathogen of fatal inhalational anthrax, so studies of its genes and proteins are strictly regulated. An alternative approach is to study orthologous genes. We describe biophysicochemical studies of a B. anthracis ortholog in B. cereus, bc1531, requiring minimal experimental equipment and lacking serious safety concerns.

Expresión de Proteínas Recombinantes, Cristalización y Estudios Biofísicos de un<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservado Nucleótido Pirofosforilasa, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer tissue with minor or no modification, allowing the dietary routing between different trophic levels. However, the FA trophic marker approach is still hampered by the limited knowledge in lipid metabolism of the soil fauna. This study used entirely labelled palmitic acid (13C16:0, 99 atom%) as a tracer in fatty acid metabolism pathways of two widespread soil Collembola, Protaphorura fimata and Heteromurus nitidus. In order to investigate the fate and metabolic modifications of this precursor, a method of isotopologue profiling is presented, performed by mass spectrometry using single ion monitoring. Moreover, the upstream laboratory feeding experiment is described, as well as the extraction and methylation of dominant lipid fractions (neutral lipids, phospholipids) and the related formula and calculations. Isotopologue profiling does not only yield the overall 13C enrichment in fatty acids derived from the 13C labeled precursor but also produces the pattern of isotopologues exceeding the mass of the parent ion (i.e., the FA molecular ion M+) of each labeled FA by one or more mass units (M+1, M+2, M+3, etc.). This knowledge allows conclusions on the ratio of dietary routing of an entirely consumed FA in comparison to de novo biosynthesis. The isotopologue profiling is suggested as a useful tool for evaluation of fatty acid metabolism in soil animals to disentangle trophic interactions.

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

The fatty acid trophic marker approach, i.e., the assimilation of fatty acids as entire molecule and transfer into consumer tissue with no or minor modification, is hampered by knowledge gaps in fatty acid metabolism of small soil invertebrates. Isotopologue profiling is provided as a valuable tool to disentangle trophic interactions.

Perfiles de ácidos grasos 13C Isotopologue proporciona una idea de la transferencia trófica de carbono y metabolismo de los lípidos de los consumidores invertebrados

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

Identificación de regiones de la proteína funcional a través de la construcción de la proteína quimérica

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled antibodies. It is a multistep process in which the optimization of each step is crucial to obtain the optimum specific signal. Through IHC, the distribution and localization of specific biomarkers can be detected, revealing information on evolutionary conservation. Moreover, IHC allows for the understanding of expression and distribution changes of biomarkers in pathological conditions, such as obesity. IHC, mainly the immunofluorescence technique, can be used in adult zebrafish to detect the organization and distribution of phylogenetically conserved molecules, but a standard IHC protocol is not estasblished. Orexin and endocannabinoid are two highly conserved systems involved in the control of food intake and obesity pathology. Reported here are protocols used to obtain information about orexin peptide (OXA), orexin receptor (OX-2R), and cannabinoid receptor (CB1R) localization and distribution in the gut and brain of normal and diet-induced obese (DIO) adult zebrafish models. Also described are methods for immunoperoxidase and double immunofluorescence, as well as preparation of reagents, fixation, paraffin-embedding, and cryoprotection of zebrafish tissue and preparation for an endogenous activity-blocking step and background counterstaining. The complete set of parameters is obtained from previous IHC experiments, through which we have shown how immunofluorescence can help with the understanding of OXs, OX-2R, and CB1R distribution, localization, and conservation of expression in adult zebrafish tissues. The resulting images with highly specific signal intensity led to the confirmation that zebrafish are suitable animal models for immunohistochemical studies of distribution, localization, and evolutionary conservation of specific biomarkers in physiological and pathological conditions. The protocols presented here are recommended for IHC experiments in adult zebrafish.

Presented here are protocols for immunohistochemical characterization and localization of orexin peptide, orexin receptors, and endocannabinoid receptors in the gut and brains of normal and diet-induced obesity (DIO) adult zebrafish models using immunoperixidase and double immunofluorescence methods.

Identificación de receptores de orexina y endocannabinoides en peces cebra adultos mediante métodos de inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

Entidades de unión SUMO (SUBE) como herramientas para el enriquecimiento, aislamiento, identificación y caracterización del proteome SUMO en cáncer de hígado

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Identificación de los ácidos grasos en la

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video