המחברים מודים תומאס מיסון לתמיכה הטכנית שלו, וכדי רחל קופק עבור תיקון כתב היד.

1. תרבויות חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן דשא של החיידקים (ATCC Bacillus cereus זן 14,579) על ידי הפצת 100 μl של תרבות לילה של המתח וטופח על 30 מעלות צלזיוס LB (בינוני לוריא- Bertani), על פני השטח של צלחת של מדיום אגר LB. דגירה את צלחת הלילה ב C 30 °. </li></ol> 2. ECL: אורך שרשרת Equivalent <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ECL כדלקמן: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/54960/54960eq1.jpg" /> עם: אני, מומס עניין; n, מספר הפחמן של מתיל אסטר חומצת שומן רוויות ישר שרשרת משחררים לפני מומס לי; n + 1, מספר הפחמן של מתיל אסטר חומצות שומן רווי שרשרת ישר משחררים לאחר המומס לי; RTI, RTN, RT (n + 1) פעמים השמירה של פסגות FAME שתוארו לעיל. הערה: קבל את זמני השמירה של אסטרים מתיל חומצות שומן רווי ישר שרשרת בזריקה מתערובת של סטנדרטים (BAME). </li></ol> הכנת FAME 3. וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לקבל חומצות שומן שומנים, תאים חיידקיים הקציר על ידי גירוד מושבות מהצלחת אגר ולהעביר 40 מ&quot;ג (משקל טרי, שווה ערך ל -10 9 תאים קיימא) של חיידקים לתוך צינור זכוכית 10 מ&quot;ל עם פקקי הברגה וחותמות PTFE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע transesterification הניתן בשיטת קישור אסתר 14,15 כמפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של 0.2 M KOH מתנול אל תאים חיידקיים טרי לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. תגובה זו מורכבת methanolysis אלקליין, לשבור את הקישור אסתר ב השומנים והפקת אסטרים מתיל חומצות שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 1 חומצה אצטית M כדי להוריד את ה- pH ל -7.0. בדוק את ה- pH עם רצועות מבחן ה- pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של הקסאן לחלץ fames. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant (שלב אורגני) לתוך צינורות נקיים להתרכז על ידי אידוי בטמפרטורת חדר תחת זרימה רציפה של חנקן לקבל כ 200 μlשל תמצית. מעבירים את המדגם לתוך בקבוקון GC עם הכנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק תמציות לתוך ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסת גז מערכת (GC-MS). </li></ol></li></ol> 4. GC / MS תנאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק דגימות FAME לתוך מכשיר GC-MS מצויד נימי טור ZB-WAX (אורך, 30 מ &#39;; קוטר, 0.25 מ&quot;מ, עובי הסרט, 0.25 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פיית ההזרקה (במצב splitless) הטמפרטורה ל 250 מעלות צלזיוס. השתמש הליום כגז מוביל, עם מהירות הקווית של 37 סנטימטר / sec. החזק את טמפרטורת התנור ב -50 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, להגביר עד 190 ° C בשיעור של 20 ° C / min, ולהגדיל עוד יותר לטמפרטורה סופית של 230 מעלות צלזיוס בשיעור של 2 ° C / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור MS, להקליט את ספקטרה ההמונית על ידי יינון אלקטרון (EI) בשעת 70 eV, ולהגדיר את הרכישה הנוכחית היון הכולל בין 50 ל 400 יחידות מסה אטומיות (האמו) (2 סריקות / sec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר נדרש, להזריק נגזרים DMOX ו picolinyl באותם excep מצבt בתנור בטמפרטורה תוכנית כדלקמן: DMOX: 50 ° C (1 דקות), 20 ° C / min עד 210 ° C ו -2 ° C / min עד 240 ° C (5 דק &#39;); Picolinyl: 6 ° C (1 דקות), 20 ° C / min עד 220 ° C ו -2 ° C / min עד 250 ° C (20 דק &#39;). </li></ol> 5. Picolinyl אסתר הכינה מ FAME 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדות את תמצית FAME מסעיף 3 עם זרימת חנקן (לפחות חומר יבש 10 מ&quot;ג) ו להתמוסס 1 מ&quot;ל של dichloromethane יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון 1.0 M של אשלגן ter T-butoxide ב tetrahydrofuran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תמצית תהילה 0.2 מ&quot;ל 3-pyridinemethanol 0.1 מ&quot;ל של תמיסת עשה צעד 5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את הפתרון ב 40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתוך בקבוקון סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להוסיף מים ללא יונים מטוהרים (2 מ&quot;ל, ראה לוח חומרים) ו הקסאן (4 מ&quot;ל). מערבבים עם מערבולת, לאפשר בשלב להיפרד, לאסוף את השלב האורגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ד&quot;רy אותו על ידי הוספת נתרן גופרתי נטול מים עד השלב האורגני ברור לחלוטין. העבר אותו לתוך צינור נקי. ונמוג 200 μl. מעבירים את המדגם לתוך בקבוקון GC עם הכנס. </li></ol> 6. הכנת DMOX מ FAME 17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדות את תמצית FAME מסעיף 3 עם זרימת חנקן (לפחות חומר יבש 10 מ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ FAME יבש, להוסיף 250 מ&quot;ג של 2-אמינו-2-מתיל-1-פרופנול. שטוף את הכלי עם חנקן, להוסיף פקק, ולמקם אותו בתוך גוש חימום לילה ב 190 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להוסיף 3 מ&quot;ל dichloromethane אל הצינור, ו -5 מ&quot;ל מטוהרים מים ללא יונים (ראה לוח חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake עבור הפרדת פאזות ולאחר מכן להסיר את השלב מהימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השלב האורגני במים מ&quot;ל 5. Shake עבור הפרדת פאזות ולאחר מכן להסיר את השלב מהימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי על ידי הוספת נתרן גופרתי נטול מים עד השלב האורגני הוא צלול לגמרילהעביר אותו לתוך צינור נקי. להתאדות תחת זרם של חנקן עד שמגיעים בהיקף של 200 μl. מעבירים את המדגם לתוך בקבוקון GC עם הכנס. </li></ol>

<ol>
	<li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipid Analysis 4th Edition. , (2010).</li><li>H&#220;bschmann, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , (2015).</li><li>Sasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Bacteria+by+Gas+Chromatography+of+Cellular+Fatty+Acids.">Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids.</a> MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).</li><li>Spitzer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+analysis+of+fatty+acids+by+gas+chromatography+-+Low+resolution+electron+impact+mass+spectrometry+of+their+4,4-dimethyloxazoline+derivatives+-+A+review.">Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review.</a> Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).</li><li>Harvey, D. J., Christie, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in lipid methodology. Volume 1. , 19-80 (1992).</li><li>Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebreti&#232;re, M. -. H., Broussolle, V., Brillard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+fatty+acids+in+Bacillus+environmental+adaptation.">Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation.</a> Front Microbiol. 6, (2015).</li><li>Brillard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Bacillus+cereus+Genes+Specifically+Expressed+during+Growth+at+Low+Temperatures.">Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).</li><li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Anaerobiosis+and+Low+Temperature+on+Bacillus+cereus+Growth,+Metabolism,+and+Membrane+Properties.">Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).</li><li>Diomand&#233;, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+CasK/R+two-component+system+in+optimal+unsaturation+of+the+Bacillus+cereus+fatty+acids+during+low-temperature+growth.">Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth.</a> Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).</li><li>Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P., Berkeley, R. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. , 1-7 (2002).</li><li>K&#228;mpfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+and+Possibilities+of+Total+Fatty+Acid+Analysis+for+Classification+and+Identification+of+Bacillus+Species.">Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species.</a> System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).</li><li>Kaneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty-acids+of+genus+bacillus+-+example+of+branched-chain+preference.">Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference.</a> Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).</li><li>Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+Biosynthesis+of+Unsaturated+Fatty+Acids+in+Bacillus+cereus+ATCC+14579+and+Functional+Characterization+of+Novel+Acyl-Lipid+Desaturases.">Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).</li><li>Sasser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Bacillus+anthracis+from+culture+using+gas+chromatographic+analysis+of+fatty+acid+methyl+esters.">Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters.</a> J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).</li><li>Schutter, M. E., Dick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fatty+acid+methyl+ester+(FAME)+methods+for+characterizing+microbial+communities.">Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities.</a> Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).</li><li>Destaillats, F., Angers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+methodology+for+the+synthesis+of+FA+picolinyl+esters+from+intact+lipids.">One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids.</a> J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).</li><li>Fay, L., Richli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+double-bonds+in+polyunsaturated+fatty-acids+by+gas-chromatography+mass-spectrometry+after+4,4-dimethyloxazoline+derivatization.">Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization.</a> J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).</li><li>Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+in+mass+spectrometry+IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines+as+derivatives+for+the+double+bond+location+of+long-chain+olefinic+acids.">Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids.</a> Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).</li><li>de Sarrau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unsaturated+fatty+acids+from+food+and+in+the+growth+medium+improve+growth+of+Bacillus+cereus+under+cold+and+anaerobic+conditions.">Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).</li><li>Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic+characterization+of+fatty+acids.Identification+constants+for+mono-+and+dicarboxylic+methyl+esters.">Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters.</a> Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).</li><li>van Den Dool, H., Kratz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generalization+of+the+retention+index+system+including+linear+temperature+programmed+gas-liquid+partition+chromatography.">A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography.</a> J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).</li><li>Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+equivalent+chain+length+values+of+monoenic+and+polyenic+(methylene+interrupted)+fatty+acids.">Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids.</a> J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

פרופילי הכרומתוגרמה FAS שניתן לראות בטבלת 1 מתאים B. cereus ATCC 14,579 גדל על פני צלחת אגרה. פרופילים דומים התקבלו כאשר החיידק היה גדל בתקשורת נוזלת סודה באותה הטמפרטורה 8. במקרה של חיידקים גדלו בתקשורת נוזלית, ביומסה החיידקים נאספה על ידי צנטריפוגה של מדיום הצמיחה ניתן לכבס על פי פרוטוקולים שתוארו קודם לכן תלויים 8,19 תנאי גידול. זיהוי של FAS השונה המיוצר על ידי B. cereus מותר שינויים בסדר בשיעור של FAS להתגלות זני מוטציה על כמה גנים הכרחיים לצמיחה ב 7,9 בטמפרטורה נמוכה. בדרך כלל, ECL מחושב לפי ערכי יומן של זמן השמירה המתואם נקבע בטמפרטורה קבועה (באמצעות תנור עם בקרת טמפרטורה בידוד תרמי) 20. כאן, בגלל השימוש בתנור הלא isothermal כדי p<html> ermit הפרדה אופטימיזציה של FAME של עניין, שיטת החישוב היה כי שתואר לעיל עבור מדדי השמירה ליניארי 3,21. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לא להשוות את הערכים ECL מחושב עם אלה המתוארים בספרות, אבל לחזות את מבנה ה- FA, בתוך אותו פרופיל הכרומתוגרמה, המבוסס על נתוני שימור אלו ומידע ספקטרה. ואכן, עבור FAS רווי, נתון הסתעפות (iso או anteiso) תמיד גורם באותה המשמרת ב ECL, לעומת FA-השרשרת הישרה המקבילה. בנוסף, ECL מחושב במחקר הנוכחי המתאים עם ערכים שנמדדו על ידי סטראנסקי 22 על טור של קוטביות מקבילה. הסכמה זו עם ערכים שדווחו בעבר עולה כי ערכי ECL הם ובכך מאוד שימושיים עבור זיהוי מהיר של פסגות מפרופילי הכרומתוגרמה FAS של cereus ב גדלו בתנאים אחרים, או של זנים אחרים (למשל., מוטציות) של cereus ב. <html> class = &quot;jove_content&quot;&gt; נגזר Picolinyl זמנים מוצג שמירה עוד אבל יחס אות / רעש נמוך לעומת הנגזרים האחרים שנבדקו. דיווחים קודמים מראים כי elution שלהם קשה יותר 4. סביר להניח כי שימוש טור עם עובי סרט נמוך, והעובדה כי מיני Bacillus מכיל FAS עם פחות מ 18 פחמנים, מאפשר להשתמש באותו טור chromatographic הקוטב ליצור chromatograms האיכותי GC-MS של 3 נגזרים. נגזר Picolinyl לספק יונים מאפיינים יותר מעידים על מיקום ההסתעפות מאשר יונים שנוצרו על ידי נגזרי DMOX, ואילו מעמדו של הקשר הכפול מוקצה יותר בקלות עם נגזרי DMOX. המחקר הנוכחי מראה את התועלת של שילוב מידע ממכשירים נגזרים הוא לזהות את שרשרת קנים מתיל רוויים FAS מ cereus ב &#39;, שעד כה תוארו גרוע בספרות. jove_content &quot;&gt; ניתן להשלים הגישה המוצעת בתוך 2 ימים. לשם השוואה, עבור ספקטרוסקופיה NMR, כל FA צריך להיטהר, המייצג כמה שבועות של עבודה וכמות גדולה של חומר ביולוגי. עם זאת, הגישה אינה מבחינת הגיאומטריה ( ציס, טרנס) לתחום כפול. לאחר כל FA מזוהה, הם ניתן לכמת באופן שגרתי על ידי נגזרי תהילתם, למשל, להשוות זני חיידקים מוטנטים או ללמוד את ההשפעה של תנאי הגידול. בידיים שלנו, קטנה כמו 8 מ&quot;ג של תאי חיידקיים טריים היו מספיק עבור כימות של FAS, מה שהופך את השיטה החלימה קשה לגדול חיידקים. מגבלת כימות עבור כל האחד FAS זיהה היא 1 ng / μl של פתרון מוזרק GC / MS.

שומן מתיל אסטר חומצה (FAME) גז כרומטוגרפיה (GC) היא שיטה חיונית לאפיון שומנים. הוא מפריד במהירות מכמת את חומצות שומן שונות (FAS) של מדגם אחרי צעד מיצוי קצר. נגזרים של אסטרים מתיל תנודתיות מאוד, יציבה אינרטי לעבר מוט chromatographic, ובכך למנוע פסגות עוקב. סולם ההזדהות שלהם היא די פשוט כאשר המדגם מורכב FAS הידוע משום פרופילי chromatographic או מתפרסמים או בהשוואה לסטנדרטים. בנוסף, ההזרקה החוזרת של סטנדרטי כיול כימות של שונות FAS אינה נדרשת, בהתחשב בתגובה המתמדת שלהם כמעט לגילוי יינון להבה (FID) 1. בנוסף FID, ספקטרומטריית מסה (MS) זיהוי מספק ערכה משלימה של מידע כדי לאשר fames. עם זאת, כאשר fames נזקפת באמצעות יינון אלקטרון (EI), ספקטרה וכתוצאה מכך לא תמיד מאפשרת הזיהוי דואר של המבנה העדין האנגלי. למשל, הסתעפות עמדה (כלומר, קבוצה מהתיל מסועפת) קשה לנבא כי יוני האבחון קשים לזהות 1 ושינוי המאפיין בשפע יון היעד הוא מכונה תלוי, מניעת השימוש בספריות ספקטרה מונית 2. אתגר נוסף טמון בזיהוי מיקום הקשר הכפול בגלל EI גורם גירת קשר כפולה. לפיכך, איזומרים FA עם משתנה עמדות קשר כפולות לא יכולים להיות מובחנים על ידי ספקטרום המסה שלהם. למרבה המזל, בכלים אחרים פותחו לזיהוי FA. לדוגמה, הנוכחות ואת המיקום של הסתעפות או של קשרים כפולים FAS ניתן השערה על ידי חישוב אורך השרשרת שווה ערך (ECL) 3. שיטות derivatization אחרות לגרום ספקטרה מסה שונה, תלוי במיקום של קשר כפול או קבוצה מתיל מסועפת. 4,4-דימתיל נגזר oxazoline (DMOX) 4 לאפשר EASזיהוי y של המיקום של קשרים כפולים חומצת שומן חד בלתי רוויה. 3-pyridylcarbinyl אסתר (אסתר picolinyl) נגזרים לאפשר זיהוי חד משמעי על המיקום של מתיל מסועף 5 FAS. שילוב שמירת chromatographic (ECL) ו ספקטרה ההמונית (DMOX ו picolinyl) מידע מאפשר זיהוי של רוב FAS ללא הצורך להשתמש בשיטות מורכבות של טיהור, כנדרש עבור ספקטרום תהודה מגנטית גרעינית (NMR), שיטת העוררין לאפיון מבני 1 . חיידקים של Bacillus הסוג, הכוללים כמה פתוגנים בני אדם ובעלי חיים, מסוגלים ליישב נישות מגוונות מאוד ולכן מופצים באופן נרחב בסביבה 6. בין הסוג בצילוס, רכב FA מושפע הנישה האקולוגית של המין עם מודולציות בדפוסי FA להתאים למגוון רחב של שינויים סביבתיים (למשל, מדיום גידול, טמפרטורה,pH, וכו &#39;) 7-9. בגלל ההומוגניות היחסית של דפוס FA בין זנים של Bacillus הסוג במהלך צמיחה בתנאים סטנדרטיים, קביעת רכב FA היא אחד הקריטריונים החיוניים המשמשים להגדרת מין Bacillus. מאפיין ייחודי של הסוג בצילוס הוא השפע של FAS מסועפת שרשרת המכילה 12-17 פחמנים 10-12 עם היחס בין ISO ו anteiso איזומרים להיות קובע מפתח של הסתגלות לתנאי סביבה. מיני Bacillus גם להסתגל לתנודות סביבה על ידי שינוי היחס של חומצות שומן בלתי רוויות. במינים מסוימים, כגון cereus Bacillus, שני desaturases חומצת שומן ליצור קשרים כפולים במיקומים שונים של שרשרת אלקיל 13 עם תפקידים שונים בעיבוד 9. הדוגמא של הסוג בצילוס ממחישה את החשיבות של זיהוי בדיוק עמדת הקשר הכפולה ו FA הסתעפות. לאסוףively, זיהוי דפוסי Bacillus FA יש כמה יישומים שימושיים. בזאת, אנו מציעים גישת GC-MS רומן לזיהוי דפוס Bacillus FA אשר מתגבר על המגבלות המובנות של ניתוח קלסי GC-MS. גישה חדשנית זו יכולה לשמש באופן ישיר על חומר ביולוגי גלם, מורכבת משילוב של טכניקות קיימות: מידע על זמני שמירה (ECL) ו ספקטרה ההמונית של נגזרי FAS שונים (FAME, DMOX ו-אסתר picolinyl). אנו משתמשים במינוח האנגלי הבא. אני, א, ו n מצביע iso, anteiso מתיל מסועף, וישר-שרשרת חומצת שומן, בהתאמה. FAS הרווי קבל את שמן C: ד כאשר C הוא מספר אטומי הפחמן חומצת השומן ו- D הוא מספר קשרים כפולים. Δ x מציין את המיקום של הקשר הכפול, שבו הקשר הכפול ממוקם על קשר פחמן-פחמן העשירי, לספור מסוף חומצה קרבוקסילית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>QP2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capillary column ZB WAX</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>7HG-G007-11</td>
			<td>30m x 0.25mm x 0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Lichrosolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.06018.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium hydroxide</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THF</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>28559.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>23373.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Hipersolv Chromanorm</td>
			<td>24575.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pyridinemethanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>P6-680-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium tertiobutoxide</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>156671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-amino-2-methyl-1-propanol</td>
			<td></td>
			<td>A-9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Academic</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZMQS50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47080-U Supelco</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of fatty acids in bacillus cereus

מין Bacillus מכיל מסועף שרשרת חומצות שומן בלתי רוויות (FAS) עם עמדות מגוונות של הסניף מהתיל (iso או anteiso) ושל הקשר הכפול. שינויים בהרכב FA לשחק תפקיד מכריע ההסתגלות של חיידקים לסביבתם. שינויים אלה כרוכים בשינוי היחס של iso לעומת anteiso המסועף FAS, וב השיעור ביחס FAS בלתי רווי ל- FAS הרווי, עם קשרים כפולים נוצרו ב בתפקידים שונים. זיהוי מדויק של פרופיל FA יש צורך להבין את מנגנוני ההסתגלות של מיני Bacillus. רבים מן FAS מ Bacillus אינם זמינים מסחרית. האסטרטגיה המוצעת במסמך מזהה FAS באמצעות שילוב אינפורמציה על זמן השמירה (לפי חישוב של אורך השרשרת שווה ערך (ECL)) עם ספקטרה המונית של שלושה סוגים של נגזרים FA: אסטרים מתיל חומצת שומן (fames), 4,4-דימתיל oxazoline נגזרים (DMOX), ו3-pyridylcarbinyl אסתר (picolinyl). שיטה זו יכולה לזהות את FAS ללא הצורך לטהר את FAS הידוע. השוואת פרופילי chromatographic תהילה שהוכנה cereus Bacillus בתערובת מסחרית של תקנים מאפשרת זיהוי של ישר-שרשרת רווי FAS, החישוב של ECL, והשערות על זהותו של FAS האחר. Fames של הקנים רווי FAS, iso או anteiso, להציג תזוזה שלילית קבועה של ECL, לעומת FAS רווי ליניארי עם אותו מספר פחמנים. Fames של FAS בלתי רווי יכול להיות מזוהה על ידי המסה של היונים המולקולריים שלהם, ולגרום לשינוי חיובי ECL לעומת FAS הרווי המתאים. עמדת ההסתעפות של FAS ועמדת הקשר הכפולה של FAS בלתי רווי ניתן לזהות על ידי ספקטרה המונית יינון אלקטרונים נגזרים picolinyl ו DMOX, בהתאמה. גישה זו מזהה את כל הענף הרווי הידועFAS ed, FAS ישר שרשרת בלתי רוויה ו- FAS המסועף בלתי רווי מתמצית cereus ב.

האסטרטגיה של זיהוי FA מתאי חיידקים מוצג באיור 1. כל צעד מספק מידע ספקטרלי משלים או מידע אודות שימור chromatographic. שלב 1 מורכב של זיהוי ראשוני FA באמצעות פתרון סטנדרטי. שלב 2 מאפשר פרשנות FAME EI ספקטרה ECL שלהם, על מנת לזהות את המוצרים בהיסוס. שלב 3 מזהה את המיקום המדויק הסתעפות בשרשרת-FAS מסועף. לבסוף, בשלב 4 מזהה את המיקום המדויק של קשרים כפולים FAS בלתי רווי. תהילה ECL תערובת BAME אפשרה לנו לזהות שרשרת של חומצות שומן רוויות ישר-שרשרת (N12 ב N17) וכמה מתיל מסועף חומצת שומן (I15, A15, I16, I17). עם זאת, מעט מאוד ספציפיים FAS ל- B cereus אותרו במדגם שלנו, המצדיק את development של שיטת זיהוי המתואר להלן. לא משנה אורך שרשרת, מסועף FAS רווי (iso או anteiso) של סדרה הומולוגית (כלומר, סדרה של תרכובות עם אותה הנוסחא הכללית) להציג תזוזה מתמדת ECL לעומת FA הרווי ישר שיש המספר הזהה של פחמן שלהם פחמן-שרשרת. שינוי זה, אורך שרשרת שבר נקרא (FCL), מאפשר זיהוי של FAS בסדרה הומולוגית. למשל, ISO-פאס (מסומנים עם הקידומת &quot;i&quot;) יש ערך FCL של -0.48, בעוד FAS anteiso (מסומנים עם הקידומת &quot;a&quot;) יש FCL של -0.33. זהו אז קל לזהות i14 ו i13 עם ECL של 13.52 ו 12.52, בהתאמה, וכן a13 ו A15 עם ECL של 12.67 ו 14.66, בהתאמה. לוח 1 מציג את ECLs לכל אחת FAS זוהה במדגם שלנו. פעמי שמירה לחזותed עבור iso ו anteiso סדרה, יחד עם MS ספקטרה שהושג עם fames, אפשר לנו לזהות את כל השרשרת-FA המסועף מהמדגמת שלנו. זיהוי כזה בשלב הזה היה מהוסס, אך אישר מאוחר יותר על ידי ספקטרום EI המתקבל נגזרים FAS picolinyl. Fames עם ECLs לא מתאים iso או משמרות anteiso הם בלתי רוויים, ישר או מסועף שרשרת FAS, כפי שצוין על ידי המסה של היון המולקולרי שלהם. FAS רווי להראות שינוי חיובי ECL לעומת FA הרווי המתאים. ספקטרה ממכשירים נגזרים DMOX, בשילוב עם ספקטרום מ נגזרת picolinyl עבור FAS מסועף, לאפשר זיהוי של עמדת הקשר הכפול. שיטות derivatization כאלה מתאימות לזיהוי FA רק כאשר סדר elution נשמר, כפי שמוצג על שלוש התערובות הנגזרות (כלומר, FAME, DMOX ו picolinyl) באיור2 במשך כמה 16: 1 FAS. גישה זו מאפשרת איסוף מידע ספקטרלי משלימים של שיא אחד באמצעות 3 שיטות derivatization אשר ניתן לשלב לזהות מבנה FA. לא נמצאו הבדלים כדי elution נצפו בין 3 נגזרים, למרות פעמים השמירה וטמפרטורות בתנור היו שונים. אסטרים Picolinyl של ISO ו anteiso חומצת שומן רווי מסועפות שרשרת מתיל ספקטרה מתקבלת על ידי EI לאשר את קיומו של FAS מהתיל מסועף שרשרת. ואכן, היונים המולקולריים יש m / z המתאים FAS רווי. צפינו בסדרת יון עם פער של 14 יחידות מסה (האמו) מקבילות להפסד של קבוצה מתילן למעט באזור של נקודת הסניף שבו היון המתאים האטום פחמן להחליף חסר. לאחר מכן, אנו להתבונן פער של 28 האמו בין שני היונים המתאימים שברים נוצר לפנילאחר פחמן המסועף. איור 3 מציג את הספקטרום של I16 עם יוני האבחון (304 ו -332) המראים את מיקום ההסתעפות. DMOX של חומצות שומן בלתי רווי ישר שרשרת איור 2 מציג חמש פסגות שונות הקשורים 16: חומצת השומן 1. שתי הפסגות הראשונות יש ערכי ECL &lt;16. אנו מסיקים כי המבנה שלהם הוא בהחלט מסועף. הזיהוי של תרכובות אלה מחייב פרשנות של ספקטרה המונית המיוצר על ידי DMOX ונגזרים אסתר picolinyl. שלוש פסגות בעל ECL&gt; 16 התאמה בלתי רוויות ישר שרשרת חומצות שומן. ספקטרה המונית נגזרת DMOX להראות יוני אבחון וזיהוי עמדת הקשר הכפול של תרכובות אלו. באיור 4 ניתן לראות פער של יון 12 האמו בין 196 ל 208 המעידים על נוכחות של הקשר הכפול עם פחמן 8 של N16: 1 Δ <sup&gt; חומצת שומן 8, על פי הכלל האמפירי מיקומו של קשר כפול בשרשרת השומן כפי שהוגדר על ידי ג&#39;אנג 18. כאשר מיקום הקשר הכפול הוא לפני פחמן 7, יוני האבחון שונים. לדוגמא, ג&#39;אנג 18 ופיי 17 ציינו כי עבור FA עם קשר כפול בלתי רווי ב פחמן 5, יון הבת נגזר מחשוף על האג&quot;ח, מ &#39;/ z 152 הכפול, מלווה בתו אי זוגי אינטנסיבי מ / z 153. באיור 5, בנוכחות שבר אינטנסיבי m / z 153 ו של יון מולקולרי m / z 307, מזהה המתחם הזה כמו N16: 1 Δ 5. DMOX ספקטרה picolinyl ההמוני של מסועפות שרשרת מתיל monounsatured חומצות שומן איור 6 מציג ספקטרום של DMOX ונגזרים אסתר picolinyl, המשמש לקביעת המבנה של I16: 1 Δ 9 FA. עמדהסתעפות מותווה על ידי פער של 28 האמו לשני הנגזרים. פער של 12 האמו עבור DMOX ו -26 עבור אסתר picolinyl מזהה את המיקום הקשר הכפול, כפי שמוצג באיור 6. זיהוי של חומצות השומן ויוני אבחון טבלת 1 מציגה את חומצות השומן השונות המזוהות, עם יוני אבחון המקבילים, ב cereus Bacillus ATCC 14,579 גדלו ב 30 מעלות צלזיוס. יוני אבחון אלה לזהות את עמדותיהם של ההסתעפות מתיל קשרים כפולים על שרשרת הפחמן עבור נגזרי אסתר DMOX ו picolinyl, המספקים מידע מבני משלים. שתי הגישות הן באמת משלימות, כמו יוני אבחון לעתים קלים יותר להתבונן עם נגזרי DMOX, ובפעמים אחרות קלים יותר להתבונן עם נגזרי picolinyl. <img alt="איור 1"<html> src = &quot;/ files / ftp_upload / 54,960 / 54960fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1: אסטרטגיה לזיהוי של חומצות שומניות cereus Bacillus. השלבים הרצופים שהניבו מידע על זמני שמירה (ECL), על ספקטרה מונית תהילה, של DMOX, ושל-אסתר picolinyl מוצגים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig2.jpg" /> איור 2: השוואה בין פרופילי chromatographic עבור שוני 16: 1 חומצות שומן זוהו cereus Bacillus. (א) נגזר FAME (יון מולקולרי חילוץ מ &#39;/ z 268); (ב) נגזר DMOX (יון מולקולרי חילוץ מ &#39;/ z 307); (ג) נגזר picolinyl (יון מולקולרי חילוץ מ &#39;/ z 345).Iles / ftp_upload / 54,960 / 54960fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig3.jpg" /> איור 3: ספקטרום המוני נגזר I16 picolinyl שנוצר על ידי יינון אלקטרונים. יונים בבית m / z 151 ו m / z 164 להעיד על נוכחות נגזרת picolinyl של חומצת שומן. היון המולקולרי m / z 347 מזוהה בתור איזומר של חומצה פלמיטית. הנוכחות של פער של 28 האמו בין יון ב m / z 304 ו m / z 332 מעיד על I16. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig4.jpg" /> איור 4: N16: 1 Δ 8 DMOX ספקטרום המוני נגזר שנוצר על ידי אלקטרונים<html> יינון. יון ב m / z 126 מציין נגזרת DMOX, m / z 307 הוא יון המולקולרי של 16: 1 DMOX ואת הנוכחות של פער של 12 האמו בין יונים בבית m / z 196 ו m / z 208 מזהה את המיקום של קשר כפול על פחמן 8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig5.jpg" /> איור 5: N16: 1 Δ 5 DMOX ספקטרום המוני נגזר שנוצר על ידי יינון אלקטרונים. יון ב m / z 126 מעיד על נגזרת DMOX ו- m / z 307 הוא יון המולקולרי של 16: 1 DMOX. מ &#39;העז / z 153 יון הוא מאפיין של קשר כפול ממוקם על פחמן 5. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ילדה = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54960/54960fig6.jpg" /> איור 6: DMOX (למעלה) picolinyl (למטה) השוואה של I16: 1Δ 9 ספקטרה. בשני המקרים הפער של 28 האמו לציין את המיקום של הסתעפות מתיל. מיקום הקשר הכפול ניתן שפיק פער של 12 האמו ו -26 האמו נגזרי DMOX ו picolinyl, בהתאמה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54960/54960fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תרכובות המשוערת </td><td> יון מולקולרי (m / z) FAME; DMOX; picolinyl </td><td> RT </td><td> ECL </td><td> זיהוי שאושר </td><td> יוני אבחון DMOX </td><td> picolinyl יוני אבחון </td></tr><tr><td> I12 </td><td> 214; 253; 291 </td><td>7.93 </td><td> אין כל התייחסות </td><td> I12 </td><td></td><td> [276 (15); 262 (0); 248 (15)] mb </td></tr><tr><td> n12 </td><td> 214; 253; 291 </td><td> 8.21 </td><td> 12.00 </td><td> n12 </td><td></td><td> [276 (10); 262 (20); 248 (20)] mb </td></tr><tr><td> i13 </td><td> 228; 267; 305 </td><td> 8.53 </td><td> 12.5 </td><td> i13 </td><td></td><td> [290 (15); 276 (0); 262 (48)] mb </td></tr><tr><td> a13 </td><td> 228; 267; 305 </td><td> 8.64 </td><td> 12.67 </td><td> a13 </td><td></td><td> [276 (48); 262 (0); 248 (65)] mb </td></tr><tr><td> i14 </td><td> 242; 281; 319 </td><td> 9.24 </td><td> 13.52 </td><td> i14 </td><td></td><td> [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb </td></tr><tr><td> N14 </td><td> 242; 281; 319 </td><td> 9.60 </td><td> 14.00 </td><td> N14 </td><td></td><td> [304 (7); 290 (17); 276 (17)] mb </td></tr><tr><td> I15 </td><td> 256; 295; 333 </td><td> 10.06 </td><td> 14.51 </td><td> I15 </td><td></td><td> [318 (20); 314 (0); 290 (50)] mb </td></tr><tr><td> A15 </td><td> 256; 295; 333 </td><td> 10.19 </td><td> 14.66 </td><td> A15 </td><td></td><td> [304 (30); 290 (TR); 276 (62)] mb </td></tr><tr><td> N15 </td><td> 256; 295; 333 </td><td> 10.49 </td><td> 15.00 </td><td> N15 </td><td></td><td> [318 (5); 304 (13); 290 (18)] mb </td></tr><tr><td> I16 </td><td> 270; 309; 347 </td><td> 11.04 </td><td> 15.5 </td><td> I16 </td><td></td><td> [332 (18); 318 (TR); 304 (42)] mb </td></tr><tr><td> מתיל מסועף 16: 1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 11.19 </td><td> 15.64 </td><td> I16: 1Δ 5 </td><td> [152 (2); 153 (10)] db [292 (3); 278 (TR); 264 (2)] mb </td><td></td></tr><tr><td> מתיל מסועף 16: 1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td>11.40 </td><td> 15.83 </td><td> I16: 1 Δ 9 </td><td> [210 (3); 222 (3)] db [292 (12); 278 (TR); 264 (40)] mb </td><td></td></tr><tr><td> N16 </td><td> 270; 309; 347 </td><td> 11.59 </td><td> 16.00 </td><td> N16 </td><td></td><td> [332 (5); 318 (15); 304 (15)] mb </td></tr><tr><td> 16: 1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 11.78 </td><td> 16.14 </td><td> N16: 1 Δ 5 </td><td> [152 (2); 153 (10)] db </td><td></td></tr><tr><td> 16: 1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 11.94 </td><td> 16.24 </td><td> N16: 1 Δ 8 </td><td> [196 (5); 208 (3)] db </td><td></td></tr><tr><td> 16: 1 </td><td> 268; 307; 345 </td><td> 12.00 </td><td> 16.31 </td><td> N16: 1Δ 9 </td><td> [210 (3); 222 (3)] Db </td><td></td></tr><tr><td> 16: 2 </td><td> 266; 305; 343 </td><td> 12.18 </td><td> 16.44 </td><td> N16: 2 Δ 5, Δ 9 </td><td> [152 (2); 153 (12)] db [208 (1); 220 (2)] db </td><td></td></tr><tr><td> I17 </td><td> 284; 323; 361 </td><td> 12.25 </td><td> 16.5 </td><td> I17 </td><td></td><td> [346 (20); 332 (TR); 318 (35)] mb </td></tr><tr><td> מתיל מסועף 17: 1 </td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.43 </td><td> 16.64 </td><td> I17: 1Δ 5 </td><td> [152 (2); 153 (10)] db </td><td> [344 (10); 316 (5)] mb </td></tr><tr><td> A17 </td><td> 284; 323; 361 </td><td> 12.47 </td><td> 16.66 </td><td> A17 </td><td></td><td> [332 (30); 318 (0); 304 (52)] mb</td></tr><tr><td> מתיל מסועף 17: 1 </td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.57 </td><td> 16.74 </td><td> I17: 1Δ 8 </td><td> [196 (2); 208 (2)] db </td><td> [344 (10); 316 (5)] mb </td></tr><tr><td> מתיל מסועף 17: 1 </td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.64 </td><td> 16.79 </td><td> I17: 1Δ 9 </td><td> [210 (3); 222 (3)] db </td><td></td></tr><tr><td> מתיל מסועף 17: 1 </td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.70 </td><td> 16.84 </td><td> I17: 1Δ 10 </td><td> [224 (1); 236 (1)] db </td><td></td></tr><tr><td> מתיל מסועף 17: 1 </td><td> 282; 321; 359 </td><td> 12.84 </td><td> 16.94 </td><td> A17: 1Δ 9 </td><td> [210 (3); 222 (4)] db </td><td> [330 (10); 316 (0); (90)] mb </td></tr></tbody></table> טבלה 1: זיהוי של חומצות שומן 14,579 ATCC cereus Bacillus. פעמי שמירה, אורך שרשרת שווה ערך (ECL) ערכים, ויונים מולקולריים עבור אסטרים מתיל חומצות שומן (fames) נראים לעין, יחד עם יונים מולקולריים ויוני אבחוני DMOX ונגזר picolinyl. [] Mb זוג יונים אבחון המעיד על אובדן 28 האמו שמתאים לקטע לפני ואחרי הסתעפות פחמן. [] Db זוג יוני אבחון מעיד על אובדן 12 האמו מתאימים המחשוף של קשר כפול.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus at JoVE.com

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).

זיהוי של חומצות שומן ב<em&gt; Cereus בצילוס</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

identification-of-fatty-acids-in-bacillus-cereus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

9.5K Views.  INRA, Université d'Avignon. We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl). 

Video: Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

חיישן מבוסס-Polyaniline של חומצות גרעין

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis is an obligate pathogen that causes fatal inhalational anthrax. Bacillus cereus is considered a useful model for studying B. anthracis due to its close evolutionary relationship. The gene cluster ba1554 - ba1558 of B. anthracis is highly conserved with the bc1531- bc1535 cluster in B. cereus, as well as with the bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, indicating the critical role of the associated genes in the Bacillus genus. This manuscript describes methods to prepare and characterize a protein product of the first gene (ba1554) from the gene cluster in B. anthracis using a recombinant protein of its ortholog in B. cereus, bc1531.

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis is the obligate pathogen of fatal inhalational anthrax, so studies of its genes and proteins are strictly regulated. An alternative approach is to study orthologous genes. We describe biophysicochemical studies of a B. anthracis ortholog in B. cereus, bc1531, requiring minimal experimental equipment and lacking serious safety concerns.

ביטוי חלבון רקומביננטי, התגבשות, מחקרים ביופיסיקליים של א<em&gt; Bacillus</em&gt; -שמר Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer tissue with minor or no modification, allowing the dietary routing between different trophic levels. However, the FA trophic marker approach is still hampered by the limited knowledge in lipid metabolism of the soil fauna. This study used entirely labelled palmitic acid (13C16:0, 99 atom%) as a tracer in fatty acid metabolism pathways of two widespread soil Collembola, Protaphorura fimata and Heteromurus nitidus. In order to investigate the fate and metabolic modifications of this precursor, a method of isotopologue profiling is presented, performed by mass spectrometry using single ion monitoring. Moreover, the upstream laboratory feeding experiment is described, as well as the extraction and methylation of dominant lipid fractions (neutral lipids, phospholipids) and the related formula and calculations. Isotopologue profiling does not only yield the overall 13C enrichment in fatty acids derived from the 13C labeled precursor but also produces the pattern of isotopologues exceeding the mass of the parent ion (i.e., the FA molecular ion M+) of each labeled FA by one or more mass units (M+1, M+2, M+3, etc.). This knowledge allows conclusions on the ratio of dietary routing of an entirely consumed FA in comparison to de novo biosynthesis. The isotopologue profiling is suggested as a useful tool for evaluation of fatty acid metabolism in soil animals to disentangle trophic interactions.

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

The fatty acid trophic marker approach, i.e., the assimilation of fatty acids as entire molecule and transfer into consumer tissue with no or minor modification, is hampered by knowledge gaps in fatty acid metabolism of small soil invertebrates. Isotopologue profiling is provided as a valuable tool to disentangle trophic interactions.

חומצת שומן 13C איזוטופולוג פרופיל מספק תובנה מטבולי של הגעה צרכנים והעברת פחמן עם מחלות

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

זיהוי של חלבון פונקציונלי אזורים באמצעות חלבון Chimeric בנייה

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled antibodies. It is a multistep process in which the optimization of each step is crucial to obtain the optimum specific signal. Through IHC, the distribution and localization of specific biomarkers can be detected, revealing information on evolutionary conservation. Moreover, IHC allows for the understanding of expression and distribution changes of biomarkers in pathological conditions, such as obesity. IHC, mainly the immunofluorescence technique, can be used in adult zebrafish to detect the organization and distribution of phylogenetically conserved molecules, but a standard IHC protocol is not estasblished. Orexin and endocannabinoid are two highly conserved systems involved in the control of food intake and obesity pathology. Reported here are protocols used to obtain information about orexin peptide (OXA), orexin receptor (OX-2R), and cannabinoid receptor (CB1R) localization and distribution in the gut and brain of normal and diet-induced obese (DIO) adult zebrafish models. Also described are methods for immunoperoxidase and double immunofluorescence, as well as preparation of reagents, fixation, paraffin-embedding, and cryoprotection of zebrafish tissue and preparation for an endogenous activity-blocking step and background counterstaining. The complete set of parameters is obtained from previous IHC experiments, through which we have shown how immunofluorescence can help with the understanding of OXs, OX-2R, and CB1R distribution, localization, and conservation of expression in adult zebrafish tissues. The resulting images with highly specific signal intensity led to the confirmation that zebrafish are suitable animal models for immunohistochemical studies of distribution, localization, and evolutionary conservation of specific biomarkers in physiological and pathological conditions. The protocols presented here are recommended for IHC experiments in adult zebrafish.

Presented here are protocols for immunohistochemical characterization and localization of orexin peptide, orexin receptors, and endocannabinoid receptors in the gut and brains of normal and diet-induced obesity (DIO) adult zebrafish models using immunoperixidase and double immunofluorescence methods.

זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

מחייב סומו ישויות (SUBEs) ככלים עבור העשרה, בידוד, זיהוי, ואפיון של פרוטאום סומו בסרטן הכבד

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...